Antonio Jose da Costa Filho.

Projeto para apoio financeiro à realização da terceira edição do International Workshop on Spectroscopy for Biology

O surgimento da diversidade e complexidade da vida tem sido facilitado pela comunicação intercelular, que conta com a participação central de um mecanismo altamente conservado conhecido como via de secreção convencional. Esta via envolve a secreção de proteínas contendo um peptídeo sinal através da rota retículo endoplasmático-complexo de Golgi-destino final. Embora algumas questões permaneçam em aberto, seu maquinário básico já foi bem descrito. Até recentemente, acreditava-se que esta rota exocítica era o único caminho para exportação de uma ampla gama de proteínas. No entanto, vias adicionais que as células usam para secretar proteínas que não possuem uma sequência sinal têm sido reveladas. Isto desafiou a compreensão tradicional de uma única via secretora e levou à exploração de rotas alternativas dedicadas à secreção, denominadas vias de secreção proteica não convencional (UPS). Apesar da relevância de UPS em processos de adaptação celular ao estresse, muitos aspectos cruciais de sua regulação e função biológica ainda são pouco compreendidos. Uma família de proteínas residentes no Golgi, as Golgi Reassembly and Stacking Proteins (GRASPs), desempenha um papel fundamental em dois dos tipos de UPS descritos até agora. As GRASPs são pilares fundamentais desta proposta, que delas irradia para abordar cinco aspectos diferentes e interligados de UPS: (1) GRASPs em diferentes organismos; (2) Parceiros de interação das GRASP; (3) as interações de GRASPs e de seus parceiros com as membranas; (4) arranjos supramoleculares de GRASPs e seus parceiros; (5) estudos celulares. Além desses aspectos específicos, esta proposta temática pretende também contribuir para a conexão entre os mundos molecular e celular, partindo da biofísica molecular de GRASPs e percorrendo um caminho que leva às implicações celulares do que é observado no tubo de ensaio. Tal estratégia tem o potencial de produzir uma melhor compreensão dos aspectos fundamentais da UPS, com consequente alto impacto para homeostase e comunicação celular e suas disfunções associadas a doenças.

O entendimento mais completo e detalhado de fenômenos relacionados à vida passa, em última instância, pela descrição dos componentes moleculares do fenômeno de interesse. Para tanto, vários métodos experimentais estão disponíveis, cada um com suas vantagens e desvantagens. Em muitos desses, o uso de marcadores moleculares extrínsecos ao sistema se faz necessário, o que constitui uma dificuldade per se. Em outros, equipamentos de muito alto custo são requeridos, o que inviabiliza o amplo acesso. A proposta ora em discussão objetiva disponibilizar à comunidade científica de nosso país, em geral, e do Estado de São Paulo, em particular, um método recém-criado e que, através de um equipamento de custo moderado, permite aferir, de forma acurada, a massa de moléculas sem o uso de marcadores externos, com alta sensibilidade e resolução de single molecule. Trata-se da Fotometria de Massa (do inglês Mass Photometry - MP), um método inovador, desenvolvido ao longo da última década pelo grupo do Prof. Kukura (Universidade de Oxford) e ainda não disponível em nenhum centro de pesquisa da América Latina. A presença deste equipamento no campus da USP em Ribeirão Preto representa uma oportunidade estratégica não apenas para o avanço da pesquisa e inovação local, mas também para fortalecer as redes de colaboração científica e de acesso à metodologia de forma regional, nacional e internacional (vide cartas de apoio). Além do equipamento de MP, a proposta EMU inclui, ainda, um segundo equipamento EMU, qual seja uma centrífuga de alta velocidade. Este é um equipamento tradicional em laboratórios de preparação de amostras e visa suprir uma carência do Laboratório Multiusuário de Preparação de Amostras do Departamento de Física da FFCLRP/USP, assim propiciando uma infraestrutura completa de apoio ao usuário do fotômetro de massa, que poderá preparar as amostras para os experimentos de MP de forma adequada. Aqui, cabe ressaltar a relevância de se instalar um novo método físico-químico em um departamento de Física, como o da FFCLRP, com larga tradição e excelência de atuação em projetos na fronteira da Física/Biologia/Medicina. Além disso, Ribeirão Preto ocupa uma posição geográfica privilegiada, facilitando o acesso e a integração com outros importantes centros de pesquisa e universidades dentro e fora do Estado de São Paulo. Com a proximidade de instituições como a UNESP (em São José do Rio Preto, Franca, Jaboticabal e Tupã), bem como a USP e a UFSCar (em São Carlos), a instalação deste equipamento servirá como um catalisador para colaborações interinstitucionais, beneficiando um amplo espectro de projetos (conforme evidenciado nas cartas anexadas e nos projetos associados). Por fim, a inovação trazida pela proposta ora em discussão conseguiu chamar a atenção não apenas de grupos de pesquisa estabelecidos em instituições acadêmcias, mas também da empresa Blau Farmacêutica (vide carta de apoio), que antevê boas perspectivas de uso do novo EMU. Isto confere mais um grau de inovação e diferencial à nossa proposta.

