Alessandra Pontillo.

As inflamassomopatias monogênicas constituem um grupo de distúrbios reumatológicos originados pela desregulação do complexo inflamassoma causadas por mutações ganho-de-função em genes do inflamassoma ou de moléculas que afetam indiretamente a sua ativação. Os protótipos desse grupo de doenças, são a síndrome periódica associada a criopirina (CAPS) e a febre familiar do mediterrâneo (FMF), associadas aos receptores NLRP3 e pirina, respectivamente. Variantes patogênicas em um gene podem se manifestar com expressividade variável e penetrância incompleta, ou ser herdadas de forma recessiva ou dominante, resultando em fenótipos distintos. A apresentação da doença é também definida pelo efeito específico da proteína mutante em um tipo celular particular, tornando o fenótipo resultante potencialmente mais danoso em um tecido do que em outro. Embora o teste genético seja crucial para confirmar o diagnóstico, ele nem sempre é conclusivo e informativo quanto à variabilidade fenotípica, prognóstico e resposta ao tratamento. Em países de média e baixa renda, como o Brasil, o acesso generalizado a esse teste ainda é limitado. Neste projeto, propomos uma abordagem mista de transcriptômica e proteômica funcional para investigar os leucócitos e algumas mutações identificadas em pacientes brasileiros. Dessa forma, buscamos caracterizar as correlações genótipo-fenótipo em casos típicos e atípicos, visando desenvolver ferramentas que aprimorem o diagnóstico e tratamento dessas doenças e, simultaneamente, aprofundem nosso entendimento sobre a regulação do inflamassoma.

A proposta é investigar fatores preditivos na infecção por COVID-19, por análise de polimorfismos genéticos, vias de sinalização, anticorpos protetores. Avaliar doenças inflamatórias crônicas que utilizam medicamentos imunossupressores quanto ao risco à gravidade ao COVID-19

Inflammasome is a cytosolic complex responsible for the release of inflammatory cytokines IL-1ß and IL-18 in response to microbial and/or cellular stress stimuli. Although it plays a central role in the first line of defense and in the induction of inflammation and adaptive immunity, it may also be involved in chronic inflammation and tissue damage and thus contribute to most common diseases in the general population such as cancer, autoimmune, neurological, cardiovascular and metabolic diseases. Specific genetic variants in inflammatory components or regulators have been associated with these diseases as susceptibility/protection factors, emphasizing the contribution of the complex in their pathogenesis, and suggesting the therapeutic use of commercially available inflammatory inhibitors. Recent findings have shown that the intracellular cation channel TORID is a key regulator of inflammasome activation, and its inhibition or absence would optimize a CD8 + T cell mediated immune response, by favoring inflammasome activation. In this project we propose to describe the regulatory function of TORID in the activation of inflammasome, through a genetic approach. Therefore, we will: (1) evaluate the contribution of variants of the TORID gene in the predisposition and / or prognosis of diseases mediated by CD8 + T cells; (2) characterize the impact of TORID variants on inflammatory activation; (3) to verify the effect of BayK8644, a newly described TORID inhibitor, on inflammatory activation in cells of patients with CD8 + T cell mediated diseases. In this way we hope to identify functional genetic variants in the TORID with modulatory effect on the activation of the inflammassoma and relate them with the incidence and/or severity of specific diseases, infectious or sterile.

