Vanessa Soares Lara.

Emissão de laudos histopatológicos, em um número que varia de 20 a 40 por mês, para a FOB, bem como clínicas privadas e outras Instituições Odontológicas em Bauru e região (SUS), e muitas vezes clínicas e universidades de outros estados do Brasil, como consultorias histopatológicas.

O verniz fotopolimerizável à base de metilmetacrilato é um material odontológico utilizado para selar superfícies internas de próteses dentárias (totais ou parciais removíveis), que visa a redução do acúmulo de placa microbiana sobre esta superfície. Entretanto, a literatura aponta que o verniz apenas melhora a macro e a microestrutura da superfície da resina acrílica, mas não possui capacidade de interferência na adesão microbiana e inibição da formação do biofilme. Neste sentido, compostos bioativos, como prata ou zircônio, com potencial antimicrobiano e anti-biofilme têm sido estudado para o tratamento e prevenção da estomatite protética, uma das formas mais comuns de candidose oral localizada. A nanotecnologia contribui para o aperfeiçoamento dos materiais através da encapsulação de compostos em sistemas nanoparticulados. Assim, a incorporação de nanopartículas carregadas de prata no verniz agregaria a este material um potencial antimicrobiano e antiaderente contra C. albicans. Além disso, um verniz funciona como um bom veículo para manter as nanopartículas atuando temporariamente sobre a superfície de resina das próteses removíveis, resultando em uma proposta alternativa na terapia e prevenção da EP.
Avaliaremos ainda a ação de nanopartículas de prata sobre biofilmes mistos (fungos e bactérias)
Este projeto envolve um Pós-doutorado e uma dissertação de Mestrado..

Este estudo pretende estudar in vitro se o fármaco fitoterápico Punica granatum, na forma de nanopartículas (Pg nano), apresenta potencial antifúngico, influenciando o desenvolvimento de biofilme fúngico, e se altera os mecanismos imunes que envolvem as candidoses, com enfoque na relação entre Candida albicans (C. albicans) e células do hospedeiro, bem como na forma mais frequente de candidose bucal, a estomatite protética (EP). Especificamente, este estudo tem como objetivo avaliar se Pg nano: 1) apresenta potencial antifúngico, por meio da inibição do crescimento fúngico e/ou da interferência nos mecanismos fúngicos de aderência e invasão tecidual (atividades anti-invasiva e antiaderente); 2) interfere na viabilidade de células imunes, e 3) na resposta imunoinflamatória destas células frente a infecção por C. albicans. As células humanas avaliadas serão células humanas epiteliais, fibroblastos gengivais e monócitos/macrófagos. A análise antimicrobiana será realizada por meio do ensaio de redução de sais de tetrazólio-XTT, e da contagem de unidades formadoras de colônia (CFU/mL). As atividades anti-invasiva e antiaderente serão avaliadas por meio da expressão de genes relacionados (RT-qPCR). As células humanas serão submetidas ao ensaio de citotoxicidade, utilizando-se o reagente Alamarblue. A atividade anti-inflamatória será avaliada frente aos estímulos C. albicans, através da expressão de genes relacionados (RT-qPCR), quanto à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por meio da marcação fluorescente utilizando o reagente Cell Rox Deep Red; quanto à produção de espécies reativas do nitrogênio (NO) por meio da reação de Griess; e quanto à produção de citocinas por meio do método MILLIPLEX. Pretendemos obter um melhor entendimento sobre a influência deste fungo nestes sistemas intracelulares, bem como sobre os possíveis alvos de atuação do fitoterápico nanoparticulado na frente anti-inflamatória. Paralelamente, pretendemos verificar a citotoxicidade do fitoterápico nanoparticulado, uma vez que pretendemos sugerir possibilidades preventivas e/ou terapêuticas para a doença oral localizada, a EP. Os resultados serão submetidos à análise estatística no software Statistica, com testes de normalidade e homogeneidade para definição do uso de análise paramétrica ou não-paramétrica, sendo considerados diferentes quando p<0,05. As melhores concentrações de Pg nano, selecionadas pelos métodos acima, serão incorporados a um verniz fotopolimerizável, o qual será distribuído sobre a superfície de corpos de prova de resina acrílica termopolimerizável. Na sequência, será desenvolvido um biofilme de C. albicans sobre esta superfície. A atividade anti-biofilme (objetivo 4) in vitro desta associação (Pg nano+verniz) será avaliada pela quantificação por meio do ensaio de redução XTT e pela análise do volume do biofilme por microscopia confocal de varredura a laser .Nossa expectativa é que as PG nano apresentem uma ação anti-fúngica maior que aquela revelada a partir do extrato bruto do fitoterápico tanto in vitro quanto in vivo, e capacidade anti-inflamatória sobre células humanas. Quanto à citotoxicidade, uma vez que o extrato bruto manteve a viabilidade de células epiteliais e fibroblastos in vitro, e não foi citotóxico em modelos in vivo, provavelmente não será tóxico na sua forma nanoparticulada, incluindo sobre monócitos e macrófagos.Espera-se ainda que o fitoterápico nanoparticulado mantenha suas ações benéficas após sua incorporação em um verniz de uso clínico em prótese dentária. Considerando um resultado bem-sucedido, avaliaremos a manutenção das propriedades inerentes do biomaterial inovado; e, na sequência, um estudo in vivo com dispositivos intraorais de acrílico, contendo o verniz incorporado de Pg nano na superfície interna, simulando o uso de próteses totais. Este projeto envolve um Pós-Doutorando.