Domínios de baixa complexidade (LCDs) são sequências de resíduos de aminoácidos com características estruturais peculiares e ainda pouco exploradas dentro da bioquímica e biofísica molecular. Sua dinâmica de interação é pouco conhecida, bem como suas funções, toxicidade e persistência durante a evolução. Sabe-se, porém, que, se usados como adesivos moleculares em proteínas (chamadas, então, de proteínas quimeras), os LCDs são capazes de promover separação de fases (aglomerados), como em gotículas (separação de fase líquido-líquido) ou em fase sólida (agregados irreversíveis). Estas fases formadas por quimeras podem ter suas superfícies químicas controladas, mantendo as propriedades físicas/químicas da proteína original. Essa estratégia permite uma quantidade grande de aplicações, como em engenharia de tecidos, desenvolvimento de vacinas, biossensores, engenharia de alimentos, dentre outras. Neste projeto, propomos o uso da enzima Clorocatecol 1,2-dioxigenase (1,2-CCD), que atua na degradação de compostos policíclicos aromáticos e, portanto, com potencial uso em mecanismos de biorremediação, como caso de estudo para fabricação de micro-reatores enzimáticos constituídos por enzimas quimeras contendo LCDs. A enzima será expressa e purificada com LCDs ligados a suas regiões N- e C-terminais, sendo tais LCDs derivados de sequências de baixa complexidade reportadas previamente na literatura e que se mostraram capazes de induzir separação de fase líquido-líquido. Para caracterizar as fases separadas, haverá análises estruturais da proteína quimera formada, através de calorimetria diferencial de varredura (DSC), dicroísmo circular (CD) e atividade enzimática. Para a observação direta do processo de separação de fases, as técnicas de microscopia e de espalhamento de luz serão empregadas. Esperamos que o agregado formado por separação de fase da proteína quimera tenha potencial uso na degradação de compostos aromáticos e que o estabelecimento com sucesso do know how na produção de micro-reatores por separação de fase líquido-líquido possa ser estendido a outras enzimas com potencial aplicação biotecnológica.