A imunoterapia baseada em células dendríticas (DCs) constitui uma ferramenta potencial para estimular a resposta imune específica, podendo atuar como um tratamento complementar para indivíduos infectados pelo HIV, em uso de terapia antirretroviral. O uso de DCs polarizantes, capazes de produzir níveis elevados de IL12p70 e induzir uma potente resposta citotóxica é desejável no caso de infecções virais. Neste contexto, nossa proposta é estudar DCs polarizantes aDC1 pulsadas com vírus autólogo inativado para tratamento de indivíduos infectados pelo HIV. Serão incluídos nesse estudo 30 indivíduos que no momento da inclusão ainda não tenham a terapia antirretroviral iniciada e após 6 meses de tratamento sofrerão ou não intervenção, conforme alocação nos braços do estudo: G1) não imunizados e sem interrupção de tratamento antirretroviral; G2) imunizados com aDC1 sem interrupção de tratamento antirretroviral; G3) imunizados com aDC1 com interrupção analítica de tratamento antirretroviral. Após a inclusão, amostras de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) serão coletadas para isolamento e expansão viral e os indivíduos iniciarão a terapia antirretroviral. Será aguardado período de 24 semanas até que a carga viral plasmática tenha se tornado indetectável. Após este período, amostras serão coletadas para a definição dos parâmetros basais e o produto vacinal constituído por aDC1 será inoculado em 3 doses em intervalos quinzenais. Três semanas após a inoculação da última dose da vacina a terapia antirretroviral será interrompida somente nos pacientes do G3 (grupo 3). O seguimento vacinal será realizado nos seis meses subsequentes quando amostras de sangue periférico e biópsias de jejuno serão estudadas com relação a parâmetros de imunoativação, imunogenicidade, estímulo de resposta humoral, expressão gênica para diferentes perfis de resposta imune, perfil virológico e análise de reservatórios virais.

O inflamassoma desempenha um papel central na primeira defesa do organismo a patógenos e/ou dano e medeia a resposta inflamatória através da secreção de IL-1ß e IL-18. Por outro lado um excesso de ativação do complexo e consequentemente exacerbada produção dessas citocinas esta relacionada tanto ao desenvolvimento de doenças inflamatórias monogênicas raras (síndromes auto-inflamatórias) quanto a doenças multifatoriais (doenças autoimunes, câncer, doenças metabólicas, entre outras), enfatizando que mecanismos inflamatórios representam um gatilho importante no desenvolvimento da maioria das patologias comuns na população geral.
	Apesar de ser muito estudado, a maioria das informações que existem sobre o inflamassoma derivam de estudos em modelos experimentais, enquanto pouco se sabe sobre a ação do inflamassoma em humanos. Estudos de associação de polimorfismos em genes do inflamassoma em coortes de pacientes com diferentes doenças multifatoriais revelou o papel de um ou outro inflamassoma na patogênese de doenças especificas, porem existe uma escassez de dados funcionais essenciais para interpretar essas associações e definir o envolvimento de cada inflamassoma na patogênese das doenças. A caraterização do papel do inflamassoma nas diferentes patologias contribuirá para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. 
Além disso, o diagnóstico das doenças auto-inflamatórias poderia se beneficiar de um ensaio laboratorial simples e com custo menor do que o usual sequenciamento de genes candidatos, hoje em dia, não disponibilizado pelo sistema de saúde pública brasileiro. 
	Considerando esses três aspectos (estudos de associação, escassez de ensaios para estudo do inflamassoma em humanos e necessidade de marcadores/teste para auxilio diagnostico), no presente projeto propomo-nos aprofundar a contribuição da genética do inflamassoma na modulação da resposta imunológica e na patogênese e/ou no desenvolvimento de doenças com disregulação da inflamação através de estudos de associação em doenças multifatoriais e padronizando um ensaio in vitro para o estudo do inflamassoma em células primárias humanas como ferramenta para avaliação do complexo em diferentes situações de desafio ou doença. O ensaio permitirá de (a) avaliar os efeitos funcionais de variantes genéticas, (b) confirmar dados obtidos em modelo animal e (c) ser utilizado para pesquisa clínica e translacional.

