Carlos Alberto Scrideli.

O tumor adrenocortical (TAC) pediátrico é uma neoplasia rara no mundo, mas com uma incidência 10-15 vezes maior no sul e sudeste do Brasil e de prognóstico reservado em casos avançados. Esses tumores possuem uma alta heterogeneidade, e os parâmetros anatomopatológicos utilizados são considerados pouco precisos e até o momento, não é possível estabelecer uma correlação prognóstica bem definida, o que reflete em dificuldades na determinação da progressão da doença e direcionamento do tratamento. Devido à escassez de informações acerca da biologia dos TAC e modelos de estudos que mimetizem esse tumor, principalmente em casos pediátricos, torna-se um desafio a compreensão dos mecanismos moleculares de iniciação/desenvolvimento e progressão destes tumores. Dessa forma, em colaboração com a Harvard Medical School, encontramos o gene TK1 diferencialmente expresso em TAC adulto, pediátrico e camundongo, o produto desse gene está intrinsecamente ligado ao processo de síntese e reparo do DNA, apresentando seu pico na fase S do ciclo celular. Nossos resultados prévios mostram o gene TK1 regulado positivamente em casos de TAC de pior prognóstico, usando banco de dados públicos, em pacientes adultos (TCGA), pediátricos (GSE76019) e camundongos transgênicos (dados cedidos por colaborador, não publico), além disso, a expressão do TK1 está correlacionada com a expressão gênica das ciclina B1 e ciclina B2, marcadores do ciclo celular no ambiente tumoral. Com isso, este projeto visa avaliar a função clinica e funcional do gene TK1 em modelo in vitro e in vivo, a fim de caracterizar e explorar suas funções moleculares e biológicas relacionadas aos mecanismos e progressão tumoral. Além de avaliar possíveis crosstalks deste gene com as vias de desenvolvimento embrionário a fim de fornecer novos insights para prognóstico, diagnóstico e direcionamento clínico

São dois protocolos de colaboração em pesquisa entre a FMRP-USP e Boston Childrens Hospital., Harvard University, EUA. O primeiro projeto envolve camundongos transgênicos e tumorigênese adrenal e o outro sobre mecanismos mediando resistência a imunoterapia em carcinomas adrenocorticais. Os modelos transgênicos correspondem a camundongos aldolase sintetase-Cre obtidos de cruzamento entre indivíduos com mutação do gene TP53 e com mutação do gene CTNNB1 (Beta-catenina). Camundongos com dupla mutação TP53/CTNNB1 desenvolvem tumores adrenais espontâneos a partir do 7 mês de vida em 100 dos casos. Dois os trabalhos envolvendo esses modelos transgênicos estão em andamento, com estudos funcionais de inibição de hubgenes associados à tumorigênese adrenal por drogas e/ou RNA de interferência.

As leucemias linfoides agudas (LLA) e os tumores do sistema nervoso central (SNC) representam o maior grupo de tumores na infância. Apesar dos avanços terapêuticos o prognóstico dos tumores de SNC ainda é reservado, e seguem sendo a principal causa de mortalidade por câncer em crianças. Nas LLA apesar de um melhor prognóstico, 10-15 das crianças recidivam e em 40 dos casos apresentam infiltração do SNC. A quimiorresistência e falhas terapêuticas frequentemente observadas nesses tumores têm sido atribuídas em boa parte à incapacidade dos agentes quimioterápicos convencionais em cruzar a barreira hematoencefálica (BHE) e atingir seus alvos no tecido tumoral. Atualmente têm-se buscado novas abordagens e compostos terapêuticos que efetivamente ultrapassem a BHE e atinjam as células tumorais e levem a maiores taxas de sobrevida em tumores do SNC/LLA, ressaltando assim a importância da identificação de compostos com essas características para os tumores mais agressivos. A metodologia de screening de drogas associada ao HCS (High Content Screening) tem sido amplamente utilizada para avaliar a possível eficácia de combinação de drogas concomitantemente, além de permitir a visualização e acompanhamento de vários fenótipos celulares e localização de proteínas em ensaios pré-clínicos. Dessa forma, a hipótese deste projeto é que novos compostos, que ultrapassam a BHE, apresentem efeitos antitumorais promissores e/ou que sensibilizem as células tumorais aos quimioterápicos convencionais e ofereçam novas oportunidades terapêuticas para pacientes com tumores de SNC e leucemias. Para alcançar essa hipótese, iremos: 1) avaliar o efeito de compostos que ultrapassam a BHE na viabilidade de linhagens celulares de tu SNC e leucemias por meio de um screening de drogas utilizando HCS; 2) Identificar os compostos com efeitos antitumorais mais promissores; 3) Avaliar os efeitos dos compostos mais promissores na migração e invasão celular, por meio do HCS, utilizando essas linhagens; 4) Avaliar os efeitos da combinação de terapias convencionais de tratamento com os compostos selecionados como mais promissores por meio do HCS; 5) Avaliar por RNAseq as potenciais moléculas-alvo alteradas após o tratamento com os compostos mais promissores.Valor total R$ 226.107,66

