Gerhard Wunderlich.

Todas as espécies de Plasmodium codificam famílias de genes variantes em seu genoma, que possuem diferentes funções e frequentemente são relacionados com evasão imune ou processos patogênicos. Recentes estudos dos últimos anos apontam para uma complexa rede de regulação desses genes em nível transcricional e pós-transcricional. O projeto proposto investe na função de fatores de transcrição putativos específicos semelhantes a plantas em Plasmodium falciparum (PfAP2, apetala 2) e modificadores de cromatina para acessar sua influência na expressão dos genes variantes. Mais especificamente, estamos interessados nos fatores que influenciam na memória epigenética da transcrição de genes var que codificam as proteínas PfEMP1 (fatores de virulência) para elucidar como a memória é estabelecida e mantida. Anteriormente, nós e outros pudemos mostrar que os fatores PfAP2-O e PfAP2-exp participam do enigmático processo de expressão seletiva de determinados membros de genes var. Curiosamente, apesar dos fatores PfAP2-O e PfAP2-exp serem refratários ao knockout, um knockdown parcial (~80) desses não interfere no crescimento in vitro de P. falciparum. No entanto, tanto PfAP2-O quanto PfAP2-exp são críticos para estágios sexuais posteriores, encontrados no mosquito. Propomos perseguir dois objetivos principais: Em nível molecular, vamos elucidar o interatoma desses dois fatores de transcrição da família ApiAP2 usando uma nova abordagem proteômica. Além disso, o papel na transcrição de genes var de duas histona-demetilases (Jumonji-like demethylase 2 e Lysine histone demethylase PfLSD1) e uma metil transferase modificadora de DNA (PfDNMT2) de genes variantes são explorados. Como segundo objetivo, abordaremos o efeito do knockdown temporário na memória da transcrição de genes var dos fatores acima citados incluindo também a exossomo-RNAse PfRrp6 e a helicase PfRecQ01, ambos relacionados a transcrição de genes var. A fim de encontrar papéis dessas enzimas também para as etapas de transmissão, propomos a realização de experimentos de infecção de mosquitos que serão conduzidos com colaboradores da Universidade de Glasgow. Os resultados esperados contribuem para o melhor entendimento de um importante mecanismo de virulência de P. falciparum.

Os parasitas da Malária expressam as proteínas que utilizam em cada fase do ciclo complexo de uma forma estritamente controlada dependendo das condições do ambiente onde e em qual hospedeiro se encontram. O controle de expressão ocorre predominantemente em nível de transcrição embora na hora da mudança de hospedeiro também existe controle pós-transcricional da disponibilização de transcritos para recrutamento aos ribossomos (P-bodies). O controle da transcrição é regido indiretamente por modificações dinâmicas da cromatina e a inibição de modificadores de cromatina pode levar a desequilíbrio e morte do parasita. Nesta proposta pretendemos focar no papel e na importância de modificadores de cromatina em parasitas da fase sanguínea na transcrição de genes variantes de Plasmodium falciparum, agente da mais perigosa forma da malária, também ainda existente no Brasil. No estudo anterior clonamos e produzimos linhagens de parasitas transgênicos que possibilitam o controle de expressão via ribozima de alguns modificadores de cromatina. Introduzindo ainda uma etiqueta hemaglutinina alteramos assim os supostos modificadores que são tanto histona deacetilases (SIR2A) quanto demetilases (Jumonji-like demetilase C1 e C2 e Lysine histona demetilase LSD-1). Modificamos também uma DNA Cytosin metiltransferase, uma Acetil histona transferase (SET2) e uma acetil-CoA sintetase que provavelmente fornece restos acetila para as Acetil-histona transferases. Ainda foram modificados três fatores de transcrição do grupo dos fatores de transcrição ApiAP2, dois dos quais provavelmente envolvidos no controle da transcrição de genes var, que codificam fatores de virulência por serem adesinas que podem desencadear formas graves da malária. Com estas linhagens, elucidaremos os sítios cromossómicos/genes em quais associam os fatores por ChIPseq. Ainda, procuramos também por fatores que interagem com as proteínas por imunoprecipitação e análise em espectrometria de massas de proteínas co-precipitadas. Ainda, analisamos o papel de prováveis (nc)RNAs no direcionamento de modificadores de cromatina no caso de expressão variegada como ocorre com genes var. Os resultados esperados devem contribuir para o entendimento da network de coordenação da transcrição em parasitas da malária da fase sanguínea e possíveis pontos de ataque para novos fármacos.