O entendimento da tríade estrutura-dinâmica-função leva à descrição mais completa e detalhada possível sobre processos envolvendo moléculas biológicas, em particular proteínas. Neste projeto, pretendemos fazer uso tanto de métodos mais tradicionais quanto mais modernos em Ressonância Magnética Eletrônica (RME), visando a determinação de vínculos de distância e a detecção de coexistência de conformações moleculares, para investigarmos tanto problemas mais tradicionais (como interação peptídeos/membrana) quanto mais recentes (como proteínas intrinsecamente desordenadas) em Biofísica Molecular. Para isso, a proposta foi dividida em dois problemas de interesse, quais sejam: (I) interações moleculares no mecanismo funcional de proteínas e (II) peptídeos de fusão da glicoproteína S do SARS-CoV e suas interações com modelos de membrana. No Problema I, interessam-nos: a proteína humana ligante de cálcio da família S100A12 e proteínas da família das Proteínas de Organização e Compactação do Golgi (GRASP). No primeiro caso, temos um problema mais tradicional (velho problema) de busca por mudanças conformacionais da proteína quando na presença de ligantes (íons divalentes), mas explorado com simulações de espectros de RME-CW e medidas de distâncias (novos e velhos olhares). No segundo caso, temos um novo problema envolvendo proteínas GRASP e que se revelaram com características de proteínas com desordem intrínseca, um tema ainda recente e que se apresenta como área em vigorosa expansão na comunidade científica. As proteínas GRASPs serão observadas com olhar tradicional de RME-CW combinado com várias outras técnicas biofísicas, e ainda com potencial para medidas de distância por RME pulsada. No Problema II, trataremos da interação entre modelos de membrana biológica e ligantes de baixa massa molecular, aí se incluindo peptídeos biologicamente ativos, fármacos utilizados no tratamento de doenças infecciosas e complexos metálicos com atividade antitumoral. Neste caso, a técnica de RME será complementada, quando necessário, por outras metodologias como calorimetria, dicroísmo circular (CD) e fluorescência. Nesta parte do projeto, teríamos o uso de olhares mais tradicionais (métodos espectroscópicos com ênfase em RME) para problemas mais tradicionais, mas com a inclusão de um aspecto inovador (novo olhar), qual seja o uso de medidas de distância por RME pulsada nas questões envolvendo peptídeos biologicamente ativos. As contribuições esperadas dizem respeito não apenas às questões dos problemas específicos, mas também à consolidação, em nosso estado, de métodos em RME, como a marcação de spin sítio-dirigida e medidas de distância por RME pulsada baseadas na técnica de ressonância dupla elétron-elétron (DEER).

Extending our recent new crystallographic structural models, ESR DEER and MD (Fowler et al., (2015) Structure, 23(2):290-301 ? front cover feature), we now aim to define the reaction coordinates for two peptide transporters from the bacteria Shewanella oniedensis (PepTSo) and from Streptococcus thermophilus (PepTSt). Both the conformational changes associated with discernable intermediates in the transporter pathway(s), as well as the lipid dependence of the various stages are currently not described, and so will be addressed here using underpinning molecular biology approaches in Oxford and Sao Paulo. The response of the transporter to the proton motive force (pmf) in sealed systems, and the nature of the ligand binding environment, will also be examined, giving new information about direct coupling of peptide transport to the energetics that drives function, with a view to defining electromechanical coupling within this important drug facilitator. To do this we will:
-	direct the design of spectroscopic studies of membrane-embedded peptide transporters using currently available, as well as new crystal structural and MD generated models;
-	use the spectroscopic and fiunctional information to determine conformational and dynamic details of membrane-embedded transporters, and generate novel detailed molecular models of reaction intermediates;
With a final goal of describing the mechanism of action, lipid dependence and conformations of reaction intermediate states of peptide (and other homologues) transporters in molecular and kinetic detail.

The main objective of this scientific collaboration achieved through exchange of students and PhD researchers will be in expanding the ongoing biophysical studies of Golgi reassembly and stacking protein (GRASP) that have been already carried out by the USP team by further developing and applying nanotechnology approaches developed by the NCSU team. GRASP is known to play the key role in the molecular mechanism of establishing cryptococcosis ? a fungal disease caused by the yeast pathogen Cryptococcus neoformans. Cryptococcosis has high mortality rates in immunosuppressed individuals and is on the rise in recent years in Brazil primarily for the reasons of an increased incidence of AIDS and a widespread use of immunosuppressive drugs. Specific aims of the proposed scientific collaboration include: (1) Developing and applying quartz crystal microbalance (QCM) nanostructured sensors to investigate binding of GRASP to lipid bilayers of defined curvature and (2) Employing nanostructured lipid bilayer membranes to promote protein crystal nucleation and allow for growing GRASP crystals for subsequent structural studies. Overall, this project aims at producing experimental data for structure-function correlation of C. neoformans GRASP that would pave the way for developing novel therapeutic approaches to cryptococcosis. The project also addresses fundamental questions of the role of GRASP in functioning Golgi apparatus as well as developing new nanotechnologies for biosensing and preparation of protein crystals from "hard-to-crystallize" peripheral and membrane proteins.