O INCT BioOncoPed irá integrar e consolidar a comunidade de pesquisa em câncer infantil no Brasil, em colaboração com grupos internacionais de excelência. O INCT irá combinar pesquisa biológica com pesquisa clínica aplicada à melhoria dos protocolos de tratamento existentes e aumento dos índices de cura. Irá agregar além disso aplicações da pesquisa à assistência médica, à inovação e empreendedorismo para gerar novos produtos e serviços qualificados, pela atuação de empresas startup, bem como à atividade de instituições privadas sem fins lucrativos e órgãos de governo que oferecem apoio aos pacientes e suas famílias. Pelo alinhamento de temáticas e de recursos, como a constituição de grandes bancos de tumores compartilhados, a fragmentação da pesquisa nacional na área pode ser reduzida, com ganhos significativos de resultados científicos e clínicos. As estratégias do INCT incluem constituir coleções de tumores, análises genômicas avançadas, sequenciamento, bioinformática, modelos celulares, modelos in vivo, desenho e síntese de novos compostos com potencial terapêutico, avaliações histopatológicas, até ensaios clínicos inovadores tanto para quimioterapia citotóxica quanto de novas terapias alvo brasileiras. O INCT irá promover a transferência de tecnologia para fomentar desenvolvimento no Brasil de novos métodos diagnósticos e terapêuticos e melhoria do atendimento por serviços clínicos e instituições assistenciais. Os temas de pesquisa incluem sinalização celular, biomarcadores prognósticos, programação epigenética e melhoria de protocolos quimioterápicos. As diferentes instituições irão atuar de forma integrada em torno desses temas, e, além disso em formato de integração física e técnica também com equipes de atendimento clínico e suporte às famílias de pacientes, além de atividades educacionais dirigidas à comunidade. As equipes e instituições participantes tem extensa experiência e um histórico de resultados obtidos na área de pesquisa em oncologia pediátrica.Valor total aprovado: RS$ 4.407.499,00.

Atualmente, com o tratamento intensivo multimodal, 20% das crianças e adolescentes com câncer ainda vão a óbito devido à doença e mais de 40% dos sobreviventes desenvolverão sequelas que afetarão a vida adulta desses pacientes. Desta forma, novos tratamentos efetivos e seguros para crianças com câncer são necessários para aumentar a taxa de cura, diminuir os efeitos tóxicos associados com os tratamentos atuais e assim minimizar os riscos de efeitos a longo prazo nos sobreviventes. A biologia das neoplasias pediátricas está intrinsicamente associada com a desregulação das vias de sinalização que controlam o desenvolvimento embrionário normal. Entre estas vias estão a WNT, a SHH, a NOTCH, e TGF-², as quais também desempenham papel importante na carcinogênese e estão envolvidas nos processos de quimio- e radio-resistência tumoral. O estudo destas vias dentro do contexto da biologia das neoplasias pediátricas pode constituir um novo campo na identificação de genes alvos e na compreensão dos efeitos em longo prazo causado pelas diferentes modalidades de tratamento dos tumores infantis. Assim, este projeto tem como objetivo inicial a identificação de redes de coexpressão associadas com módulos transcricionais das vias de desenvolvimento acima citadas em diferentes tumores pediátricos (meduloblastoma, ependimoma, sarcoma de Ewing e carcinoma adrenal). A partir destes dados os genes considerados alvos terapêuticos (aqueles previamente estudados pelo nosso grupo, os que tenham valor terapêutico e/ou prognóstico estabelecido pela literatura científica ou genes que apresentem um valor científico promissor para o tumor estudado) serão validados e posteriormente investigados em modelos in vitro e in vivo através de diferentes técnicas celulares e moleculares. Esta investigação poderá fornecer novas perspectivas moleculares, tanto para elucidar os mecanismos específicos envolvidos na biologia dos tumores pediátricos, quanto para a identificação de novas estratégias terapêuticas para o tratamento deste grupo de pacientes.