O parasita da forma mais perigosa da malaria humana, Plasmodium falciparum, possui várias famílias multigênicas cujas proteínas expressas em parte são responsáveis pela virulência desta espécie ou possuem um papel ainda desconhecido. Estas famílias incluem os genes var, os genes rif e a pequena família dos genes surf, além de outros. Todas as famílias têm em comum que as proteínas correspondentes são expressas de forma seletiva e controlada, sendo que no caso dos genes var apenas um gene é ativo enquanto o restante da família está silenciado (exclusão alélica). Dos genes rif, aparentemente um ou alguns alelos parecem ativos em cada fase do ciclo sanguíneo enquanto os demais genes estão silenciados. Já dos dez genes surf, apenas um parece ser transcrito de forma constitutiva. Em experimentos recentes por knockdown da proteína SURFIN expressa, conseguimos mostrar que a diminuição da proteína expressa levou a um aumento significativo do respectivo transcrito. Nesta proposta de projeto propomos elucidar o papel de determinados fatores de transcrição possivelmente associados à expressão de genes var e talvez rif e propomos avaliar fatores (epigenéticos, ncRNAs) que influem a transcrição e o possível feedback da proteína SURF expressa e knocked-down para seu transcrito cognato. O conhecimento sobre o modo de expressão destes fatores de virulência contribui de forma indireta não apenas para o combate de P. falciparum, mas também P. vivax, a espécie mais abundante no Brasil que possuem famílias multigênicas parecidas (salvo genes var).

O projeto tem como objetivo encontrar fatores que regem a variação antigenica de Plasmodium falciparum, especificamente fatores controlando a transcrição/expressão de genes rif, var e surfin, além de genes de familias variantes do modelo murino Plasmodium berghei.

O projeto focaliza no descobrimento de novas drogas e vacinas contra Plasmodium e vetores anofelinos, utilizando compostos da biodiversidade brasileira/amazônica.

Neste projeto abordamos a resposta humoral diferencial de plasmas de pacientes assintomaticos e sintomáticos contra a superficie da hemácia infectada. Para tal usamos isolados selecionados para determinados fenótipos citoaderentes (adesivos em CD36, ICAM1 e CSA) e monitoramos tanto o reconhecimento quanto a capacidade de inibição de citoaderência em plasmas. Outra parte do projeto visa a identificação de antígenos reconhecidos diferencialmente.

Este projeto reune uma rede de pesquisadores com excelência da biologia molecular, fisica e quimica num apoio a interacao de pósgraduações com o foco no programa de pósgraduação PGEXBIO em Porto Velho-RO. Os temas abordados incluem o desenvolvimento de novas estrategias para combate de doencas importnates da Amazonia brasileira (Malaria e Leishmaniose), incluindo novos fármacos e vacinas, e se baseando em nanotecnologia.

Neste projeto pesquisamos a ocorrência de anticorpos em pacientes sintomáticos e assintomáticos contra antígenos da hemácia infectada e correlacionamos a resposta com proteção ou não, Também foi medido se a citoaderencia de hemácias infectadas foi inibida após incubacao com plasmas de sintomáticos e assintomáticos.

Neste projeto tentamos montar um sistema de expressão controlada de transgenes utilizando um sistema induzivel baseado na produção de uma versão degradável da T7 polimerase em P, falciparum e transgenes controlados pelo promotor minimo T7. Incluimos nesta aproximação a construção de vetores que promovem a produção de RNA dupla fita.

Neste projeto abordamos a importancia da reação imunologica humoral contra antigenos recombinantes da superfície da hemácia infectada com P. falciparum e do merozoita utilizando isolados e soros obtidos de individuos da região amazonica. Montamos também um mapa proteomico da superficie da hemácia infectada com o objetivo de identificar antigenos novos reconhecidos diferencialmente por soros de pacientes "protegidos" (assintomáticos).

Neste projeto avaliamos fatores e mecanismos que controlam a variação antigênica de Plasmodium falciparum e abordamos também aspectos da variabilidade de repertórios de antígenos variantes em isolados P. falciparum na Amazônia.