Marcia Dalastra Laurenti.

A infecção por Leishmania infantum causa leishmaniose visceral no Novo e Velho Mundo, que é fatal se não for tratada. Ao lado disto, em alguns países da América Central, L. infantum é capaz de causar uma manifestação clínica atípica chamada leishmaniose cutânea não ulcerada, diferente daquela causada pela mesma espécie de parasita na América do Sul e na Europa que se caracteriza por lesões cutâneas ulcerativas. Apesar dos esforços do nosso grupo de pesquisa, nos últimos anos, para melhor compreender a fisiopatologia da leishmaniose cutânea atípica causada por L. infantum, permanecem lacunas importantes no conhecimento desta rara interação parasita-hospedeiro, na qual um parasita viscerotrópico, L. infantum, estabelece infecção cutânea em humanos e não se espalha para vísceras como baço e fígado. Além disso, até o momento, não há explicação para que a mesma espécie de parasita cause lesão cutânea não ulcerada na América Central e leishmaniose cutânea ulcerada na América do Sul e na Europa. Assim, o objetivo principal deste projeto é estabelecer modelos experimentais in vitro e in vivo para aprofundar o conhecimento desta interação parasita-hospedeiro para melhor compreender a fisiopatologia da infecção cutânea e visceral causada por L. infantum.

As leishmanioses são zoonoses negligenciadas causadas por parasitas do gênero Leishmania spp., amplamente disseminadas no Brasil, o país com o maior número de casos nas Américas, as formas tegumentar e visceral da doença são predominantes, com maior incidência nas regiões Norte e Nordeste. Belém, no estado do Pará, apresenta alta incidência de leishmaniose tegumentar americana (LTA) e leishmaniose visceral canina (LVC). Embora os cães sejam amplamente reconhecidos como os principais reservatórios, estudos recentes sugerem que os gatos, anteriormente considerados hospedeiros acidentais, podem ter um papel relevante na transmissão da doença. A leishmaniose felina pode ocorrer de forma menos evidente, sendo mais comum em gatos imunossuprimidos ou assintomáticos. Este estudo visa investigar a presença de infecção por Leishmania spp. em felinos (Felis catus) nas áreas urbanas e periurbanas da região metropolitana de Belém, Pará, utilizando métodos diagnósticos histopatológicos, sorológicos, imunohistoquímicos e moleculares. A pesquisa também empregará análises espaciais e temporais, utilizando o método Kernel e o software ArcGIS, para identificar prováveis focos de transmissão e fatores de risco associados à infecção em felinos na região.

Tanto na Hanseníase como na Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) há o extremo hiperérgico e pauciparasitário: a Hanseníase Tuberculóide (HT) e leishmaniose mucocutânea (LMC). Em geral, mesmo considerando as particularidades de cada doença, pode-se dizer que ambas evidenciam resposta inflamatória crônica granulomatosa com predomínio de macrófagos, estes diferenciados em macrófagos epitelioídes, circundados por halo de plasmócitos e linfócitos (linfoblastos), nessa ordem (Granuloma Epitelióide). O granuloma, dito completo (granuloma tuberculóide), deve conter ainda área central de necrose do tipo caseosa. No extremo hiporreativo estão a Leishmaniose Cutânea Anérgica Difusa (LCAD) e a Hanseniase Lepromatosa (HL). Apesar de ambas as doenças apresentarem aspectos histológicos particulares, em ambas, há uma paucidade de linfócitos no infiltrado inflamatório crônico, apesar do intenso parasitismo. O que se observa é a presença de inúmeros macrófagos abarrotados de parasitos formando aglomerados denominados Granulomas de Virchow. Portanto, a justificativa desse projeto seria caracterizar macrófagos no espectro clínico das lesões da LTA e Hanseníase, mas em especial buscando elucidar a diferenciação dos macrófagos M2 relacionados a as alterações intersticiais, em especial a colagenogênese (fibrose).