Este estudo abrange parte dos objetivos propostos no subprojeto ?Influência do sistema renina-angiotensina na resposta imunoinflamatória e na ação antimicrobiana frente a Candida albicans?, o qual propõe avaliar in vitro se fármacos que afetam o sistema renina-angiotensina, como Alisquireno, Punica granatum e Losartan, apresentam também alguma influência nos mecanismos imunopatológicos desencadeados nas candidoses, em especial na forma mais frequente de candidose bucal, a estomatite protética (EP). Neste contexto, considerando que a EP é uma doença inflamatória associada à formação de biofilme na superfície interna de próteses bucais por Candida albicans (C. albicans) (1), que o sistema renina-angiotensina (SRA), especialmente o SRA local, constitui também um importante mediador da inflamação, sendo a angiotensina II (ANG II) uma molécula pró-inflamatória cujos receptores foram detectados em inúmeras células imunes (2, 3), bem como que C. albicans produz enzimas da mesma classe das reninas, alvo de drogas que afetam o SRA (4), o presente projeto objetiva, especificamente, avaliar in vitro os efeitos dos fármacos anti-hipertensivos e antiinflamatórios citados sobre: 1) a resposta imunoinflamatória de monócitos humanos frente o estímulo com C. albicans; 2) os mecanismos patogênicos desenvolvidos pelo fungo e relacionados aos processos de aderência e invasão em células do hospedeiro; 3) a viabilidade fúngica, determinando-se, consequentemente, a menor concentração destes fármacos capaz de inibir o crescimento fúngico.O estudo envolve atualmente um projeto de Pós-doutorado.

Trata-se de um projeto com 3 subprojetos no contexto de uma solicitação concedida pela FAPESP - modalidade TEMÁTICO (15/03965-2), em parceria com os Profs Drs Carlos Ferreira dos Santos e Sandra Helena Penha de Oliveira. O projeto sob minha responsabilidade intitula-se &quot;Influência do sistema renina-angiotensina na resposta imunoinflamatória e na ação antimicrobiana frente a Candida albicans&quot;, o qual pretende estudar in vitro se fármacos, que afetam o sistema renina-angiotensina, como Alisquireno, Punica granatum e Losartan, apresentam também alguma influência nos mecanismos imunes que envolvem as candidoses, com enfoque na relação entre Candida albicans e células do hospedeiro, bem como na forma mais frequente de candidose bucal, a estomatite protética. Especificamente, este estudo tem como objetivo avaliar in vitro se os fármacos citados interferem: 1) na resposta imunoinflamatória celular frente a infecção; 2) nos mecanismos de aderência e invasão do fungo em células humanas; 3) na produção intracelular de ROS; 4) na viabilidade celular. Ainda, estabelecer a menor concentração dos fármacos capaz de inibir o crescimento fúngico. As atividades antiaderente e anti-invasiva serão avaliadas por meio da expressão de genes relacionados (RT-qPCR) e do perfil proteômico (espectrometria de massas). A atividade anti-inflamatória será avaliada a partir de células epiteliais de palato humano (CEPH), monócitos humanos e fibroblastos gengivais humanos (FGH), considerando os estímulos C. albicans ou LPS. Tais células serão analisadas quanto à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), por meio da marcação fluorescente utilizando o reagente Cell Rox Deep Red, bem como quanto a expressão de genes relacionados e perfil proteômico. A análise antimicrobiana será realizada por meio do ensaio de redução de sais de tetrazólio-XTT, permitindo determinar o nível de atividade metabólica das células viáveis e, por fim, da concentração inibitória mínima (CIM). Os fármacos serão analisados ainda quanto a citotoxicidade sobre CEPH, monócitos humanos e FGH, por meio do ensaio colorimétrico MTT. Os resultados serão submetidos à análise estatística no software Statistica, com testes de normalidade e homogeneidade para definição do uso de análise paramétrica ou não-paramétrica.

