Alexandre Bruni Cardoso.

A proliferação é um dos atributos mais conservados e fundamentais de um sistema vivo. Contudo, emseres vivos multicelulares complexos tais como mamíferos - a grande maioria das células permanecequiescente mesmo com abundância (macro)ambiental de recursos e nutrientes. Esse processo éessencial para a manutenção da função dos tecidos e homeostase, uma vez que a perda patológica daregulação da quiescência está relacionada a todas as etapas da carcinogênese desde a hiperplasiamaligna ao escape da dormência e metástase. Em organismos complexos, é provável que sinaisoriundos dos arredores da célula do microambiente desencadeiem e sustentem o estado quiescenteno qual as células permanecem durante grande parte da vida. Poucos estudos têm como foco aregulação da quiescência e a grande maioria deles envolve a análise de grandes populações de célulassubmetidas a métodos tóxicos, estressantes e não fisiológicos para sincronização das células em fasesespecíficas do ciclo celular. Estas estratégias, além de inserirem artefatos inerentes à técnica desincronização, mascaram eventos discretos em grupos de células relativamente raros dentro de umapopulação heterogênea. Para buscar elucidar os mecanismos moleculares que permeiam o processo deaquisição e manutenção da quiescência e diferenciação celular, nós propomos: i) identificar genesenvolvidos na aquisição da quiescência e na diferenciação funcional no contexto da matriz extracelular(MEC) com o uso de uma biblioteca genome-wide de CRISPR/CAS9; ii) analisar a dinâmica datransição proliferação-quiescência (e vice-versa) em células normais e malignas em resposta à MEC aonível de célula única através de microscopia de fluorescência time-lapse e iii) avaliar aspectosfuncionais e da relevância clínica de uma nova isoforma STK3/MST2, uma quinase core da viaHippo/Yap. Através desta abordagem, pretendemos obter detalhes de mecanismos moleculares e dadinâmica do ciclo celular dentro de populações heterogêneas em contextos fisiologicamente relevantes.Ainda, este projeto tem o potencial de identificar o momento no qual células normais e malignasdivergem quanto à decisão sobre ciclar ou permanecer quiescente.

O ciclo celular é tradicionalmente estudado por meio da sincronização das células em fases específicas do ciclo e por bulk biochemistry de células cultivadas como monocamadas bidimensionais. Entretanto, a proliferação celular numa população de células raramente é sincronizada e ocorre em microambientes tridimensionais dentro de organismos. O desenvolvimento de sondas fluorescentes para o estudo do ciclo celular e da microscopia 4D de alta velocidade tem superado estes obstáculos, permitindo videomicroscopia de longa duração de células assíncronas e ao nível de célula única em contextos fisiológicos. O trato gastrointestinal translúcido da larva do zebrafish, especialmente o sistema nervoso entérico (ENS) em desenvolvimento, é um excelente modelo para estudar a dinâmica do ciclo celular das células in vivo. O ENS é a maior e mais complexa porção do sistema nervoso periférico e é essencial para a função gastrointestinal. Anormalidades do desenvolvimento do ENS, como a Doença de Hirschsprung (HSCR), resultam em constipação crônica grave. Muitos estudos de HSCR reportaram expressão anormal de componentes de matriz extracelular (ECM). Apesar de pesquisas recentes terem revelado os principais fatores de transcrição e vias de sinalização que regulam o desenvolvimento da ENS, ainda não temos uma descrição do estado proliferativo das células progenitoras neurais entéricas (ENPs) enquanto migram ancoradas à ECM. Os objetivos específicos desta proposta são 1. analisar a dinâmica do ciclo celular, ao nível de célula única, de células ENP à medida que migram para dentro e ao longo do intestino do zebrafish em desenvolvimento e 2. investigar se a dinâmica do ciclo celular das células ENP migratórias está associado a mudanças na deposição e organização do colágeno e da laminina. A conclusão desses objetivos aumentará a nossa compreensão básica do desenvolvimento do ENS, com potencial para fundamentar estudos translacionais.

The general goal of this proposal is to generate zebrafish transgenic lines expressing cell cycle probes in ENP cells and establish imaging analysis pipelines to help answer the question of what regulates the proliferative dynamics of ENP cells as they migrate into and

A via Hippo apresenta papel central na regulação da proliferação celular, apoptose, mecanotransdução de sinais, controle do tamanho de órgãos e na tumorigênese. Em mamíferos, Hippo consiste fundamentalmente de 4 quinases do tipo serina-treonina: Mammalian Ste-20-like Kinase 1/2 (MST1, MST2) e large tumor supressor 1/2 (LATS1, LATS2). A ativação de Hippo culmina na fosforilação, retenção citoplasmática e inativação dos coativadores de transcrição YAP e TAZ. Quando Hippo está inativo, YAP/TAZ desfosforilados entram no núcleo resultando em aumento da proliferação e progressão maligna de células epiteliais. No entanto, sabe-se muito pouco da regulação da proteostase das quinases Hippo e a sua contribuição para a tumorigênese mamária. Resultados preliminares do nosso laboratório indicam que a concentração de MST2 é regulada por degradação via proteassoma ativada por sinalização do eixo integrina-integrin-linked kinase (ILK) e dependente de SCF²TrCP. Além disso, observamos que células malignas da glândula mamária expressam uma nova variante splicing de STK3/MST2 que é traduzida numa proteína mais susceptível a degradação. Neste projeto, nós propomos dissecar as bases moleculares da degradação de MST2 e de sua nova proteoforma com o uso de ferramentas genéticas, bioquímicas, microscopia e cultura de células em 2D e 3D. A conclusão deste estudo tem o potencial revelar aspectos chave da regulação da via Hippo e seu papel no câncer de mama