Patógenos intracelulares, como Leishmania, são capazes de manipular a célula hospedeira para escapar do sistema microbicida e da resposta imunológica. O macrófago é a principal célula hospedeira de Leishmania. Estudos recentes mostram que esse parasita é capaz de manipular o metabolismo da célula hospedeira, mas não se sabe se isso tem uma consequência na resposta imune e se a manipulação farmacológica dessas vias metabólicas resultaria no controle do parasita. Células altamente replicativas como o macrófago, têm um metabolismo glicolítico modificado, glicólise aeróbica, que permite a rápida produção de ATP, atendendo às necessidades biossintéticas exigentes. Da mesma forma, os inibidores bioenergéticos já estão em uso no diagnóstico de câncer, ou em fases avançadas de ensaios clínicos, facilitando, assim, o reposicionamento. Assim, o porncipal objetivo deste estudo é identificar novos compostos bioenergéticos que refazem as vias imunometabólicas no macrófago infectado por Leishmania como estratégia terapêutica, caracterizando as alterações imunometabólicas induzidas durante a LV humana ativa e avaliando moduladores bioenergéticos ex vivo para reativar macrófagos infectados por Leishmania.

caracterizar as alterações histopatológicas das lesões de pele e/ou mucosa da leishmaniose tegumentar caudadas por L. (V.) panamensis, assim como, a resposta imune celular, procurando correlacioná-las dentro do espectro clínico-imunológico da doença causada por L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensi

As leishmanioses humanas, tanto a forma cutânea como a forma visceral sistêmica, representam, hoje, em pleno século XXI, importante problema de saúde pública mundial, em especial nas áreas tropicais e subtropicais do globo, onde fatores geográficos, climáticos e sócio-econômicos têm contribuído para a manutenção e dispersão dessas doenças. Neste sentido, a América Latina aparece como uma das áreas de maior expressão por esses agravos, onde o Brasil, na América do Sul, assim como, o Panamá e Honduras, na América Central, apresentam uma situação epidemiológica das mais importantes, em razão de determinadas peculiaridades relacionadas não só à capacidade antigênica das espécies de Leishmania, como também, à interação dessas espécies com a resposta imune do homem, resultando em processos imunopatogenéticos que podem confluir para leishmaniose tegumentar ou leishmaniose visceral sistêmica. No caso da leishmaniose tegumentar americana (LTA), chama atenção a complexidade do processo imune-biológico envolvendo, nada menos, que sete espécies de Leishmania atuando como agentes da doença no Brasil. No Panamá, embora a L. (V.) panamensis seja a principal espécie associada à doença, há envolvimento também da L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana e L. (L.) colombiensis. Como resultado desse processo, observa-se uma diversidade de formas clínicas que serão investigadas através da expressão gênica e da marcação fenotípica in situ, buscando-se um melhor entendimento dos fatores de sinalização celular e do perfil de citocinas das respostas imunes, inata e adaptativa, associadas a essas formas da doença.Por outro lado, embora a leishmaniose visceral americana (LVA) represente o alvo de maior interesse na interação entre a Leishmania (L.) infantum chagasi e a resposta imune do homem, não há dúvida de que não podemos negligenciar as outras manifestações clínico-imunológicas que decorrem dessa interação e, que, certamente, poderão subsidiar novas estratégias para aperfeiçoar as medidas de controle previamente existentes da LVA. Neste sentido, já mostramos em área endêmica de LVA na Amazônia brasileira, um leque espectral constituído de cinco perfis clínico-imunológicos, três dos quais, já conhecidos na literatura, infecção assintomática, subclínica oligossintomática e sintomática, e dois, infecção subclínica resistente e inicial indeterminada, que representam estágios novos no espectro clínico-imunológico da infecção. Demonstramos, ainda, através de estudo prospectivo da dinâmica da infecção o papel evolutivo de cada perfil da infecção. Desse modo, é fundamental, no momento, esclarecer as bases imunopatogenéticas que sustentam os eventos, não só no sentido da susceptibilidade, como também, da resistência à infecção, as quais poderão subsidiar novas estratégias para aperfeiçoar o controle da LVA através de marcadores imunológicos de susceptibilidade e, o desenvolvimento de antígenos de L. (L.) i. chagasi com capacidade imunogênica protetora contra a infecção. Em Honduras, a situação epidemiológica da doença parece mais inusitada, em razão de uma única espécie, a L. (L.) i. chagasi, ser responsável por casos de leishmaniose visceral americana (LVA) em crianças menores de10 anos, como também, por manifestações cutâneas em adolescentes e adultos jovens. Desse modo, pretende-se, inicialmente, caracterizar o espectro clínico-imunológico da infecção humana por L. (L.) i. chagasi nos casos de infecção sistêmica. Nos casos de manifestações cutâneas, serão avaliados os aspectos imunopatológicos de biópsias submetidas à reação de imunohistoquímica, empregando-se marcadores celulares e intracelulares, objetivando esclarecer as bases imunopatogenéticas responsáveis por estes dois tipos de manifestações clínicas determinadas por L. (L.) i. chagasi em Honduras.