Evidencias científicas mostram uma relação entre as células-tronco de câncer (CSC) e o processo de transição epitélio-mesenquimal (TEM) no carcinoma epidermóide (CEC) de boca, de forma que a subpopulação de CSC apresenta maior potencial metastático quando comparada com as demais células tumorais. Sabe-se que o processo de TEM é estimulado durante a hipóxia e por citocinas inflamatórias, que correspondem a eventos ambientais comuns nos tumores. Considerando-se o microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (MAT) têm contribuição significativa no comportamento das células tumorais. Nesse contexto, o objetivo deste estudo é analisar a presença de macrófagos e sua distribuição no microambiente tumoral, bem como a sua relação com a capacidade invasiva da subpopulação de CSC presentes na linhagem SCC9 de carcinoma epidermóide de boca. Inicialmente, os MAT serão identificados por meio de imuno-histoquímica em amostras teciduais parafinadas e, posteriormente, correlacionados com o processo de invasão tumoral e metástase. Adicionalmente, MAT obtidos de espécimes frescos de CEC de boca serão isolados por meio de cell sorting e seu perfil de citocinas correlacionado com dados clinico-patológicos. Por fim, os MAT serão cultivados conjuntamente com frações celulares isoladas da linhagem tumoral SCC9 (CD44highESAhigh e CD44highESAlow), a fim de se investigar a relação funcional entre MAT, CSC e fenômeno de TEM, utilizando-se ensaios de co-cultivo indireto e ensaios de invasão. A final do estudo, espera-se evidenciar a influência dos MAT na capacidade invasiva da subpopulação de células-tronco tumorais em carcinoma epidermóide de boca.

No Brasil, cerca de 15.290 novos casos de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC) estão previstos para 2015. Em 2012, mesmo com o tratamento de primeira linha, dos mais de 40 mil casos estudados, cerca de 50% foram previstos para ter recorrência ou metástase, com uma sobrevida global média de cerca de 10 meses, sendo este câncer, considerado um problema de saúde pública em todo o mundo. Recentemente, a subpopulação denominada como células iniciadoras tumorais ou células-tronco tumorais (CSC), vem sendo apontada como um dos principais responsáveis pela falha do tratamento, recorrência e metástases. Acredita-se também que, além de serem responsáveis pelas metástases e recidivas na maioria dos pacientes, as CSC são o motivo da ineficácia dos métodos de tratamento convencionais para o câncer, uma vez que essa subpopulação apresenta mecanismos de defesa contra a ação da radioterapia e de quimioterápicos. Um dos mecanismos de escape dessas células é sua maior resistência aos danos ao DNA, exibindo maior expressão de proteínas antiapoptóticas (Bcl2) e de bombas transportadoras de drogas (ABCB1 e ABCG2), que funcionam como transportadores de quimioterápicos para fora das células. Um dos tratamentos de primeira linha para esses casos é a associação de anticorpos monoclonais com a droga quimioterápica 5-Fluouracil (5-FU). Entretanto, além de não demonstrar grande eficácia, reações adversas como anemia, neutropenia, trombocitopenia, alterações cutâneas e sepse diminuem consideravelmente a qualidade de vida, além de aumentar o risco de doenças relacionadas à imunodepressão. Desta forma, a utilização da quimioterapia metronômica apresenta-se como alternativa por manter níveis séricos eficazes da droga sem desenvolver resistência à mesma. De forma complementar, diferentes compostos com atividades biológicas vêm sendo associados a inúmeros efeitos antitumorais e/ou imunomoduladores. O cogumelo Ganoderma lucidum (GL) apresenta, dentre suas inúmeras propriedades, a capacidade de evitar a invasão de células tumorais e estimular a resposta imune, sendo capaz de agir nas proteínas ABC de HNSCC e de facilitar a sensibilização dessas células quanto à quimioterapia. Desta forma, o objetivo principal deste estudo é avaliar, in vitro, os efeitos do fitoterápico Ganoderma Lucidum sobre a ação antitumoral de baixas doses de 5-FU na subpopulação de células-tronco tumorais presentes na linhagem SCC9 de carcinoma espinocelular de boca. Resultados preliminares revelaram que baixas doses do quimioterápico influenciaram importantes propriedades tumorais das células SCC9, resultando em diminuição do potencial in vitro de formação de esferas e de holoclones. Além disso, estas células tratadas com 5-FU mostraram núcleo e perímetro aumentados, bem como maior expressão do fenótipo CD44high/ESAhigh por meio de FACS. Especulamos que o tratamento quimioterápico direcione as células tronco tumorais para um fenótipo epitelial, portanto menos migratório e menos agressivo, podendo ser considerado promissor para o tratamento do carcinoma espinocelular de boca. Atualmente, estamos desenvolvendo os experimentos que envolvem o sinergismo entre o 5-FU e o Ganoderma, a fim de obter as menores doses possíveis de ambos, com resultados anti-tumorais efetivos.&#10;O estudo envolve um projeto de Pós-doutorado.