O conhecimento crescente sobre os microRNAs (miRNAs) aponta sua elevada importância no controle da expressão gênica, sendo caracterizados como reguladores essenciais em diversos processos biológicos. Alguns miRNAs são atualmente conhecidos por desempenharem funções de oncogenes e supressores tumorais, pelo envolvimento na regulação de genes sabidamente envolvidos com a carcinogênese. O campo de estudo dos miRNAs para o câncer está apenas começando a ser explorado, com grande promessa para terapias e diagnósticos futuros. Recentemente, através de análises de microrranjo identificamos a assinatura destes miRNAs em tumores pediátricos como a leucemia linfóide aguda (LLA) e tumores do sistema nervoso central (SNC ? astrocitomas pilocítico, glioblastomas e meduloblastomas), bem como controles de tecido não neoplásico (substância branca). Avaliamos também o perfil diferencial de expressão destes miRNAs em subgrupos específicos dentro destas neoplasias. A partir destes resultados estamos realizando maiores análises in sílico que sugiram miRNAs diferencialmente expressos potencialmente envolvidos na biologia celular destas neoplasias. Neste projeto estamos propondo testar os miRNAs candidatos em ensaios funcionais e elucidar seu papel na proliferação celular, apoptose, invasão e ensaio de capacidade clonogênica. Acreditamos que os dados gerados a partir do desenvolvimento deste projeto venham contribuir significantemente para o entendimento dos mecanismos de ação dos miRNAs na biologia tumoral. Desvendar os mecanismos de ação desses miRNAs, muitos deles ainda não relacionados com funções conhecidas, permitirá que estes sejam utilizados para diagnóstico/prognóstico ou mesmo como alvos terapêuticos e assim servir de base para o desenvolvimento de novos fármacos.

Glioblastoma é o mais comum e agressivo dos tumores encefálicos primários. Apesar dos avanços tecnológicos no procedimento cirúrgico, seguidos por tratamentos de radio e quimioterapia a média de sobrevida dos pacientes é de 12 a 15 meses. Este tipo de tumor exibe elevada heterogeneidade celular, com alterações genéticas complexas que refletem em alta instabilidade genômica e apresentam implacável progressão maligna, caracterizada por difusão e invasão através do cérebro, resistência aos tradicionais e aos novos alvos terapêuticos e destruição do tecido encefálico normal. Um fator importante para a progressão tumoral é a acidificação do ambiente que é promovida pelas anidrases carbônicas (CAs) 9 e 12, que direcionam para a aquisição de fenótipo metastático e de quimioresistência a drogas anticâncer. Esses processos podem ser revertidos por inibidores específicos de CAs. E7070, uma sulfonamida impermeável à membrana, é uma nova droga para o tratamento de câncer, com potente inibição destas enzimas. Exibe atividade in vitro e in vivo e impede a progressão do ciclo celular em células tumorais. Um melhor entendimento dos complexos mecanismos, moleculares e celulares, que direcionam para a progressão tumoral é importante pré-requisito para a identificação de novas e mais efetivas estratégias terapêuticas, com intuito de melhorar a sobrevida dos pacientes. Desse modo, no presente projeto propomos estudar a expressão e os efeitos in vitro da inibição da via das CAs 9/12 pelo E7070 (isoladamente ou em combinação com os tratamentos atualmente utilizados) na quimioresistência, invasão, proliferação e apoptose de linhagens celulares e células tronco SSEA-1+ submetidas à hipóxia.