A incidência de infecções fúngicas de alta letalidade tem aumentado sobremaneira nos últimos anos, tornando-as um sério problema de saúde pública, principalmente quando envolve pacientes imunocomprometidos. A falta de tratamentos específicos com alta eficiência e baixos efeitos colaterais agrava a situação e faz da busca pelo entendimento dos mecanismos de ação de fungos um tópico de grande interesse. O fungo Cryptococcus neoformans é uma das espécies mais comuns no Brasil e aparenta ser a única espécie patogênica do gênero Cryptococcus. A virulência desse patógeno está relacionada à capsula externa formada por diversas biomoléculas produzidas no espaço intracelular e que aparentemente atingem o espaço extracelular através de mecanismos não convencionais de secreção. Apesar de ainda pouco entendidos, uma característica comum a esses mecanismos é dependência da proteína chamada Golgi Re- Assembly and Stacking Proteins (GRASPs). GRASPs têm sido implicadas em uma série de funções tanto em mecanismos de secreção não-convencional quanto de estruturação e organização do aparato de Golgi. Entretanto, seu exato papel em cada situação ainda carece de resultados estruturais e funcionais em nível molecular. É neste contexto que este trabalho se insere: produzir dados que possibilitem a correlação estrutura-função na GRASP de C. neoformans (CnGRASP). Para isso, utilizaremos uma série de técnicas experimentais em Biofísica Molecular que vão desde a determinação da estrutura CnGRASP por difração de raios X (até o atual momento apenas o domínio GRASP do ortólogo humano GRASP55 foi elucidado) até o estudo da sua interação com ligantes naturais, como o GXM, e com modelos de membrana biológica através de espectroscopias como a ressonância magnética eletrônica (RME).

Nanotechnology provides unique opportunities for rational design of interfaces between engineered structures and delicate biological molecules and systems built by self-assembly. Such hybrid nano-bio systems are paving the way for the next generation of protein biochips, bioinspired materials, and more complex biomimetic systems. Here we propose a trilateral interdisciplinary collaboration between NCSU, USP, and the University of Surrey that will be centered on interdisciplinary studies of bio-nano interfaces and is aimed at the following problems of global importance.

"Ressonância Magnética Eletrônica em Estudos de Estrutura, Função e Interações de Moléculas com Interesse Biológico": A técnica de Ressonância Magnética Eletrônica (RME) em seu regime de onda contínua (CW) vem sendo aplicada a estudos estruturais, em particular de sistemas de interesse biológico, há muitos anos, sendo as contribuições daí provenientes bastante diversas. Vão desde a caracterização de sítios de ligação de metais em estruturas de proteínas, passando por estudos da estrutura e dinâmica de membranas biológicas e chegando ao estudo de processos reacionais e de transferência de elétrons. Mais recentemente, a espectroscopia de RME tem passado por uma fase de grande crescimento tanto através do aparecimento de novas metodologias em RME convencional, como a técnica de ?site-directed spin labeling?, quanto pela sua extensão a regimes de muito altas freqüências e às técnicas resolvidas no tempo. As aplicações de RME a estudos estruturais e funcionais de proteínas, biomembranas, pequenos peptídeos, moléculas modelo e seus complexos com metais de transição, constituem o principal objetivo a ser alcançado no presente projeto de pesquisa. Esta proposta representa a congregação de várias linhas de pesquisas tradicionais mantidas no grupo de Biofísica Molecular do IFSC/USP e que devem, agora, ser estabelecidas dentro do Departamento de Física e Matemática da FFCLRP/USP. Esta diversidade de temas encontra seu ponto comum e temático justamente numa especialidade desenvolvida pelo grupo ao longo de muitos anos de trabalho: o desenvolvimento e a aplicação da técnica de RPE em suas diferentes vertentes (multi-frequências, RPE convencional, RPE pulsado) ao estudo de problemas de interesse físico/químico/biológico. Mais especificamente, podemos dividir os projetos de pesquisas propostos em três problemas principais: (I) marcação de spin sítio dirigida da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase e de proteínas ligante de cálcio S100A12; (II) interações entre ligantes de baixo pes