O processo biológico de transição epitélio-mesenquimal (EMT) tem sido estudado em metástases de carcinomas epidermóides de boca (CEB), mas raramente é avaliado em vários estágios da carcinogênese bucal. O objetivo deste estudo foi analisar a presença de proteínas SNAIL e E-caderina, marcadores de EMT, no desenvolvimento e progressão do CEB, avaliando espécimes excisadas &#8203;&#8203;de lesões potencialmente malignas (leucoplasia oral com e sem displasia-LOD e LO, respectivamente), tumor (CEB), linfonodos metastáticos (NL) e mucosa oral normal (MON) por imunohistoquímica, considerando a localização subcelular. Adicionalmente, os transcritos de SNAIL e E-caderina foram avaliados in vitro por qPCR, usando linhagem celular SCC-9 em comparação com queratinócitos humanos (QH). Houve um aumento significativo na expressão nuclear de SNAIL de MON para LOD seguido por uma diminuição notável na expressão nuclear acompanhada de expressão citoplasmática aumentada em CEB (p <0,05). A expressão citoplasmática da E-caderina foi notável e estatisticamente significante maior no CEB e NL, tanto em relação ao MON (p <0,0001), LO (p <0,01) e LOD (p <0,0001 e p <0,001, respectivamente). In vitro, os transcritos da E-caderina e do SNAIL foram menores no SCC-9 em comparação aos QH, embora apenas a diminuição da E-caderina tenha sido estatisticamente significativa (p <0,05). Em relação à associação da expressão da E-caderina e do SNAIL com os achados clínicos, a análise revelou associação entre a expressão citoplasmática do SNAIL e o padrão de invasão (p = 0,05) no CEB. A expressão nuclear aumentada de SNAIL pode ser característica das LOD, e a presença de E-caderina no citoplasma pode ser um marcador de transformação maligna de leucoplasias orais potencialmente malignas para CEB.

A estomatite protética (EP) é uma doença inflamatória crônica comum entre usuários de próteses removíveis, principalmente totais superiores, acometendo a mucosa bucal que está em contato direto com o material resinoso das próteses. A EP está fortemente associada com a presença de Candida albicans (C. albicans), sendo considerada uma das formas de candidose orofaringeana. Um grande número de leveduras é geralmente encontrado na superfície interna de resina termopolimerizável destas próteses, a qual atua como um reservatório de microrganismos (biofilme protético). Produtos naturais têm provado ser uma alternativa para se associar sinergicamente com substâncias químicas sintéticas, e o interesse em plantas medicinais como uma fonte de agentes antimicrobianos tem crescido imensamente. Uma ampla variedade de extratos de plantas tem apresentado atividade antifúngica contra biofilmes de C. albicans, assim como bactericida contra microrganismos do biofilme da placa dental, prevenindo a sua formação. &#10;Considerando que as plantas medicinais podem desempenhar um papel importante no tratamento da EP, estamos estudando formas de incorporar o extrato/fração do fitoterápico Equisetum giganteum e Punica granatum (isolados ou associados a nistatina) a materiais odontológicos, como os reembasadores resilientes e condicionadores teciduais, utilizados para o revestimento temporário de próteses removíveis bucais, principalmente superiores, bem como ao adesivo fixador de próteses totais Ultra Corega®. Interessa-nos comprovar a atividade antimicrobiana, anti-inflamatória e antiaderente destes materiais modificados (pela adição dos fármacos); e avaliar a citotoxicidade in vitro dos mesmos sobre células epiteliais de palato humano, fibroblastos e macrófagos humanos. Ainda, avaliaremos, nos materiais que apresentarem os melhores resultados, se houve alterações na sua superfície causadas pela incorporação dos fitoterápicos, as quais poderiam inviabilizar o uso clínico.&#10;De acordo com resultados recentemente obtidos, os biofilmes de Candida albicans, induzidos na superfície de resina acrílica termopolimerizável tratada com o adesivo Ultra Corega® adicionado de Punica granatum, foram reduzidos em número, volume e metabolicamente, em comparação a resina tratada apenas com o adesivo. Isso fortalece a importante ação antifúngica deste fitoterápico, o que nos motiva na busca de propostas inovadoras envolvendo a adição de produtos naturais antimicrobianos a materiais protéticos de uso rotineiro na clinica odontológica, para fins terapêuticos ou preventivos para a estomatite protética.&#10;Em paralelo, estamos iniciando ensaios com o propósito de avaliar o potencial antifúngico de Punica granatum (romã) em animais submetidos à indução experimental de candidose sistêmica (lagartas) ou localizada (camundongos). Dados recentes, mas ainda preliminares, têm revelado um importante benefício desta planta, com regressão da doença induzida, incluindo recuperação clínica evidente. Entretanto, estudos adicionais e complementares são necessários para um raciocínio mais seguro e conclusivo. Na sequência, pretendemos transformar nosso extrato de romã em nanopartículas, repetir os principais ensaios, após uma rigorosa seleção, incorporar tais nanopartículas em materiais odontológicos protéticos e iniciar ensaios clínicos. Futuras patentes são desejadas e serão então estudadas para a viabilização por meio da agência USP de Inovação.

