Anderson de Sá Nunes.

Dentre as espécies de carrapatos encontradas no Brasil, aquelas do gênero Amblyomma apresentam maior abundância e distribuição no país. Amblyomma sculptum é uma espécie endêmica da região Sudeste e tem como hospedeiros capivaras, antas e cavalos, além do potencial para parasitar seres humanos. Esta espécie é responsável pela transmissão da bactéria Rickettsia rickettsii, causadora da febre maculosa brasileira, a riquetsiose mais severa conhecida. Tanto o sucesso hematofágico quanto a transmissão de patógenos pelos carrapatos são fortemente dependentes das moléculas bioativas presentes na sua saliva. Entretanto, apesar da relevância do Amblyomma sculptum na saúde pública humana e veterinária, os trabalhos avaliando os efeitos de sua saliva e componentes salivares na fisiologia do hospedeiro vertebrado são escassos. Experiências prévias bem sucedidas do nosso grupo na elucidação das atividades da saliva e de moléculas salivares de outras espécies de carrapatos nos levaram a investigar o papel da saliva de Amblyomma sculptum nas interações com o hospedeiro vertebrado. O presente projeto representa um aprofundamento desses estudos, onde pretendemos determinar os alvos estruturais e bioquímicos de dois inibidores de proteases pertencentes às famílias mais abundantes encontradas na saliva de carrapatos (um inibidor do tipo Kunitz e uma cistatina) selecionados a partir do sialotranscriptoma de Amblyomma sculptum. Também dissecaremos seus mecanismos de ação nas respostas hemostática e imunológica de camundongos, testaremos a utilidade dessas moléculas como imunobiológicos em modelos experimentais de doenças inflamatórias/autoimunes e como vacinas na proteção contra a exposição por carrapatos.

A saliva de fêmeas do Aedes aegypti é composta por uma mistura de moléculas que participam do combate à hemostasia e ao sistema imunológico do hospedeiro vertebrado no momento do repasto sanguíneo. Dentre as atividades imunomoduladoras encontradas na saliva desse vetor está uma citotoxicidade rápida, potente e seletiva sobre linfócitos, descrita recentemente por nosso grupo e mediada por uma molécula presente somente na saliva de fêmeas da espécie. Essa morte está associada a exposição de fosfatidilserina na porção externa da membrana plasmática, mas somente essa informação não permite uma classificação precisa do tipo de morte celular envolvida. Além disso, não se sabe ainda se fagócitos são capazes de reconhecer essas células mortas e removê-las pelo processo de eferocitose, tampouco o impacto desse processo na modução das funções efetoras de células teciduais. Neste projeto, pretendemos a realizar a caracterização bioquímica e molecular da morte de linfócitos induzida pela saliva de A. aegypti, determinar se essa atividade ocorre e também em linfócitos não clássicos e avaliar o papel da eferocitose como consequência dessa citotoxicidade in vitro e in vivo. Para isso, linfócitos incubados com os componentes salivares serão co-cultivados com macrófagos e com células dendríticas in vitro e um modelo de exposição de camundongos às picadas do mosquito será empregado para avaliações in vivo. Esse estudo aprimorará o entendimento do microambiente criado pela saliva do A. aegypti na pele do hospedeiro no momento da picada e seu papel na transmissão dos arbovírus causadores de doenças humanas, contribuindo com futuros estudos para gerar novas alternativas de combate ao mosquito e dos patógenos transmitidos por esses vetores.