Most cells of our bodies are found in a reversible state of quiescence. That is, most cells are not engaged in any proliferation activity, such as cycling or dividing. But unlike microorganisms that stop dividing mainly because of lack of nutrients, cells in multicellular organisms become quiescent even when nutrients and growth factors are abundant. Quiescence is an essential attribute of cell identity. Uncontrolled proliferation due to loss of quiescence combined with disruption of tissue form are crucial hallmarks of cancer. However, some organs rarely develop cancer and quiescence regulation is infrequently disrupted. This proposal is designed to address the questions: what regulates quiescence in complex organisms and why is quiescence regulation bypassed in several organs, but in some organs cancer seldom arises? We work with the hypothesis that endogenous signals from the tissue microenvironment, such as those produced by the extracellular matrix (ECM) and the tissue form (architecture), play major roles in inhibiting cell proliferation. Our data show that the basement membrane (BM), a specialized ECM component of epithelia and other tissues, inhibits cell proliferation. However, we do not have yet a systemic view of the molecular mechanisms mediating ECM-induced quiescence. We propose to use a forward genetic screen strategy based on a CRISPR/Cas9 pooled library to discover candidate genes that regulate quiescence and fluorescent sensors for proliferation-quiescence transition to track at the single-cell level the cellular dynamics as cells halt proliferating. We also plan to establish a robust model to investigate why some tissues rarely develop tumors. The conclusion of these studies may shed light on the molecular mechanisms conveying regulation of quiescence, and may bring relevant information to understand cancer initiation.

O comportamento das células e a homeostase tecidual não são apenas reguladas por sinais químicos solúveis. Fatores microambientais como o arranjo da matriz extracelular (MEC), a geometria tecidual e forças mecânicas são fontes de sinais capazes de determinar o destino de uma célula. A via Hippo-YAP (Hippo é uma cascata de quinases que inativa YAP, um co-ativador de transcrição) regula o crescimento e o tamanho de órgãos e também age em células tronco mesenquimais como um ?sensor? de sinais mecânicos do microambiente. Uma análise bioinformática de transcriptomas indica que genes regulados por YAP são diferencialmente expressados durante o desenvolvimento da glândula mamária e a progressão do câncer de mama. Resultados preliminares sugerem que a laminina-111 (LN1), uma proteína da MEC que induz a diferenciação funcional do epitélio mamário, reduz YAP nuclear em células não-malignas. Portanto, a hipótese desse projeto é que Hippo-YAP possa estar envolvido no crescimento controlado e quiescência da glândula mamária, que a LN1 e a viscosidade do microambiente controle a atividade da via na glândula e que estes processos estejam desregulados no câncer de mama. Serão utilizados ensaios fisiologicamente relevantes de cultura 3D que mimetizam a ramificação do epitélio mamário e a progressão do câncer mama em conjunto com técnicas de biologia molecular, bioquímica, bioinformática e microscopia. A expectativa é que a conclusão desse projeto esclarecerá aspectos da regulação da proliferação e invasão celular que são características fundamentais da progressão do câncer, e que essas informações poderão ser utilizadas para o aprimoramento de técnicas de diagnóstico, prognóstico e tratamento da doença.

O comportamento das células no desenvolvimento, homeostase e doenças não é apenas regulado por fatores químicos solúveis. Fatores microambientais como o arranjo da matriz extracelular (MEC), a geometria tecidual e forças mecânicas são fontes de sinais capazes de determinar o destino de uma célula. Entretanto, pouco se sabe dos detalhes de como esses sinais são integrados dentro da célula, chegam ao núcleo e influenciam programas de expressão gênica. Nesse contexto, Hippo-YAP parece ser um excelente candidato à via que conecta sinais extracelulares com o núcleo. Hippo é uma cascata de quinases cuja atividade fosforila e inativa YAP, um co-ativador de transcrição que regula a proliferação celular, o crescimento e o tamanho de órgãos e também age em células tronco mesenquimais como um ?sensor nuclear? de sinais mecânicos do microambiente. Uma análise bioinformática de um transcriptoma, que comparou o perfil gênico dos terminal end buds (TEB- estruturas epiteliais em crescimento/invasão) com ductos epiteliais quiescentes, indica que genes regulados por YAP são diferencialmente expressados durante a morfogênese da glândula mamária. Portanto, a hipótese desse projeto é que Hippo-YAP possa estar envolvido no crescimento/invasão da glândula mamária e que as propriedades bioquímicas e físicas da matriz extracelular possam regular a atividade da via. Para explorar essa hipótese, proteínas críticas da via e alguns genes alvo de YAP serão avaliados no desenvolvimento da glândula mamária de camundongas. Serão utilizados também, ensaios fisiologicamente relevantes de cultura tridimensional (3D) que mimetizam ramificação e invasão do epitélio mamário em conjunto com técnicas de biologia molecular, bioquímica e microscopia quantitativa. A expectativa é que a conclusão desse projeto esclarecerá aspectos da regulação da proliferação e invasão celular que são características fundamentais não somente do desenvolvimento normal da glândula mamária mas também da progressão do câncer.