Estudos de potenciais alvos terapêuticos e vias biológicas envolvidas no Meduloblastoma O Meduloblastoma é um câncer do sistema nervoso central, altamente invasivo, de origem embrionária, localizado no cerebelo. É o tumor sólido mais frequente em crianças e, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), é classificado como um tumor de grau IV. Atualmente, o tratamento para este tipo de neoplasia consiste em cirurgia, quimioterapia e, dependendo da idade do paciente, radioterapia. Apesar de a sobrevida ser alta (mais de 50%) o tratamento utilizado pode acarretar efeitos adversos a médio e longo prazo. Portanto, estudos que permitam detectar novos alvos terapêuticos são fundamentais para melhorar o tratamento em pacientes, principalmente nos menores de três anos, e diminuir os efeitos adversos causados pelo tratamento desta doença. A proposta deste projeto é estudar potenciais alvos terapêuticos envolvidos com a agressividade do Meduloblastoma, utilizando linhagens celulares e amostras provenientes de pacientes diagnosticados no Hospital das Cínicas de Ribeirão Preto (USP), aplicando drogas específicas e técnicas de inibição da expressão gênica. Além disso, estudos de expressão gênica e a avaliação de diferentes parâmetros celulares como viabilidade, apoptose, ciclo celular e capacidade clonogênica serão realizados para complementar a pesquisa. JUSTIFICATIVA Apesar de ser eficiente, o tratamento atual para meduloblastoma resulta agressivo, podendo deixar sequelas a longo prazo. Já existem relatos de déficit no sistema endócrino, no sistema nervoso e no crescimento, incluindo defeitos neurocognitivos, endócrinopatologias, esterilidade e alto risco de desenvolvimento de gliomas secundários de alto grau. Varias modalidades terapêuticas baseadas em genes individuais ou em vias biológicas responsáveis pelo desenvolvimento do MB estão atualmente sendo testadas, no entanto, os resultados não têm cumprido com as expectativas. Desta forma, a procura por tratamentos direcionado

Diferenças de assinatura de microRNAs (miRs) e estudo funcionais de genes associados ao câncer podem auxiliar no diagnóstico, prognóstico, sugerir funções e/ou participação de importantes vias com potencial de serem utilizadas como futuras terapias alvo para as neoplasias humanas. Este projeto pretende identificar a assinatura de miR em diferentes tumores pediátricos (leucemias linfóides agudas, tumores de sistema nervoso central e tumores adrenocorticais) e avaliar o perfil diferencial de expressão destes miRs em subgrupos específicos dentro destas neoplasias. Além disso, pretende estudar a função de genes que foram identificados em projetos anteriores do grupo, com potencial aplicação como genes candidatos a terapia alvo e possível aplicação em desenhos de protocolos de tratamento, especialmente para subgrupos de doença associadas a prognóstico desfavorável. Serão realizados estudos funcionais através de silenciamento e/ou ativação de expressão de genes, analisados por ensaios de citoxicidade, viabilidade e proliferação celular, apoptose e ciclo celular, incluindo os genes SHOC2 e XPO7 em linhagens celulares de leucemia linfóide aguda, TNFA e AURKB em linhagens de tumores adrenocorticais e genes VEGF e CA12 em linhagens de tumores astrocíticos e meduloblastomas. Até o momento o banco de tumores das instituições participantes conta com mais de 200 amostras de leucemia linfóide aguda, cerca de 60 amostras de tumores adrenocorticais infantis, 15 de adultos, cerca de 50 amostras de meduloblastoma, 50 de astrocitoma pilocítico, 50 de glioblastoma (crianças e adultos) e amostras de controle sem doença neoplásica (medula óssea, adrenal e cérebro).

Diferentes tipos de neoplasias humanas, tanto tumores sólidos como linfomas e leucemias, têm a sua progressão maligna acompanhada por múltiplas alterações cromossômicas numéricas e estruturais. Tem sido demonstrado que diferentes regiões cromossômicas são susceptíveis à instabilidade genômica e geralmente estas se acham associados a genes que contribuem para o processo tumoral. Além disso, a correta identificação de tais aberrações auxilia no diagnóstico, prognóstico, classificação das neoplasias e na decisão de terapia a ser utilizada.