Obesity is a disease that affects more than 30% of adult population in western countries. One characteristic of obesity is the existence chronic, ?sterile? inflammation, systemically and also locally in key metabolically relevant organs and tissues. Recent findings suggest the multi-protein complex known as the inflammasome plays a key role in regulating tissue inflammation during obesity and metabolic syndrome. The inflammasome is composed by Caspase 1, NLRPs and ASC. Activated inflammasomes polymerize, promoting the proteolytical maturation and secretion of the inflammatory cytokines IL-1beta and IL-18. Recently, we and others have shown that the intracellular cation channel TORID is a novel and emerging key regulator of immune responses. Our unpublished data strongly suggest that TORID is a novel inhibitor of inflammasome activation in vitro and in vivo. Interestingly, TORID KO mice under high fat diet displayed increased weight, and insulin resistance as compared to WT ones. We therefore propose to to characterize the immunoregulatory ion channel TORID as a novel molecular target to control inflammasome activation and chronic inflammation in obesity. To carry out this objective we will: 1) To study the role played by TORID in obesity-induced inflammation and metabolic syndrome in mice. 2) To characterize the mechanisms by which TORID regulates inflammasome activation. 3) To evaluate inflammasome gene SNPs contribution in the development of obesity and obesity-related metabolic disorders in humans. We expect to determine that TORID is a novel target to control obesity-induced inflammation relevant in human biology.

As células mortas em decorrência do dano tecidual são rapidamente fagocitadas, mas antes de desaparecerem, alertam as células ao redor para que sejam ativados os programas de reparo. O reconhecimento pelo sistema imune inato do dano celular contribui para o desenvolvimento de processos inflamatórios e respostas imunes de reparo tecidual, mas também pode determinar o agravamento das lesões nos tecidos danificados. Em alguns casos, a morte celular descontrolada pode desencadear um processo destrutivo em cascata que acaba por amplificar as lesões teciduais e piorar o prognóstico da doença. O objetivo geral deste projeto é caracterizar os receptores de sinais de dano celular que estão envolvidos na progressão das formas graves de malária e tuberculose experimentais, visando interferir nestas vias de sinalização a fim de melhorar o prognóstico das doenças. Estas doenças infecciosas encontram-se entre as mais prevalentes na espécie humana, sendo conjuntamente responsáveis por mais de 1 milhão de mortes anuais mundialmente. Pretende-se ainda avaliar a importância dos sinais de dano no desenvolvimento da resposta imune adquirida durante estas doenças infecciosas. Este estudo pode trazer um conhecimento essencial para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que possam ser aplicadas, em conjunto com aquelas já utilizadas, no tratamento das formas graves de malária e tuberculose, assim como de outras doenças infecciosas ou não que se caracterizam por lesões teciduais extensas. Além disso, este estudo pode desvendar novos mecanismos moleculares envolvidos no reconhecimento de dano celular e, consequentemente, ampliar a compreensão e as perspectivas de intervenção relativas a esses processos.

A imunoterapia baseada em células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) constitui uma estratégia promissora para o tratamento de indivíduos infectados pelo HIV. Devido à sua notória plasticidade, populações heterogêneas de MoDCs podem ser obtidas in vitro, dependendo das condições da cultura. Conseqüentemente, pode variar a capacidade destas células em secretar citocinas e expressar moléculas que participam do processo de apresentação antigênica (MHC, moléculas de adesão e co-estimuladoras), interferindo no perfil e eficácia da resposta imune. Atualmente está em andamento em nosso laboratório um protocolo clínico de vacinação terapêutica para o tratamento de indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, sem uso de terapia anti-retroviral. Deste modo torna-se oportuna uma investigação mais aprofundada sobre as caracterísitcas das DCs inoculadas nos indivíduos incluídos no estudo. Tal fato oferece a rara oportunidade de correlacionar aspectos fenotípicos e funcionais das MoDCs com uma resposta in vivo. Neste contexto, o objetivo deste estudo é caracterizar MoDCs de indivíduos infectados pelo HIV utilizadas na imunoterapia com relação a aspectos fenotípicos e funcionais e correlacionar com a resposta à vacinação. Para tal as MoDCs serão investigadas com relação ao perfil de expressão de moléculas de superfície através de citometria de fluxo, perfil de citocinas produzido através de citometria intracelular, capacidade fagocítica através da avaliação de internalização de partículas de dextran, habilidade migratória através de ensaio de quimiotaxia em câmara de transwell, e capacidade em induzir resposta específica in vitro, através da avaliação de produção de citocinas por linfócitos autólogos estimulados pelas MoDCs. Os resultados obtidos poderão fornecer evidências sobre as características de MoDCs que poderiam promover uma melhor resposta pós-vacinal, abrindo caminho para o aperfeiçoamento da vacina terapêutica