Cell quiescence is a a central aspect of tissue specifity and its loss is one of the important steps in cancer progression. We have shown that signals from the extracellular matrix (ECM), in particular from laminin-111, a basement membrane protein, inhibit cell growth and induce functional differentiation in mammary gland epithelium. Breast cancer cells do not respond to these signals. We propose to answer the following questions of how normal breast tissues become quiescent via cues from the ECM and how the cancer cells break this constrain and grow without control and how this information could be used in prognosis and treatment of breast cancer. Recently, we showed that mammary epithelial cell quiescence induced by laminin-111 (LN1) treatment is preceded by a dramatic decrease in the levels of nuclear β-actin (N-actin). The loss of N-actin causes impairment of RNA Polymerase II (Pol II) binding to transcription sites and inhibits cell growth. However, using actin constructs that do not exit the nucleus upon LN1 addition, prevents the inhibitory effects on transcription and quiescence. Therefore, I will test the hypothesis that the inability of breast cancer cells to respond to growth-inhibitory signals from LN1 is due to the presence and activity of β-actin in the nucleus and that by discovering the pathways involved, we could stop the loss of growth control in breast cancer cells.

O controle do crescimento e da função próstatica é baseado numa complexa rede de interações entre hormônios esteróides e seus receptores e num intrincado mecanismo de interconversão entre eles, além de interações epitélio-estroma mediadas por fatores parácrinos. A próstata ventral de roedores apresenta três fases de crescimento. A segunda delas, que ocorre no período perinatal, é atribuida a um pico de testosterona que ocorre no dia do nascimento. Nesta fase ocorre o crescimento das estruturas epiteliais, a formação do lúmen e tem início o processo de ramificação ductal. Trabalho recente de nosso laboratório têm demonstrado que nessa fase há uma maior expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) 2, 7 e 9 em comparação com adultos (Bruni-Cardoso et al., Histochem Cell Biol. 129:805, 2008). Considerando-se o dinamismo dos diferentes componentes teciduais e da fisiologia prostática no desenvolvimento prostático, o objetivo deste projeto é identificar aspectos do desenvolvimento prostático pós-natal, com enfoque à contribuição da heparanase. Neste sentido serão empregadas cultura organotípica, análises morfológicas, imunohistoquímicas, quantificações em nível de RNAm e de proteína, procurando-se caracterizar também as alterações decorrentes do silenciamento por siRNA do gene da heparanase no desenvolvimento da próstata de ratos in vitro. Iniciação Científica do aluno Guilherme Barbosa de Oliveira.

O controle do crescimento e da função próstatica é baseado numa complexa rede de interações entre hormônios esteróides e seus receptores e num intrincado mecanismo de interconversão entre eles, além de interações epitélio-estroma mediadas por fatores parácrinos. O receptor de andrógeno (AR) e os receptores de estrógenos (ERs) são responsáveis pela mediação dos efeitos fisiológicos dos andrógenos e estrógenos respectivamente. A próstata ventral apresenta três fases de crescimento. A segunda delas, que ocorre no período perinatal, é atribuida a um pico de testosterona que ocorre no dia do nascimento. Nesta fase ocorre a formação do lúmen e das estruturas epiteliais e tem início o processo de ramificação ductal. Trabalhos recentes de nosso laboratório têm demonstrado que nessa fase há uma maior expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) 2, 7 e 9 em comparação com adultos. Há indícios na literatura de que, em células tumorais prostáticas, a expressão de MMP-2 seja regulada positivamente por andrógenos, por intermédio do AR, e de que em células derivadas de fibroblastos ocorra uma diminuição da expressão de MMPs, quando tratados com estrógenos. Considerando-se o dinamismo dos diferentes componentes teciduais e da fisiologia prostática neste processo, o objetivo deste projeto é caracterizar a expressão das MMPs 2 e 9 e dos inibidores TIMP-1 e -2 frente ao tratamento com doses crescentes de andrógeno e estrógeno. Para isto serão empregadas cultura organotípica, análises morfológicas, imunohistoquímicas, em nível de RNAm e de proteína desses componentes, procurando-se caracterizar também as alterações decorrentes do silenciamento por siRNA desses genes no desenvolvimento da próstata de ratos in vitro.