Em uma das teses de Doutorado desenvolvidas durante a vigência do projeto Jovem Pesquisador intitulado "Imunoma funcional da saliva de Aedes aegypti", mostramos que o extrato de glândula salivar (EGS) do mosquito é capaz de modular consistentemente os sinais clínicos da encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo murino para o estudo da esclerose múltipla. Evidenciamos que a adição do EGS na emulsão preparada para induzir a doença diminuiu a incidência retardou o aparecimento dos sinais clínicos e, nos poucos animais que ficaram doentes, os sintomas foram mais brandos do que no grupo não tratado com EGS. Diversos mecanismos estão envolvidos na modulação da EAE pelo EGS de A. aegypti, levando a redução na proliferação de linfócitos específicos e diminuição na produção de IFN-gama e IL-17, citocinas pró-encefalomielogênicas Th1 e Th17, respectivamente. Os resultados dessa tese, embora promissores, não revelaram a molécula responsável pela modulação descrita, limitando significativamente o impacto do nosso trabalho e o periódico científico a ser escolhido para publicação. Por esse motivo, após a defesa da tese em questão, continuamos realizando experimentos funcionais e bioquímicos e identificamos 3 moléculas salivares potencialmente envolvidas no fenótipo observado. No presente projeto, pretendemos expressar essas moléculas e caracterizar sua atividade no modelo de EAE, proporcionando maior relevância e impacto científico ao nosso trabalho. Esse investimento na qualidade das publicações geradas com financiamentos da FAPESP vem sendo claramente apoiado pelo Diretor Científico da Fundação, Prof. Dr. Carlos Henrique de Brito Cruz, em suas apresentações institucionais.

Os carrapatos apresentam hábito de vida parasitário, alimentando-se obrigatoriamente do sangue e/ou da linfa de vertebrados. Como consequência da hematofagia, esses artrópodes transmitem uma grande diversidade de patógenos. Dentre as riquetsioses transmitidas por carrapatos, destacam-se a Anaplasmose Bovina (AB) e a Febre Maculosa Brasileira (FMB). A AB é uma doença severa que acomete os bovinos, sendo ocasionada por Anaplasma marginale e transmitida, no Brasil, pelo carrapato Rhipicephalus microplus. Apesar de apresentar importância médico-veterinária e econômica, não existe uma vacina comercial eficiente para o controle de R. microplus nem da AB. Similarmente, não existem vacinas para a prevenção da FMB, a riquetsiose mais severa que acomete o homem. No nosso país, o agente etiológico da FMB, Rickettsia rickettsii, é transmitido por carrapatos do gênero Amblyomma. O presente projeto tem como objetivo elucidar os fatores moleculares envolvidos na interação entre carrapatos, riquétsias e os hospedeiros vertebrados. Para isso, reunimos uma rede coesa de pesquisadores com linhas de pesquisa complementares. Os dados obtidos poderão levar à identificação de alvos para o desenvolvimento de vacinas tanto para o controle de carrapatos quanto da AB e da FMB. Além disso, propomos investigar a susceptibilidade de A. marginale a antimicrobianos, permitindo um controle mais efetivo da AB através de quimioprofilaxia, prática cada vez mais utilizada em associação à vacinação.

La mosca de los cuernos (Haematobia irritans) es una mosca hematófaga de distribución mundial que afecta principalmente al ganado bovino causando importantes pérdidas económicas (Cupp et al. 2004). Su presencia en Uruguay fue diagnosticada en 1991 (Carballo Martinez 1991) y hoy afecta todo el territorio nacional. El control de este parásito se ejerce principalmente en base al uso de insecticidas, los cuales son aplicados rutinariamente cuando la infestación es masiva (Guglielmone et al. 2002). Desafortunadamente, su excesiva utilización ha provocado que H. irritans desarrolle resistencia a estos compuestos, disminuyendo la eficiencia de los sistemas de control (Oyarzún et al. 2008). Esto ha derivado en la búsqueda de métodos alternativos de control, tales como trampas mecánicas y/o controladores biológicos, selección de animales resistentes o el desarrollo de vacunas (Tozer Sutherst 1996; Cupp et al. 2004). El objetivo general de la presente propuesta es desarrollar una vacuna, que permita controlar la carga parasitaria de bovinos naturalmente expuestos a la mosca de los cuernos. Esta herramienta de base biotecnológica pretende, dar solución a un importante problema sanitario de los bovinos en la región y reducir o sustituir el uso de insecticidas para el control de este parásito. El desarrollo de la vacuna implica, la identificación de los posibles inmunógenos, a través de un estudio profundo de los componentes de la saliva de la mosca de los cuernos, para luego seleccionar las moléculas candidatas según su actividad biológica. Finalmente se realizará la formulación de la vacuna, que será testeada en bovinos naturalmente expuestos a la mosca de los cuernos. Este proyecto será realizado por un equipo interdisciplinario de investigadores de la UdelaR y de la Universidad de San Pablo, Brasil.