Este trabalho objetiva estudar o papel dos mastócitos na encefalomielite autoimune experimental (EAE), uma vez que estas células imunes também residem no sistema nervoso central e parecem contribuir para os processos inflamatórios envolvidos na patogênese da Esclerose Múltipla. A EAE representa o principal modelo experimental de estudo para a Esclerose Múltipla, uma doença neurológica com dano axonal e desmielinização no sistema nervoso central devido a uma resposta autoimune mediada por linfócitos Th1, Th17 e T citotóxicos. A nossa equipe acredita na hipótese que substâncias inibidoras de mastócitos podem afetar o desenvolvimento da EAE. Na linha de pesquisa sobre EAE, da Profa. Sartori, minha parceria institucional deu-se por meio da co-orientação do Doutorado da aluna Karen H. Pinke, pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Instituto de Biociências da UNESP ? Campus Botucatu. Este projeto de pesquisa envolveu camundongos submetidos à indução experimental da EAE e tratados com fumarato de cetotifeno. O efeito do tratamento foi determinado pela avaliação de peso corporal, escore clínico, de células imunes periféricas, incluindo sua expressão gênica e produção de citocinas, e das amostras de sistema nervoso central. De fato, o tratamento com cetotifeno resultou em proteção do animal com relação à doença, caracterizada por menor perda de peso, ausência/discreto escore clínico, ausência ou redução da inflamação no SNC e ativação reduzida de micróglia. A presença de linfoadenomegalia e a manutenção da função da barreira hematoencefálica nos animais tratados sugere que o efeito protetor do cetotifeno se deve, pelo menos em grande parte, ao bloqueio da migração dos linfócitos periféricos ao SNC.

O rápido crescimento da população idosa constitui uma das maiores preocupações da sociedade moderna o que demanda um aumento no interesse das condições de saúde relacionadas com a resposta imunológica. Uma das infecções que afetam os idosos é a candidose que pode ser causada por diferentes espécies de Candida, mas, principalmente por Candida albicans. Os macrófagos exercem funções essenciais no combate a microrganismos sendo que um dos mecanismos utilizados frente a estes são o processo fagocítico e a produção de óxido nítrico (NO), além de desempenharem a função imunomodulatória através da liberação de diferentes citocinas que recrutam e ativam leucócitos. Apesar de alguns dados serem contraditórios, indivíduos idosos apresentam alterações no processo de fagocitose, na produção de citocinas e de intermediários reativos de nitrogênio (RNIs) pelos macrófagos em comparação com os jovens. Uma vez esses fatores comprometidos, o combate aos agentes agressores é dificultado e ou ineficaz fazendo com que estas disfunções ocasionem problemas clínicos. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho é investigar a atividade de macrófagos humanos de idosos e jovens, com relação à capacidade fagocítica e a produção de óxido nítrico (NO) e de citocinas pró e anti-inflamatórias como, interleucina-10 (IL-10), IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-&#945;), frente ao estímulo, in vitro, com C. albicans. Para isso, serão obtidos macrófagos humanos a partir de monócitos, os quais serão cultivados na presença de diferentes concentrações de C. albicans, viáveis ou mortas pelo calor. O sobrenadante será coletado para dosagens de NO pelo método de Griess e de citocinas pelo ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA). Para o ensaio de fagocitose, os macrófagos humanos desafiados com leveduras de C. albicans serão avaliados por fluorometria e citometria de fluxo. Os resultados serão expressos como média ± desvio padrão (SD) dos valores obtidos para cada grupo, e analisados por

