Ana Paula Lepique.

Câncer apresenta vários mecanismos de imuno evasão e imunomodulação. Várias moléculas solúveis, como citocinas, metabólitos e fatores de crescimento participam desses mecanismos. Porém, há vários anos, observa-se que vesículas extracelulares também podem ter participação nesses processos. Nosso laboratório está investigando se vesículas extracelulares geradas no microambiente tumoral, podem modular o fenótipo e função de leucócitos como macrófagos e linfócitos T e com isso influenciar a progressão tumoral.

Mucosas são ricas em microorganismos que secretam metabólitos, toxinas e que são reconhecidas pelo sistema imune. As interações entre mucosas e o sistema imune envolvem a microbiota. Essas interações influenciam células tumorais e células do sistema imune que podem ou não responder às mesmas. Nosso laboratório identificou bactérias presentes em lesões cervicais de baixo grau, alto grau e câncer. A progressão é correlacionada com a redução das espécies secretoras de lactato e aumento de outras espécies, além de maior variabilidade. Nós estamos estudando o papel de metabólitos como lactato e butirato no processo de transformação de queratinócitos imortalizados, expressando ou não oncoproteínas de HPV16.

Respostas imunes determinam a progressão tumoral. Meu laboratório tem estudados a interação entre tumores associados ao Papilomavírus Humano (HPV) e o sistema imune. No microambiente tumoral, que é influenciado por citocinas, metabólitos e outros fatores, células mielóides podem adquirir fenótipo tolerogênico e inibir a atividade de linfócitos T. Tumores também podem apresentar efeitos sistêmicos, como leucocitose. Nós demonstramos previamente que células transformadas por HPV secretam IL-6 e G-CSF e que pacientes com câncer associado ao HPV apresentam aumento do número de células mielóides circulantes. Além disso, nós observamos que nos tumores há correlação negativa entre a frequência de linfócitos T e neutrófilos. In vitro, nós demonstramos que neutrófilos incubados com células tumorais são capazes de inibir a atividade de linfócitos T. Esse resultado corrobora a hipótese de um microambiente tumoral tolerogênico. Interessantemente, nós demonstramos que macrófagos diferenciados a partir de monócitos no microambiente tumoral assumem fenótipo com viés para M2, em parte devido ao lactato secretado pelas células tumorais. Dessa forma, trabalhamos com a premissa de que o microambiente tumoral sinaliza sistemicamente para induzir acúmulo de células mielóides, que são recrutadas pelo mesmo, e assumem fenótipo tolerogênico, facilitando o crescimento tumoral. O projeto aqui proposto tem como objetivo investigar os mecanismos moleculares das interações entre células tumorais e mielóides de doadores saudáveis e com câncer. Nós esperamos identificar oportunidades terapêuticas para pacientes com câncer associado ao HPV, e eventualmente, outros tumores ricos em células mielóides.

Infecção por HPV, Papilomavírus Humano, é o principal fator etiológico para o desenvolvimento do câncer do colo uterino. Porém, embora obrigatória, a infecção por esse vírus não é suficiente para o processo de carcinogênese. Vários fatores podem influenciar o processo de carcinogênese, entre eles, alterações na microbiota, que podem alterar o ambiente inflamatório local. Com isso, estamos caracterizando as bactérias presentes no trato genital feminino de pacientes com lesões de baixo e alto grau, associadas ao HPV.
Identificadas bactérias que são mais frequentes em cada tipo de lesão, iniciaremos estudos in vitro, fazendo culturas organotípicas de queratinócitos humanos, transduzidos ou não com oncogenes de HPV, e testaremos exposição dessas culturas às diferentes bactérias encontradas no estudo. Serão avaliados parâmetros de viabilidade e proliferação celular, indução de vias de sinalização envolvidas em respostas inatas e inflamatórias, e mais à frente, testaremos co-culturas com células do sistema imune, como macrófagos e linfócitos T para verificar o efeito da combinação de bactérias e HPV sobre o fenótipo dessas células.

Esse é um projeto em colaboração com uma start up de Boston, onde drogas desenvolvidas pela empresa Nirogyone Therapeutics serão testadas em modelos de co-cultura de células tumorais e macrófagos desenvolvidos no nosso laboratório. O objetivo é bloquear a saída de metabólitos das células tumorais através de inibidores de MCTs e verificar o efeito disso no fenótipo e atividade dos macrófagos.