O controle e a prevenção de doenças infecciosas e parasitárias, incluindo aquelas transmitidas por artrópodes hematófagos permanecem uma meta distante. Nas últimas décadas tem se evidenciado cada vez mais que os medicamentos até então empregados possuem eficácia variável e muitos efeitos adversos. Esse cenário alarmante traz à tona a necessidade de abordagens inovadoras no sentido de se entender os detalhes da interação vetor-patógeno-hospedeiro. Sabe-se que no artrópode vetor, os componentes cruciais para a interação com os patógenos concentram-se primeiramente no sistema digestório do vetor e, posteriormente, em suas glândulas salivares. A saliva, além de carrear o patógeno, contém fatores para o controle da hemostasia, da inflamação e do sistema imunológico do hospedeiro vertebrado, os quais acabam por propiciar a invasão e o estabelecimento do patógeno. Nesse contexto, o Núcleo de Apoio à Pesquisa em Moléculas Bioativas de Artrópodes Vetores (NAP-MOBIARVE) está sendo criado com a missão de identificar e caracterizar alvos potenciais para o desenvolvimento de novos medicamentos para controle/tratamento dessas doenças ou ainda para o melhoramento da eficácia de drogas pré-existentes. Como prova de conceito, escolhemos para o presente projeto, três espécies de mosquitos (Aedes aegypti, Anopheles aquasalis e Culex quinquefasciatus) e três espécies carrapatos (Amblyomma cajennense, Amblyomma aureolatum e Rhipicephalus sanguineus), vetores de interesse médico e econômico no mundo inteiro, especialmente no Brasil. Inicialmente, identificaremos o repertório de genes expressos nas glândulas salivares e intestinos dessas espécies, em diferentes fases de alimentação e/ou infectados por patógenos, usando a técnica de pirossequencimento. Os dados serão analisados por bioinformática e a informação gerada será utilizada para a caracterização funcional dos produtos gênicos identificados através de duas abordagens. No vetor, o papel das moléculas moduladas pela alimentação e/ou infecção será avaliado pelo seu silenciamento com RNA de interferência (RNAi). Para avaliar sua atividade tanto no hospedeiro vertebrado quanto em patógenos, será criada uma plataforma de ensaios bioquímicos, farmacológicos, microbiológicos, parasitológicos e imunológicos que testará os potenciais candidatos em larga escala, com uma relação custo-benefício vantajosa quando comparada com a pesquisa de componentes/moléculas individuais. Esperamos com esse projeto iniciar uma revolução na pesquisa de moléculas bioativas provenientes de artrópodes vetores, gerando conhecimentos úteis para a área de biologia desses ectoparasitas que poderão desvendar moléculas que facilitam a invasão e a infecção de patógenos, futuros candidatos para vacinas e de controle dos vetores. Outras áreas não diretamente relacionadas também se beneficiarão com a criação de ferramentas bioquímicas e farmacológicas, descoberta de anti-inflamatórios, imunomoduladores, antimicrobianos, antiparasitários e antitumorais.