Candida albicans são organismos comensais que geralmente não causam danos aparentes, contudo, sob certas condições, o fungo pode tornar-se patogênico. Este fungo está relacionado com uma doença inflamatória em usuários de próteses removíveis, denominada estomatite protética, acometendo principalmente palato. A expressão dos genes, ALS1, ALS2, ALS3 e HWP1 deste fungo estão relacionadas à adesão das células fúngicas às do hospedeiro e a resina termopolimerizável. Na terapêutica desta patologia, pode ser ineficaz somente a eliminação desses patógenos na cavidade bucal através de antifúngicos locais ou sistêmicos, se os tecidos bucais estiverem constantemente em contato com uma prótese contaminada. Assim torna-se necessário a busca por tratamentos alternativos que sejam direcionados à prótese e não à mucosa e que produzam menos efeitos colaterais e danos ao paciente e à prótese que os métodos convencionais, como por exemplo, o uso de fitoterápicos. Deste modo, o objetivo deste trabalho será estudar a ação fitoterápica do Equisetum giganteum sobre C. albicans e descartar sua ação citotóxica sobre o palato humano bem como sobre monócitos humanos. Para tal, serão avaliados in vitro o potencial antimicrobiano, antiinflamatório e a atividade antiaderente de frações específicas do fitoterápico sobre C.albicans por meio da Concentração Inibitória Mínima, da análise da produção de óxido nítrico por monócitos humanos, e pelo estudo da viabilidade fúngica e expressão gênica (ALS1, ALS2, ALS3 e HWP1) no biofilme induzido sobre corpos de resina termopolimerizável. Será avaliada ainda a citotoxicidade destas frações sobre células epiteliais de palato humano e sobre monócitos in vitro por meio do ensaio colorimétrico MTT. A expressão dos resultados e os testes estatísticos serão aplicados de acordo com a presença ou não de normalidade nas avaliações (p<0.05).

Os receptores de reconhecimento de padrões da imunidade inata são importantes aliados na defesa contra patógenos por reconhecerem estruturas conservadas nos microrganismos e desencadearem vias de sinalização, como NF-ºB. Esta via pode ser desencadeada pela ligação dos receptores TLR2 e dectina-1 aos seus ligantes, como a fosfolipomanana e os ²-glucanos encontrados na parede celular de Candida albicans (C. albicans), um fungo comum nas mucosas do trato gastrointestinal, incluindo cavidade bucal, que pode ocasionar candidose local ou invasiva, principalmente em estados de imunossupressão. Os mastócitos possuem estes receptores em sua membrana celular e residem nas interfaces com ambiente podendo constituir umas das primeiras linhas de defesa contra este fungo. Seus mecanismos imunes incluem síntese e secreção de mediadores, apresentação de antígenos, bem como atividades fagocitárias e microbicidas. Todos estes mecanismos de defesa podem ser desencadeados de forma independente ou cooperativa entre os receptores TLR2 e dectina-1. Deste modo, pretendemos avaliar in vitro a ocorrência de fagocitose, a geração de ROS e de RNS, a expressão dos receptores TLR2 e dectina-1 e do fator de transcrição NF-ºB pelos mastócitos desafiados ou não com C. albicans. Pretendemos avaliar ainda a participação do TLR2 e dectina-1 nesses eventos. Para isto, serão desafiados por C. albicans mastócitos diferenciados da medula óssea de camundongos selvagens ou TLR2-/-, bloqueados ou não com anticorpos específicos anti-dectina-1 e os eventos analisados por microscopia confocal, métodos de Griess, DCFH-DA, MCLA e DAF-2-DA, citometria de fluxo e ensaio para fator de transcrição nuclear. A expressão dos resultados e os testes estatísticos serão aplicados de acordo com a presença ou não de normalidade nas avaliações (p<0.05).

As alterações quantitativas e/ou qualitativas em componentes celulares e moleculares do sistema imunológico, em função da idade, são denominadas de imunossenescência. Alguns estudos têm demonstrado que o exercício físico é capaz de causar importante melhora na resposta imunológica, em especial na capacidade fagocítica de macrófagos e na quantidade de monócitos e leucócitos circulantes. Porém, há controvérsias se tal benefício abrange os indivíduos idosos. Assim, este trabalho tem o objetivo de avaliar o efeito do exercício físico crônico na resposta inflamatória da população idosa, com enfoque na melhora da capacidade fagocítica dos macrófagos. Será aplicado um protocolo de exercício físico crônico aeróbio de natação, por três vezes na semana, durante oito semanas consecutivas, em dois grupos distintos de ratos (n=15) da linhagem Wistar: Grupo Jov (Jovens); Grupo Id (Idoso); Os animais jovens terão 60 dias e os idosos 14 meses. A partir da coleta do lavado peritoneal coletado dos mesmos, os macrófagos serão separados e cultivados in vitro para o ensaio de fagocitose contra Escherichia coli e Candida albicans marcadas com FITC. Posteriormente, as células com microrganismos internalizados serão quantificadas em microscopia de fluorescência.