Nas Américas, em especial na América do Sul, a infecção por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi causa manifestações subclínicas e leishmaniose visceral (LV), a qual quando não tratada é potencialmente fatal. Em Honduras a leishmaniose a infecção por L. (L.) infantum chagasi causa a leishmaniose visceral (LV), porém também tem sido relatada a leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCNU) causada por esta espécie do parasito. Relataram-se casos de leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCA), também em outros países da região, como Costa Rica, El Salvador e Nicarágua. Em Honduras, existem áreas endêmicas bem identificadas desta variante clínica não ulcerada, localizadas nos departamentos de Choluteca e Valle, assim como parte sul dos departamentos de Francisco Morazán, La Paz, El Paraíso e Intibucá. Com o objetivo de conhecer melhor a patogenia da infecção causada por esta espécie do parasito na América Central, o presente estudo tem como objetivo principal avaliar a evolução da infecção experimental em hamsters, Mesocricetus auratus por L. (L.) infantum chagasi isolada da forma clínica de leishmaniose visceral clássica e leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, que acometem indivíduos no município de Amapala, Valle, Honduras. Hamsters serão infectados por via subcutânea e intraperitoneal com 107 formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi em fase estacionária de crescimento em cultura, isoladas de casos humanos de leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea atípica. Após 30, 60 e 90 dias pós infecção (PI) os animais serão anestesiados e eutanasiados e fragmentos da pele e visceras (baço, fígado e linfonodo) serão coletados para estudo histopatológico determinação da carga parasitária e avaliação da expressão de citocinas. Sangue total será coletado e os soros utilizados para determinação de anticorpo anti-Leishmania.

Dissertação de Mestrado. Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Fisiopatologia Experimental.

Dissertação de Mestrado. Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Fisiopatologia Experimental.

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é a forma mais grave de leishmaniose. A doença acomete principalmente as células do Sistema Fogocítico Mononuclear (SFM) da medula óssea, linfonodos, baço, fígado, pulmões, intestino e pele, pode ser fatal se não for tratada. A incidência de cerca de 90 dos casos de LV está concentrada em cinco países, entre eles o Brasil. Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de Leishmania sp, constituindo-se o principal elo na cadeia de transmissão da LV, no entanto, a eliminação de cães não tem contribuído para a redução da incidência de LV humana. Em áreas endêmicas, uma parte dos cães adquire a infecção e desenvolve doença imediatamente, uma parte desenvolve doença tardiamente e outra parte dos cães nunca desenvolve doença. Cães assintomáticos exibem resposta imune predominantemente celular, associada ao perfil de resistência da LVC, grupo que constitui fraca fonte de infecção para o vetor da LV. Entretanto, a progressão da imunidade de cães assintomáticos de área endêmica é pouco conhecida. A identificação de marcadores genéticos associados aos diferentes perfis de resposta clínica pode ser útil para a elucidação da genética envolvida na resposta imune protetora e controle da apresentação de sintomas da LVC, além de possibilitar o desenvolvimento de teste prognóstico da LVC e a pesquisa por alvos terapêuticos específicos para o reservatório canino. Portanto, o objetivo do nosso trabalho é avaliar a resposta imune e identificar marcadores genéticos de progressão clínica da LVC em cães do Estado de São Paulo.