Projeto: "Marcação de Spin Sítio Dirigida e Ressonância Magnética Eletrônica: Uma nova abordagem para o estudo de interações membrana-proteína e proteína-proteína"

O Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças
Infecciosas (INBEQMeDI) é uma iniciativa conjunta resultante de projetos de colaboração
existentes focados no desenvolvimento de estudos estruturais e biológicos em alvos
moleculares específicos em microorganismos associados com doenças tropicais
negligenciadas, tendo como objetivo o desenvolvimento de novas drogas candidatas para o
tratamento das doenças endêmicas leishmaniose, esquistossomose, doença de chagas e
malaria.

Ressonância Magnética Eletrônica em Estudos de Biomembranas e da Estrutura/Função de Proteínas e Sistemas Modelo

?Marcação de Spin Sítio Dirigida e Ressonância Magnética Eletrônica: Uma nova abordagem para o estudo de interações membrana-proteína e proteína-proteína? - No presente projeto é proposto o estudo das enzimas Diidroorotato desidrogenase (DHODH) de vários organismos e clorocatecol 1,2-dioxigenase (CCD) de Pseudomonas putida através, principalmente, de uma metodologia que se vale da técnica de Ressonância Magnética Eletrônica (RME) e da possibilidade de inserirmos sondas paramagnéticas seletivamente em estruturas protéicas (marcação de spin sítio dirigida). A enzima DHODH participa da quarta etapa seqüencial da síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, na qual catalisa a oxidação de diidroorotato (DHO) em orotato, em uma reação dependente de FMN (flavina mononucleotídeo) e receptores de elétrons. No presente projeto, é proposto o estudo da correlação estrutura-função da enzima DHODH de vários organismos (Escherichia coli, Leishmania major, Trypanosomo cruzi) com o objetivo de se explorar as informações já disponibilizadas para o estudo do seu mecanismo de atuação, chegando-se a um melhor entendimento em nível molecular das mudanças conformacionais ocorridas durante o processo catalítico e na presença de moléculas com atividade inibitória numa abordagem atualmente conhecida como genoma funcional. Em relação à enzima CCD, sua função biológica justifica o interesse pelo seu estudo: a clivagem de hidrocarbonetos sintéticos aromáticos continuamente liberados pela indústria moderna. Recentemente, quando da determinação da primeira estrutura tridimensional de uma dioxigenase intradiol da família da catecol dioxigenase, foi observada a existência de um canal hidrofóbico para ligação de fosfolipídios na estrutura da enzima CCD. Este fato trouxe à tona uma série de novas perguntas a respeito dessa família de enzimas e que buscam investigar o porquê de uma possível interação dessa proteína com membranas biológicas ou com moléculas de surfactantes. Portanto, propomos abordar

Recursos Complementares de Apoio à Pesquisa

Projeto: "Estudos espectroscópicos da correlação estrutura-função da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania major"
Resumo: no presente projeto, é proposto o estudo da correlação estrutura-função da enzima Diidroorotato desidrogenase de Leishmania major através do uso conjunto de técnicas de DNA recombinante e espectrocópicas como a ressonância magnética eletrônica, fluorescência e dicroísmo circular. As duas primeiras espectroscopias oferecem a possibilidade de monitoramento de mudanças locais em regiões da proteína onde existam "probes" naturais, como resíduos de triptofano e/ou tirosina, ou a chance de se introduzir marcadores externos, como é o caso de radicais nitróxido. A introdução de radicais nitróxidos em estruturas de proteínas solúveis ou de membrana faz parte de uma metodologia denominada "site-directed spin labeling", que vem sendo utilizada com muito sucesso no estudo da conformação de proteínas durante sua ligação com membranas ou com ligantes diversos. O dicroísmo circular, por sua vez, fornece não só uma visão geral do conteúdo de estrutura secundária e suas modificações em uma determinada macromolécula (far UV), mas também permite o acompanhamento de alterações em torno de resíduos com cadeia lateral aromática (near UV). O objetivo é explorar as informações disponibilizadas pelo projeto genoma para o estudo do mecanismo de atuação da enzima, findando com um melhor entendimento em nível molecular das mudanças conformacionais durante o processo catalítico e na presença de moléculas com atividade inibitória numa abordagem atualmente conhecida como genoma funcional.

A técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) em seu regime de onda contínua (CW) vem sendo aplicada a estudos estruturais, em particular de sistemas de interesse biológico, há muitos anos, sendo as contribuições daí provenientes bastante diversas. Vão desde a caracterização de sítios de ligação de metais em estruturas de proteínas, passando por estudos da estrutura e dinâmica de membranas biológicas e chegando ao estudo de processos reacionais e de transferência de elétrons. Mais recentemente, a espectroscopia de RPE tem passado por uma fase de grande crescimento tanto através do aparecimento de novas metodologias em RPE convencional, como a técnica de "site-directed spin labeling", quanto pela sua extensão a regimes de muito altas freqüências e às técnicas resolvidas no tempo. Essas últimas se valeram do enorme progresso conseguido nos últimos anos em termos de desenvolvimento instrumental, levando RPE pulsado a deixar de ser uma atividade limitada a poucos laboratórios onde se fabricava praticamente tudo que era preciso, para tornar-se uma técnica bem difundida e com espectrômetros disponíveis comercialmente. Ainda assim e ao contrário de RMN, que praticamente aboliu a metodologia de onda contínua, a maioria das pesquisas em RPE pulsado passa por uma etapa de medidas convencionais. Algumas das principais aplicações de RPE pulsado têm envolvido o estudo de metaloproteínas e materiais poliméricos.
As aplicações de RPE a estudos estruturais e funcionais de proteínas, biomembranas, pequenos peptídeos, moléculas modelo e seus complexos com metais de transição, constituem o principal objetivo a ser apresentado no presente projeto de pesquisa. A proposta de criação de um Núcleo de Excelência em Ressonância Paramagnética Eletrônica representa a congregação de várias linhas de pesquisas tradicionais mantidas no grupo de Biofísica Molecular do IFSC/USP. Esta diversidade de temas encontra seu ponto comum e temático justamente numa especialidade desenvolvida pel

Projeto I / 2003 - Processo no. 03.1.18348.1.1
"Recursos Complementares para Apoio a Grupos de Pesquisa"
R$ 3.500,00 
Remanejamento de Verba para IFSC em 25/07/2003 - Documento Remanejamento 50657961
(vinculado ao Processo FAPESP no. 2002/13090-3)

"Estrutura dinâmica de membranas lipídicas de interesse biológico: a fase hexagonal invertida e a interação lipídio-peptídeo por ressonância paramagnética eletrônica" - A técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) aliada ao uso de marcadores de spin é uma das ferramentas mais utilizadas para o estudo da estrutura dinâmica de membranas de interesse biológico. Mudanças na organização dos lipídios induzidas por diversos fatores, como temperatura e/ou a ligação à membrana de peptídeos ou proteínas, também podem ser convenientemente monitoradas através da RPE. Além disso, análises mais quantitativas da es-trutura lipídica e de suas alterações podem ser alcançadas quando soma-se à metodologia acima simulações espectrais baseadas na teoria estocástica de Liouville e modelos para a dinâmica dos spins desenvolvidos por Freed e colaboradores. Estas simulações contribuem de maneira significativa para a caracterização de diferentes fases lipídicas. No presente projeto, é proposta a utilização conjunta desses métodos para o estudo de dois problemas em membranas de interesse biológico. O primeiro trata da transição da fase lamelar de líquido cristalino para a fase hexagonal invertida (HII) que, a despeito dos muitos estudos sobre o polimorfismo de membranas lipídicas, ainda necessita de um modelo microscópico mais detalhado. O segundo problema relaciona-se à interação de segmentos peptídicos das proteínas p24 e gp41 do vírus HIV com membranas lipídicas. A determinação dos mecanismos que favorecem e regem tal interação, bem como de mudanças estruturais do peptídeo e da membrana (indução de fase HII, por exemplo) são os principais objetivos desta parte do trabalho.