A susceptibilidade e a evolução da infecção pelo HIV-1 são fenômenos complexos que são o resultado da interação de fatores ambientais, entre outros o genoma do HIV-1, e as informações genéticas do hospedeiro. Enquanto muita atenção tem sido colocada no elucidar o impacto do genoma viral na propagação do HIV-1 e no desenvolvimento de uma vacina contra o HIV-1, muito menos se sabe do impacto de fatores do hospedeiro. Polimorfismos em genes da resposta imune foram associados com a susceptibilidade a infecção pelo HIV-1 e/ou com a progressão a AIDS (i.e.: CCR5, CCL3L1, DC-SIGN, HLA-I, APOBEC3, TRIM5, MBL2, DEFB1, NLRP3). Além disso alguns autores propuseram que estas mesmas variações genéticas poderiam estar associadas também a uma resposta diferencial a uma vacina ante-HIV-1 e que a determinação da frequências destes alelos/genótipos de risco poderiam ser utilizados para avaliar a eficácia de uma vacina numa população.
Recentemente, uma nova linha de tratamento contra o HIV-1 utilizando células dendríticas (DC) autólogas mostrou resultados bastante interessantes na sua primeira fase: 8 de 18 pacientes infectados pelo HIV-1, não tratados, vacinados com células dendríticas autólogas primadas com HIV-1 autólogo inativado mostraram uma declaração na progressão da doença com diminuição da carga viral e estabilização dos níveis de linfócitos T CD4+. Num trabalho conjunto entre o Laboratório de Variabilidade Genética Humana da UFPE e o nosso laboratório, os pacientes foram genotipados para 768 polimorfismos de singula base (SNPs) distribuídos em 146 genes da resposta imune: alguns polimorfismos em genes da imunidade inata (entre os outros MBL2, NOS1) se mostraram associados a uma melhor resposta à vacina terapêutica. 
Apesar de ter analisados muitos genes possivelmente relacionados com a resposta do hospedeiro a vacina, este trabalho não tinha incluído uma serie de genes e polimorfismos que estão associados a susceptibilidade a infecção pelo HIV-1 e/ou a progressão para AIDS. Uma ?baixa? susceptibilidade a infecção pelo HIV-1 ou uma progressão lenta para AIDS dependem em parte da o genoma do hospedeiro e podem afetar a resposta a vacina. Como os pacientes HIV+ submetidos a primeira fase da vacina foram escolhidos para ser não tratados com antirretrovirais, eram possivelmente indivíduos que conseguiam controlar a carga viral também se apenas temporariamente. Então é possível que entre estes indivíduos alguns tinham um genoma pouco ?permissivo? para HIV-1. Uma possível explicação da resposta a vacina de alguns pacientes HIV+ seria ter variações genética pouco ?permissivas? pela infecção/progressão a AIDS.
Esta variável, que pode afetar a resposta do hospedeiro, não foi avaliada no contexto da vacina com DC, e ate agora não temos nenhuma noticias sobre este tipo de caracterização genética de indivíduos submetidos a trials clínicos de vacina contra HIV-1. 
Atualmente, a segunda etapa do imunotratamento com células dendríticas (ensaio clinico de fase 2) esta sendo desenvolvida no laboratório LIM-56 da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo pelo nosso grupo de pesquisa. Este estudo investigará vários aspectos do tratamento com o objetivo de tentar responder algumas questões em aberto sobre a utilização da vacina. Em particular, uma de especial interesse é compreender o porquê na primeira fase do trial alguns pacientes responderem melhor que outros ao tratamento, e quais fatores podem influenciar o resultado da terapia.
Objetivo deste projeto é determinar o perfil genético de susceptibilidade/progressão a AIDS dos pacientes HIV+ incluídos nas duas etapas do imunotratamento (fase 1, concluída em 2004; fase 2, em andamento) e relaciona-lo com a resposta a vacina. Deste modo o presente projeto pretende definir marcadores genéticos que possam ser utilizados para um imunotratamento "individualizado" e para melhorar o desenho de novas vaci