A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais comum na infância e representa uma doença heterogênea em relação à biologia e ao prognóstico. O tratamento é dividido em terapia de indução de remissão, intensificação ou consolidação e manutenção (administração de mercaptopurina e metotrexato). Apesar dos avanços no tratamento cerca de 20% dos pacientes apresentam recaída da doença e/ou óbito indicando a necessidade de terapias diferenciadas para esse grupo. Recentemente, drogas epigenéticas como inibidores de histonas desacetilases (iHDACs) e inibidores de DNA-metiltransferases (iDNMTs) tem mostrado efeitos anti-neoplásicos e resultados promissores para o tratamento de diversos tipos de neoplasias incluindo a LLA. Considerando que parte dos pacientes portadores de LLA apresenta má-resposta ao tratamento quimioterápico, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos de iHDACs (SAHA) e iDNMT (Zebularina) associados à quimioterápicos (mercaptopurina e metotrexato) em linhagens celulares de LLA, como provável terapia adjuvante em leucemias linfóides agudas refratárias ao tratamento convencional.

Avaliar a expressão dos microRNAs: miR-92a, miR-100, miR-125, miR-128a, miR-181b, miR-196b, miR-708 e let-7e em amostras de medula óssea de pacientes portadores de LLA

Análise da expressão dos genes das Aurora quinases A e B, MAD e BUB, Survina, DNA metil transferases em linhagens celulares e cultura primária de glioblastoma

Com os atuais protocolos de tratamento, a expectativa de sobrevida livre de doença em 5 anos para crianças com leucemia linfóides aguda (LLA) têm sido de mais de 70%. Todos os protocolos têm adotado diversos fatores prognóstico pré-tratamento na estratificação dos pacientes em diferentes grupos de risco, como por exemplo, a contagem leucocitária ao diagnóstico, a idade do paciente, anormalidades citogenéticas e imunofenotipagem. A resposta inicial ao tratamento, avaliada pela citoredução na medula óssea e/ou sangue periférico, tem se mostrado um fator prognóstico independente importante que permite identificar pacientes com maior ou menor risco de recaída. Alguns trabalhos têm mostrado que a presença de doença residual mínima (DRM) detectada durante as fases iniciais do tratamento é o mais importante deles. Em vista do acima exposto, o presente projeto visa estabelecer a cooperação entre quatro importantes centros de tratamento de leucemia linfóide aguda pediátrica do estado de São Paulo (Centro Infantil Boldrini, UNIFESP, USP-Ribeirão Preto, USP-São Paulo) para reunir uma amostragem substancial de pacientes e dados suficientes para determinar o valor preditivo da DRM em pacientes tratados pelo protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemias da Infância (GBTLI-99), avaliada através de uma técnica simplificada de reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de rearranjos de genes de imunoglobulina e receptores de células T. Espera-se com isto, que o estudo da DRM possa ser usado nos protocolos futuros como subsidio adicional para a classificação dos pacientes em grupos de risco, na tentativa de melhorar os índices de cura destas crianças.

O uso intensivo e combinado de diferentes quimioterápicos tem permitido a cura de 70-80% das leucemias linfóides agudas (LLA) da infância. De forma geral, o tratamento de crianças com LLA consta de três fases terapêuticas principais: indução, tratamento da leucemia no SNC e quimioterapia de manutenção. A intensidade e uso das drogas é adaptado ao risco de recaída dos pacientes, aferido ao diagnóstico e nas primeiras semanas do tratamento. Embora existam diferenças, os critérios básicos atualmente em voga para estratificação dos pacientes nos grupos de risco são idade e contagem leucocitária. Diversos trabalhos têm mostrado que a resposta inicial ao tratamento, mensurada pela citoredução na medula óssea e/ou sangue periférico, é um fator prognóstico poderoso, independente, que permite identificar pacientes com maior ou menor risco de recaída. Ao mensurar a citoredução, faz-se, indiretamente, uma avaliação in loco, da sensibilidade intrínseca da leucemia à quimioterapia. A proposta central deste projeto é identificar e quantificar a expressão de genes relacionados à resistência/sensibilidade aos quimioterápicos usados na fase de indução, em 180 amostras de crianças com LLA, tratadas segundo o protocolo brasileiro LLA-99, tecendo associações com características ao diagnóstico e a evolução clínica dos pacientes. Pretende-se identificar marcadores moleculares da resistência/sensibilidade às drogas, que subsidiem a alocação dos pacientes nos grupos de risco.