Visceral leishmaniasis (VL) is a systemic protozoan infection caused by intracellular Leishmania parasites. The disease is normally fatal in the absence of adequate treatment. An estimated 500,000 VL cases occur annually, over 90 of which are concentrated in the Indian sub-continent, East Africa and Brazil. Although transmission is thought to be zoonotic with dogs serving as reservoir hosts, campaigns aimed at culling infected dogs have failed to make a lasting impact on transmission suggesting the possible contribution of humans as parasite reservoirs for infecting sand flies. Infections in humans range from asymptomatic through subclinical infections full-blown VL. Competent reservoir hosts must be abundant and long lived. The infection should be long enough and non-pathogenic to permit survival of the infected/infective hosts. Sufficient parasite loads should be present in the skin and/or blood to promote high infection rates in biting vectors. The current project will evaluate whether humans living in a VL endemic area, fulfill these criteria. An epidemiological survey in a peri-urban focus Bujarú near Belem will characterize different immunological/clinical profiles (skin test, immuno-fluorescent assay) with respect to VL and verify the physical presence of parasites in the blood by real-time PCR, parasite culture and artificial xenodiagnosis. The data will be used to assess which sub-population contributes most to infection of sand flies. Data will be compared with similar data derived from a project on going in Ethiopia where the disease is caused by L.donovani and is primarily anthroponotic. Results will shed light on the possible role of humans as reservoir hosts of L. infantum (=L.infantum chagasi) in Brazil.

A primeira fase deste projeto visa à caracterização biológica de Leishmania (Viannia) shawi através da curva de crescimento do parasito, estudos morfológicos de formas promastigotas e amastigotas e avaliação de aspectos da evolução da infecção experimental in vitro e in vivo. Posteriormente, pretende-se o isolamento e purificação de antígenos protéicos presentes em formas promastigotas e amastigotas, por HPLC de fase reversa, os quais serão avaliados no desencadeamento da resposta imune em modelos in vivo e in vitro com o objetivo de selecionar bons candidatos para terapias celular e/ou vacinas. Esses antígenos previamente fracionados serão incubados com esplenócitos de camundongos e a períodos experimentais de 24, 48 e 72h, citocinas serão quantificadas. Aqueles antígenos que mostrarem melhor perfil para indução de resposta imunológica Th-1 serão selecionados para análise in vivo. Essas análises serão conduzidas através de testes da quantificação de citocinas em sobrenadante de células de linfonodo de drenagem por ELISA de captura e através de estudos da densidade de células CD3, CD4, CD8, MAC-3 e CD11c marcadas por imunoistoquímica em biópsias dos animais desafiados com L. (V.) shawi. Nesta etapa, será realizada também análise histológica da lesão. Terapia celular, onde camundongos BALB/c previamente infectados com L. (V.) shawi serão tratados com células dendríticas pré-incubadas com os antígenos protéicos que foram capazes de despertar resposta imune celular eficiente será conduzida.

A LTA apresenta largo espectro de manifestações, variando de infecção assintomática e/ou subclínica em indivíduos naturalmente resistentes, até formas sintomáticas em indivíduos susceptíveis, tais como: leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDB), leishmaniose cutâneo-mucosa (LCM), leishmaniose mucosa (LM) e leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCAD), dependendo do agente etiológico envolvido e do tipo da resposta imune (TCD4+ Th1/Th2) do hospedeiro (PEARSON & SOUSA, 1995; SILVEIRA et al., 2004).
Em relação à LVA, apesar do avanço no conhecimento sobre a forma clássica, ainda existem muitas lacunas no que diz respeito à interação do parasita, L. (L.) chagasi, com o sistema imunogenético do homem. O espectro clínico da infecção humana ainda carece de uma definição mais precisa, a fim de aprimorar o diagnóstico clínico dos indivíduos infectados, sintomáticos e/ou assintomáticos, e de se estabelecer condutas de tratamento para as diferentes formas. Para tanto, há necessidade de estudos de campo, de natureza longitudinal, visando identificar os indivíduos portadores da infecção, sintomática e assintomática; e, acompanhar a evolução dos casos por tempo que permita definir os perfis clínico-imunológicos da infecção humana por L. (L.) chagasi. 
A resposta imune da infecção humana por L. (L.) chagasi tem recebido maior atenção nos casos da doença plena do que nos casos da infecção assintomática e/ou subclínica, nos quais os mecanismos de resistência imunológica precisam ser mais bem entendidos.
Os modelos experimentais para LVA, são realizados, principalmente, em hamsters e camundongos, o que não permite extrapolar todos os dados para o homem, face à distância filogenética entre ambos. Há, portanto, necessidade de se estabelecer um modelo animal mais próximo do homem, que permita realizar os ensaios acima citados. Nesse sentido, existem evidências que o Cebus apella, poderia ter potencial como modelo da LVA Além disso, foi demonstrado em um estudo piloto que a infecção in vitro do macrófago peritoneal desse primata não só com a espécie causal da LVA, como também, com espécies responsáveis pela LTA no Brasil, permite estudar a resposta imune das leishmanioses. Assim sendo, esses dois modelos, in vivo e in vitro, utilizando primatas não humanos pode representar uma ferramenta de grande apoio aos estudos sobre a imunopatogenia da LVA e LTA. 
O Projeto se propõe a caracterizar o papel da célula de Langerhans na interação com a resposta imune CD4/CD8 nas diferentes formas clínicas da leishmaniose tegumentar no Brasil, com diferentes espécies de Leishmania na modulação da imunopatogênese da doença, caracterizar o espectro clínico e imunológico da infecção humana por Leishmania (L.) chagasi na Amazônia brasileira, e os respectivos perfis de resposta imune celular e humoral dos indivíduos infectados. 
Pretende, também, avaliar a susceptibilidade do primata Cebus apella como modelo de estudo experimental da leishmaniose visceral, Leishmania (L.) chagasi, e da leishmaniose tegumentar experimental por Leishmania (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis.
Em relação ao modelo experimental murino, pretende analisar a cinética da interação da célula de Langerhans com a resposta imune CD4+/CD8+ em camundongos BALB/C e C57BL/6 por L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis isoladas de diferentes formas clínicas de LTA.
Estudos in vitro serão desenvolvidos para identificar possíveis mecanismos de resistência e de susceptibilidade associados à resposta imune inata do macrófago peritoneal de primatas neotropicais infectado com Leishmaia (V.) braziliensis, L. (L.) amazonensis e L. (L.) chagasi.