Duas revoluções recentes mudaram a história da pesquisa do mosquito Aedes aegypti. A primeira ocorreu com a publicação dos salivomas da espécie. Esses catálogos, representando o conjunto de proteínas e de RNA mensageiros presentes na glândula salivar desse mosquito vetor, multiplicou o conhecimento existente até então sobre as proteínas salivares em mais de vinte vezes. A segunda revolução foi o sequenciamento de seu genoma, trazendo uma perspectiva única aos estudos comparativos e ao desenvolvimento de ferramentas genômicas para análises de transcriptomas e genética reversa. O presente projeto pretende iniciar uma terceira revolução na pesquisa do Ae. aegypti, criando o imunoma funcional da saliva desse vetor. Para tanto, abordagens bioquímicas clássicas (microfiltração, separação cromatográfica, degradação de Edman, espectrometria de massa) e abordagens pós-genômicas (análises de bioinformática, clonagem gênica, expressão de proteínas, síntese de peptídeos) serão exploradas lado a lado em ensaios de screenings imunofarmacológicos em larga escala, no sentido de se criar um mapa das atividades imunomoduladoras das proteínas presentes na saliva desse mosquito. Considerando o impacto desse vetor e das doenças por ele transmitidas na área de saúde pública e na economia mundial, especialmente nos países em desenvolvimento, o conhecimento gerado por esse projeto deverá levar ao descobrimento de novas moléculas com importantes atividades biológicas e potencial terapêutico, desenvolvimento de vacinas contra os patógenos transmitidos pelo mosquito e de novas abordagens de controle do vetor.

A entomologia molecular passa, neste momento, por uma grande mudança em função do advento da genômica, o que esta conduzindo a uma reformatação da área. Este cenário cria uma janela de oportunidades para a inserção de novos grupos, capazes de utilizar essas novas ferramentas para responder questões biológicas relevantes. Além das 12 espécies de Drosophila e dos mosquitos Aedes aegypti, Anopheles gambiae e Culex quinquefasciatus transmissores de doenças já mencionados, foram concluídos genomas completos de uma mariposa, da abelha e de um besouro. Genomas de vários outros artrópodes, inclusive Anopheles darlingi estão atualmente sendo seqüenciados. Além disso, abordagens as mais variadas, desde transcriptomas até análises de genes individuais, têm resultado no acúmulo de informações sem precedentes na história da Ciência, o que leva a crer que os próximos anos trarão grandes mudanças no plano da biologia fundamental, assim como nos seus desdobramentos tecnológicos.A RAP (Rede Interação Anopheles-Plasmodium: uma abordagem multidisciplinar) esta sendo formada pela parceria do Instituto Butantan, Instituto de Medicina Tropical, Universidade Federal do Rio de Janeiro e Universidade de São Paulo. Na Universidade de São Paulo contamos com a Faculdade de Saúde Publica e o Instituto de Ciências Biomédicas (ICBs 2, 4 e 5). O Instituto de Ciências Biomédicas 5 (ICB 5), localizado em Monte Negro, Estado de Rondônia, é um importante centro de pesquisa vinculado à USP, e tem como missão desenvolver atividades e estudos relacionados às doenças tropicais que acometem as populações da Região Amazônica, principalmente a malária. Desde 2001 o Instituto vem exercendo e executando estasatribuições em prol da ciência, e terá participação crucial no desenvolvimento do presente projeto.

A saliva de mosquitos vetores é hoje considerada um coquetel de moléculas com diversas propriedades biológicas, mas ainda com potencial muito pouco explorado. A identificação dessas moléculas foi grandemente enriquecida com a publicação dos salivomas, catálogos representando o conjunto de proteínas e RNA mensageiros presentes nas glândulas salivares desses mosquitos. No caso do mosquito vetor Aedes aegypti, esse conhecimento produziu um salto quantitativo considerável, multiplicando o universo de proteínas salivares descritas até então em mais de 20 vezes. Apesar do avanço no entendimento da atividade de algumas dessas proteínas como anticoagulantes, anti-agregante de plaquetas e vasodilatadoras, nada se tem descrito quanto ao papel imunomodulador das mesmas. O presente projeto pretende utilizar esse vasto conhecimento para iniciar a caracterização imunofuncional das proteínas encontradas nos salivomas de Ae. aegypti. Como primeiro candidato, selecionamos o transcrito AET-7393, cujo produto pertence à superfamília de inibidores de serino proteases (serpinas). Serpinas estão envolvidas na regulação de diversos processos fisiológicos e imunológicos. Assim, possíveis alvos bioquímicos dessa serpina serão caracterizados, bem como seus potenciais efeitos na imunidade inata e adquirida.