Com o desenvolvimento da biologia molecular, vários estudos na tentativa de se desvendar alterações estruturais e de expressão em genes relacionados às neoplasias têm sido realizados. A relação das histonas, até então vista apenas como a matriz para o enrolamento dos cromossomos, começa a ser traduzida como um componente ativo na carcinogênese, participando na complexa rede de sinalização celular através de alterações pós-translacionais, reguladas por 2 classes de enzimas: as histonas acetil-transferases (HAT) e as histonas deacetilases (HDAC). Nas últimas décadas, os avanços nas taxas de sobrevida global para tumores de sistema nervoso central foram bastante modestos se comparados a outras formas de neoplasia, especialmente para os glioblastomas multiformes, cuja sobrevida média é de apenas cerca de 12 meses. Recentemente a inibição farmacológica de HDAC, tem mostrado atividade anti-tumoral in vitro e in vivo em uma série de tumores malignos. Poucos estudos, no entanto, têm sido realizados em glioblastomas, especialmente relacionados à associação destes inibidores com radioterapia e uso do quimioterápico temozolomida que tem melhorado de forma discreta a sobrevida nestes pacientes. Neste estudo pretende-se avaliar a resposta de células da linhagem de glioblastoma U-343, tratada e não tratadas com o inibidor de HDAC (HDACi), tricosamina (TSA), pós- doses variáveis de radiação ionizante, como também resposta ao tratamento com temozolomida. A resposta será avaliada em tempos diferentes através de ensaio de apoptose por citometria de fluxo, utilizando-se anexina como marcador. Será analisadas também o perfil de expressão gênica de genes associados a apoptose (BCL-2, FASL, CASPASES 3, 8 e 9) e HDAC (1-8, 9a, 9b, 10 e 11), utilizando técnica de PCR quantitativa em tempo real (RQ-PCR), na tentativa de avaliar a relação entre inibição de HDAC e sensibilidade a radioterapia e/ou quimioterapia com temozolomida e sua possível aplicação como tratamento adjuvante em glioblastom

Procura de marcadores moleculares relacionados ao diagnóstico e prognóstico de tumores do sistema nervoso central Este projeto tem como objetivo a descoberta de genes expressos em tumores do sistema nervoso central como marcadores diagnósticos e como fatores preditivos de prognóstico para orientação terapêutica e como alvos para terapia gênica futura. Como objetivos específicos propõe-se realizar a escolha de genes diferencialmente expressos em astrocitomas de diferentes graus de malignidade, meduloblastomas/ PNET em crianças e adultos, oligodendrogliomas sem e perda de heterozigosidade a partir de dados de SAGE e microarray. A expressão gênica será validada por PCR quantitativo em tempo real e o produto gênico estudo em diferentes grupos de tumores. Anticorpo poli e/ou monoclonal será produzido quando não houver disponível comercialmente e serão conduzidos estudos funcionais in vitro e in vivo, em ratos imunossuprimidos. O processo da metilação da região promotora de alguns genes hipoexpressos com função desconhecida será analisado. A questão da radio e quimiorresistência dos astrocitomas malignos será abordado em modelo animal. O estudo caso-controle de polimorfismos seguirá em paralelo utilizando-se o banco de DNA de sangue periférico criado durante o Projeto Genoma Clínico, nos últimos dois anos. Haverá uma ênfase no estudo dos genes envolvidos na invasibilidade e angiogênese tumorais, nos quais se observa um mecanismo comum de degradação da matriz extracelular, permitindo a infiltração destes tumores e dificultando a ressecabilidade completa, o que corrobora para a ineficácia das modalidades terapêuticas de cirurgia, radioterapia e quimioterapia vigentes.