As lesões periapicais são as patologias odontogênicas apicais mais frequentemente diagnosticadas em dentes humanos, sendo o fator etiológico principal a presença e colonização de microrganismos dentro do sistema de canais radiculares. Um dos microrganismos encontrados frequentemente nos dentes tratados endodonticamente e com lesão periapical é Enterococcus faecalis (E. faecalis). Entre as células do sistema imunológico, presentes nas lesões periapicais, os macrófagos e os linfócitos, são as mais observadas nos cortes histológicos e são encarregadas de destruir os microrganismos. O presente estudo, objetiva avaliar a capacidade fagocítica e imunomodulatória de macrófagos humanos frente a diferentes cepas de E. faecalis, submetidas ou não ao estresse alcalino. Os macrófagos serão obtidos a partir da cultura de monócitos do sangue periférico humano de voluntários saudáveis. As cepas de E. faecalis, utilizadas durante o desafio, serão duas ATCC® (29212TM e 4083TM), e ainda uma cepa clínica isolada a partir de dentes de pacientes com lesão periapical primária. Pouco se sabe sobre a interação dos macrófagos frente a E. faecalis oriunda dos tecidos pulpar e periapical de dentes com lesão apical, tornando-se de fundamental importância determinar aspectos da resposta destas células frente a bactérias envolvidas nestas lesões.

Os mastócitos (MCs) estão presentes tanto no periodonto normal quanto inflamado, em diferentes quantidades e em vários locais. Nos últimos anos, a eficácia e a contribuição dos MCs em eliminar bactérias, através de sua atividade microbicida intracelular, estão se tornando cada vez mais reconhecidas. Assim, a partir de MCs murinos desafiados in vitro com o periodontopatógeno Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 29523) por 3, 5, 10 e 24 horas, o presente estudo teve como objetivo investigar a capacidade microbicida intracelular de MCs, e comparar com a capacidade microbicida de macrófagos peritoneais murinos (MPs), considerados fagócitos profissionais, por meio da contagem das unidades formadoras de colônias. Além disso, avaliou-se a produção e liberação de mediadores microbicidas, óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2), por meio do método colorimétrico de Griess e pelos kits DAF- FM diacetato e Amplex Red, respectivamente. Para a análise estatística, foram utilizados os testes estatísticos ANOVA Fatorial seguido do teste de Tukey e teste de correlação de Pearson (p<0.05). Nossos resultados revelaram que os MCs foram capazes de eliminar eficientemente o periodontopatógeno, principalmente após 10h de desafio intracelular. Comparando-se a atividade microbicida dos dois tipos celulares, verificou-se, nos períodos de 3h e 5h de desafio, um menor percentual de colônias viáveis no interior de MPs, em comparação aos MCs. Inversamente, nos períodos de 10h e 24h, observaram-se menores valores percentuais de colônias intracelulares nos MCs em relação aos MPs. Além disso, a produção/liberação de NO bem como, em menor proporção, de H2O2 pelos MCs foram concordantes com a sua capacidade microbicida. Este é o primeiro estudo que demonstra a eficiente ação microbicida intracelular de MCs murinos contra Aggregatibacter actinomycetemcomitans, com produção e liberação de substâncias potencialmente bactericidas, e de forma mais eficaz que os macrófagos. Esses resultados sugerem a importância dessas células nos mecanismos de defesa presentes na doença periodontal induzida por placa dentobacteriana.

Candida albicans (C. albicans) é um fungo comumente encontrado nas mucosas do trato gastrointestinal, incluindo cavidade bucal, e no trato genitourinário feminino dos seres humanos, podendo ocasionar candidose local ou invasiva, principalmente em estados de imunossupressão. Considerando que os mastócitos residem na região subepitelial e participam ativamente da imunidade inata, são necessários estudos sobre o envolvimento destas células na proteção contra C. albicans. Os mastócitos reagem a diferentes estímulos por meio da síntese e secreção de citocinas, dentre elas o Fator de Necrose Tumoral-&#945;, que tem atuação pró-inflamatória e pode ser produzido através do desencadeamento do fator de transcrição NF-&#954;B, via ligação do antígeno ao receptor tipo TOLL 2, presente na superfície dos mastócitos, dentre outras células. Um dos ligantes do TLR2 é a fosfolipomanana, um glicopeptídeo presente na superfície de C. albicans.&#09;Assim, o objetivo do presente trabalho é avaliar a liberação de TNF-&#945;, bem como a atividade fagocitária, e a participação do receptor tipo TOLL 2 (TLR2) em mastócitos diferenciados da medula óssea de camundongos, estimulados ou não com C. albicans. Este estudo tem sido conduzido por meio da utilização de camundongos C57BL/6 selvagens e knockouts para o receptor TLR2, e da dosagem da referida citocina pelo método de ELISA, bem como por meio de ensaio de fagocitose com análise por meio de microscopia confocal. Os resultados tem sido expressos como média &#61617; desvio padrão (SD) dos valores obtidos para cada grupo.