Estudos demonstram que a progressão do melanoma está intimamente relacionada a um microambiente inflamatório. Neste sentido a citocina IL-1ß constitui um importante mediador pró-inflamatório capaz de coordenar a expressão de outras citocinas e quimiocinas, além de mediar o recrutamento de células ao local de injúria. Por sua vez, tanto a maturação da IL-1ß quanto sua secreção é controlada por um complexo molecular citoplasmático denominado inflamassoma. Os inflamassomas são expressos principalmente em células da imunidade inata, dentre as quais as células dendríticas (DCs). DCs desempenham um papel fundamental no direcionamento da resposta imune específica que depende tanto das características das DCs quanto do microambiente em que ocorre a apresentação antigênica. Neste contexto, o presente projeto tem como objetivo analisar o complexo inflamassoma no impacto da resposta imune através da sua expressão em células dendríticas derivadas de monócitos e em lesões de pacientes em grau metastásico. Também serão investigados fatores genéticos de susceptibilidade através da análise de polimorfismos para genes do inflamassoma. Espera-se que os resultados advindos deste projeto possam trazer informações no que diz respeito aos mecanismos patogenéticos do melanoma, bem como fornecer elementos para possíveis alvos terapêuticos.

The emergence of HIV and its synergistic association
with tuberculosis (TB) pose a great challenge to the health
systems in developing countries. TB is the most lifethreatening
opportunistic infection among HIV patients.
Variability in the clinical outcomes of individuals
coinfected with HIV-1 and TB is determined by multiple
factors, like host genetic variations. Development of TB in HIV
+ patients is influenced by HLA and other genetic variants that
play an important role in innate and adaptive immunity.1
Within host innate immune strategies, many studies have
now unveiled the crucial role of inflammasomes in different
microbial infections. Inflammasomes are molecular platforms
that are assembled by hetero-oligomerization of an innate
immune receptor, an adaptor protein ASC, and the effector
enzyme caspase-1, which leads to the cleavage of pro-interleukin
(IL)-1ß into biologically active IL-1ß. Each kind of receptor
(NLRP1, NLRP3, NLRC4, and AIM2) could recognize different
pathogen-associated molecular patterns inducing the assembling
of inflammasome, the activation of caspase-1, and finally
the secretion of the proinflammatory cytokine IL-1ß. Several
proteins have been described as negative regulators of inflammasome
and IL-1ß secretion, such as CARD8, HSP90, and
IL-1 receptor.2,3 Dysregulation of inflammasome has been associated
with susceptibility to microbial infection, as reported for
knockout animal models2,3 and in human association studies.4
Critical role for NLRP3 inflammasome has also been described
during Mycobacterium spp. infection in mice,5?8 whereas, nowadays,
limited knowledge is available about the effect of
inflammasome dysregulation on TB in humans.
Recently, our research group demonstrated that variants
in NLRP3 inflammasome contribute to HIV-1 susceptibility.
9,10 The present study investigates the possible association
between selected variants in inflammasome genes and HIV-1
and Mycobacterium tuberculosis (HIV+TB+) coinfection in
a case/control cohort of Brazilian individual