Propõe-se fazer a padronização dos achados clínicos e caracterização imunopatológica de cães infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi, através de análise de imunopatologica celular e humoral sistêmica e da pele. Este conhecimento favorecerá o melhor entendimento da interação parasito/hospedeiro e sobre sua relação com a transmissão para o flebótomo. Também será possível diferenciar animais assintomáticos transmissores de não transmissores. Este conhecimento será útil no estudo de eficácia de imunizações caninas e irá subsidiar a elaboração de melhores métodos de controle da doença. Tal conhecimento seria um pré-requisito para avaliar como os mesmos podem ser capazes de modificar a resposta imune canina e impedir a transmissão do parasito ao vetor, conseqüentemente impedindo a infecção humana, o que seguramente representará um avanço para melhor controle desta zoonose.

Avalição do tamanho da lesão e do linfonodo de drenagem de camundongos C57BL/6 infectados com promastigotas de L.(L.)amazonensis na presença do extrato de glândula salivar de Lu.longipalpis, assim como o estudo da dinâmica do processo inflamatório agudo e crônico no ponto subcutâneo de inouclação e fenotipagem das células inflamatórias e detecção de citocinas

Caracterização do efeito das células A-NK em cultura de macrófagos infectados e diretamente em promastigotas de L.(L.)amazonensis, por microscopia ótica, eletônica e recuperação de parasitos em cultura. Avaliação dos mecanismos de lise como dosagem de INF-gama, IL-12 e NO nos sobrenadantes das culturas. Avaliação da evolução da infecção in vivo na presença das células A-NK

A leishmaniose visceral é um problema grave de saúde pública no Brasil havendo referências de que mais de 90% dos casos de leishmaniose visceral americana descritos no Novo Mundo ocorreram em nosso país. Recentemente essa antropozoonose foi diagnosticada no Estado de São Paulo, especificamente na região Noroeste. No Brasil ela é causada pelo protozoário Leishmania (Leishmania) chagasi e transmitida pelo flebotomídeo Lutzomyia longipalpis. Os canídeos silvestres e os cães domésticos são considerados os maiores reservatórios da doença pois vários animais são portadores assintomáticos.
	Os métodos diagnósticos desta doença incluem a pesquisa direta do parasito em esfregaço corado pelo giemsa ou por técnicas de imunohistoquímica, e a pesquisa de anticorpos por métodos sorológicos como o ELISA, imunofluorescência direta e fixação de complemento. 
	O presente trabalho objetiva detectar a acurácea de métodos para o diagnóstico da leishmaniose visceral em cães oriundos de área endêmica da doença.