Nosso laboratório tem pesquisado as interações entre células tumorais e inflamatórias e efeitos sistêmicos do tumor no hospedeiro. Nosso foco principal tem sido tumores associados ao Papilomavírus Humano, HPV. Infecções por HPV são o principal fator etiológico para o desenvolvimento de câncer do colo uterino e outros tumores anogenitais e orofaríngeos. Recentemente, nós caracterizamos diversos efeitos destes tumores em seus hospedeiros: leucocitose, redução da capacidade de apresentação antigênica, redução da ativação de NFB em células apresentadoras de antígenos, APCs. Neste projeto, nós iremos trabalhar com a hipótese de que é possível modular as respostas antitumorais, através de interferência nos processos citados acima. Assim, por um lado, iremos neutralizar citocinas, previamente descritas por nós e outros que podem levar ao fenômeno de leucocitose; ativar a via de NFB em APCs e testar seu potencial de ativação de resposta antitumoral em linfócitos T de pacientes com câncer. Esses estudos complementam diretamente um estudo onde estamos caracterizando o infiltrado inflamatório em lesões do colo uterino de diferentes graus. Nós demonstramos que há um importante infiltrado de neutrófilos nessas lesões, cuja frequência apresenta correlação negativa com a frequência linfócitos T CD8. Nesse projeto, estamos propondo o estudo funcional destes neutrófilos, e teste da hipótese de que sua função pode ter efeito na progressão tumoral e risco de recidiva. Todos os resultados obtidos nesse projeto poderão, potencialmente, ser extrapolados para outros tumores associados ao HPV e tumores com outras etiologias.

A progressão de lesões cervicais do grau I para III (NIC I para NIC III) envolve alterações teciduais bem descritas. A maior parte das neoplasias cervicais grau I regridem espontaneamente, enquanto que a maior parte das neoplasias grau III progridem para câncer invasivo. Enquanto a infecção por Papilomavírus Humano é o principal fator etiológico para o desenvolvimento dessas lesões e câncer do colo uterino, o papel de outros fatores, incluindo as respostas celulares e imunes do hospedeiro ainda não foram bem caracterizadas.
Inflamação e estresse oxidativo sabidamente apresentam papel importante na progressão de uma série de tipos de câncer em humanos. Esse projeto estuda se há associação desses processos com a progressão de lesões do colo uterino.
O estudo irá inicialmente estudar o perfil de expressão gênica de NIC I e NIC III através de RT-PCR em tempo real e depois validar os resultados em amostras retrospectivas de lesões do colo uterino.

Nosso laboratório identificou, através da metodologia de "Peptide Phage Display", um peptídeo de sequência similar a enzima alfa-manosidase em tumores associados ao Papilomavírus Humano, indicando que um dos substratos dessa enzima pode ter expressão abundante nesses tumores. Também observamos em células tumorais e biopsias de carcinoma do colo uterino expressão de alfa-manosidade significativamente maior do que em tecidos normais ou células imortalizadas. Alfa-manosidade está envolvida na atividade de macrófagos e modificação de proteínas em vários tipos celulares. 
Esse conjunto de informações e resultados nos levou a levantar a hipótese de que alfa-manosidase possa ser um alvo terapêutico para tumores. Com isso, estamos conduzindo testes de inibição da atividade dessa enzima, in vivo e in vitro, e investigando proliferação celular, crescimento tumoral, qualidade e quantidade do infiltrado inflamatório em tumores.

Macrófagos e células dendríticas apresentam receptores de membrana(PRRs) que reconhecem estruturas microbianas, a família de receptores toll-like sendo os receptores prototípicos deste grupo. Outro grupo de PRRs reconhece moléculas e células próprias alteradas tais como lipídeos oxidados e células mortas e, deste grupo, o CD36 é o receptor mais estudado. A estimulação destes receptores induz a síntese imediata de mediadores lipídicos (prostaglandinas,leucotrienos e PAF), transcrição de genes para citocinas e outros, culminando em uma resposta celular. Nossa hipótese de trabalho é que a ativação autócrina de receptores para mediadores lipídicos em associação com a ativação de PRRs modifica o fenótipo de macrófagos e células dendríticas, com importantes conseqüências em infecção, crescimento tumoral e remoção de células alteradas. No presente estudo nos propomos a investigar o efeito da associação: a) PAFR/CD36 nas células do microambiente tumoral; b) PAFR/CD36 na imunossupressão associada a tumores; c) PAFR/CD36 na resposta de tumores a quimioterapia e irradiação; d) PAFR/TLR4 em células dendríticas e na resposta imune in vivo; e) PAFR e receptor para LTB4 com os vários TLRs no fenótipo de macrófagos; f) receptor para LTB4/TLR4 em macrófagos e seu efeito na inflamação e resistência a infecção em diabéticos.

Esse estudo irá comparar o perfil de expressão de genes relacionados a estresse oxidativo e resposta imune em pacientes que sofreram procedimento excisional para retirada de câncer ou lesão de alto grau do colo uterino, e continuaram positivas para HPV. Serão comparadas pacientes com e sem recidiva, por um período de 5 anos, buscando-se identificar marcadores prognósticos para recidiva.

Busca de moléculas expressas preferencialmente em tumores do colo uterino, através da metodologia de "peptide phage display" que possam ser utilizadas como marcadores de progressão, diagnóstico ou alvos terapêuticos.

Estudo das interações entre tumores associados ao Papilomavírus Humano e respostas imunes do hospedeiro