A família NLRP/NALP inclui 14 proteínas envolvidas em vias de sinalização celular relacionadas com a resposta inflamatória e com a morte celular induzida por patógeno.
A função principal dessas moléculas na imunidade é evidenciada pelo envolvimento em patologias humanas. NLRP3/NALP3 estão mudados em dois grupos de síndromes auto-inflamatórias raras, enquanto polimorfismos nos genes NLRP1/NALP1 estão associados com diferentes doenças auto-imunes, como vitiligo, diabetes e dermatite atópica.
O presente projeto propõe que variações nos genes NLRP/NALP podem contribuir para uma predisposição genética a desordens auto-imunes devido ao papel chave na imunidade inata, e na ligação com a imunidade adquirida que esses genes apresentam. Nossos estudos preliminares confirmaram esta idéia, sugerindo uma implicação de uma variante comum do gene NLRP3/NALP3 na susceptibilidade à doença celíaca e a diabetes de tipo 1.
O objetivo desse projeto é estudar o papel dos genes NLRP/NALP na susceptibilidade a desordens multifatoriais auto-imunes na população brasileira através da genotipagem do gene NLRP/NALP em indivíduos afetados. Alterações nesses genes poderiam conferir uma base genética pró-inflamatória constitutiva, permitindo a perda de auto-tolerância pelo sistema imune adquirido, e a incapacidade de concluir a inflamação no modo correto.

A imunidade inata está intrinsecamente envolvida tanto no reconhecimento do HIV-1 quanto na resposta contra o vírus. Além disso, diversos fatores do sistema imune inato estão envolvidos na maturação e ativação das células dendríticas (DCs). 
Recentemente, nosso grupo de pesquisa, publicou um estudo inovador sobre a associação entre genes da imunidade inata com os tipos de respostas promovidas pela vacina terapêutica baseada no uso de DCs autólogas pulsadas com o HIV-1 autólogo de 18 pacientes vacinados na fase I do ensaio clínico da vacina. Estes resultados ainda que preliminares devido ao pequeno número de indivíduos vacinados (n=18), mostram como alguns genes da imunidade inata estão envolvidos em uma resposta mais eficaz à vacina.
Neste contexto o presente projeto pretende investigar um painel de genes da imunidade inata em 25 indivíduos infectados pelo HIV-1 a serem vacinados na fase II do ensaio clínico que será desenvolvida no Laboratório de Investigação Médica (LIM) ? 56, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP).
O perfil imunogenético dos pacientes será comparado com os resultados obtidos na primeira fase da vacina com o intuito de avaliar e confirmar alguns marcadores de resposta à vacina.

La mevalonato chinasi deficienza (MKD) è una malattia rara in cui mutazioni a carico del gene MVK sono associate ad una ridotta o pressoché nulla attività enzimatica residua della mevalonato chinasi (MK), enzima coinvolto nella via biosintetica degli isoprenoidi e del colesterolo (nota anche come via del mevalonato). La patologia si manifesta come una sindrome autoinfiammatoria (episodi febbrili ricorrenti accompagnati da linfadenopatia, coinvolgimento addominale e articolare, talvolta cutaneo), e nei casi più gravi anche con ritardo psicomotorio. Nonostante il difetto genetico sia noto da una decina di anni, non è chiaro il collegamento biologico tra la disfunzione alla via metabolica del mevalonato e il quadro clinico della patologia, in particolare l?infiammazione ricorrente.
Gli scopi principali della nostra attività di ricerca si possono così riassumere: 
- raccogliere e caratterizzare i pazienti affetti da MKD al fine di migliorare le informazioni utili ad una diagnosi precoce 
- approfondire la conoscenza sulla patogenesi della MKD mediante l?utilizzo di modelli animali e cellulari della MKD
-	testare nuovi approcci terapeutici per questa malattia orfana su tali modelli ?in vivo? e ?in vitro?