As doenças periodontais afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por microrganismos gram-negativos anaeróbios e facultativos, como o Aggregatibacter actinomycetemcomitans, que possui a capacidade de invadir os tecidos periodontais e estabelecer uma infecção. Sabe-se que a evolução da doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares, os quais produzem uma vasta gama de mediadores, como as quimiocinas, citocinas e enzimas, que atuam no microambiente local modulando a resposta do hospedeiro em busca do controle da infecção. Atualmente existem evidências de que os mastócitos, além de outras funções, possuem a capacidade de eliminar bactérias, através de mecanismos dependente ou independente da fagocitose. Embora existam trabalhos demonstrando a capacidade fagocítica e microbicida dos mastócitos frente a bactérias gram-negativas, nada se tem sobre a participação dos mastócitos na eliminação de periodontopatógenos via fagocitose. Uma vez que A. actinomycetemcomitans é uma das bactérias amplamente relacionadas à doença periodontal inflamatória e que o seu componente LPS participa da ativação de células inflamatórias, torna-se importante um maior conhecimento da relação mastócito/A. actinomycetemcomitans, em especial as capacidades fagocítica e microbicida, bem como imunomodulatória, destas células frente a esta bactéria, caracterizando aspectos da participação dos mastócitos na resposta imune e na eliminação dos periodontopatógenos nas DPs inflamatórias. O objetivo deste estudo é avaliar as capacidades fagocítica e imunomodulatória dos mastócitos contra A. actinomycetemcomitans. Assim, pretendemos avaliar in vitro a ocorrência de fagocitose, bem como a liberação de TNF-&#945;, IFN-&#947;, IL-10 e TGF-&#946;, pelos mastócitos desafiados ou não com A. actinomycetemcomitans Para isto, mastócitos diferenciados da medula óssea de camundongos C57BL/6 serão utilizados e os eventos

A presença de Candida albicans nos biofilmes microbianos aderidos na superfície interna das próteses totais superiores está relacionada com uma doença inflamatória no palato, conhecida como estomatite por dentadura ou estomatite protética. Constituinte da defesa inata do hospedeiro, o epitélio bucal tem a capacidade de reconhecer e reagir frente a constituintes e fatores fúngicos com o objetivo de evitar a invasão pelo microrganismo. As defensinas e catelicidinas são peptídeos antimicrobianos, presentes na saliva humana e expressos por células epiteliais de mucosas, ambos com atividade contra C. albicans. Tais peptídeos desencadeiam funções importantes de defesa desde a inibição direta do patógeno até a modulação das respostas imune inata e adaptativa do indivíduo. O conhecimento da secreção conjunta das defensinas e catelicidinas pelas células epiteliais se faz importante para o entendimento detalhado do processo patológico de doenças inflamatórias, como a estomatite por dentadura. Apesar da atividade antimicrobiana das defensinas e catelicidinas ser amplamente investigada, estudos in vitro com células epiteliais de palato humano desafiadas com C. albicans, avaliando comparativamente a produção dos peptídeos, não foram encontrados. O objetivo deste trabalho é avaliar, simultaneamente, a produção in vitro dos peptídeos antimicrobianos &#946;-defensina (hBD-2) e catelicidina (LL-37) por células epiteliais de palato humano, após desafio com C. albicans. A cultura das células epiteliais de palato será obtida a partir de tecido epitelial descartado de procedimentos cirúrgicos periodontais. As células em monocamada serão desafiadas por contato direto com C. albicans viável e, indireto, utilizando o sobrenadante da cultura de hifas do fungo. A secreção e a expressão gênica de hBD-2 e LL-37 serão determinadas, pré e pós desafio, nos tempos de 12, 24 e 48 h. Os resultados serão obtidos pelos métodos ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) e RT-PCR em tempo real (Real-Time

O interesse na melhoria das condições de saúde do idoso cresce juntamente com a expectativa de vida da população o que acarreta em uma busca crescente do conhecimento dos fatores biológicos relacionados com a resposta imune. Os macrófagos desempenham funções essenciais no combate a microrganismos, sendo um deles C. albicans, fortemente associada à candidose nos idosos. Um dos mecanismos utilizados frente aos microrganismos são o processo fagocitário e a produção de óxido nítrico (NO). Embora alguns dados ainda sejam contraditórios, indivíduos idosos apresentam alterações no processo de fagocitose e na produção de intermediários reativos de nitrogênio (RNIs) pelos macrófagos em comparação com os jovens. Uma vez esses fatores comprometidos, o combate aos agentes agressores é dificultado e ou ineficaz fazendo com que estas disfunções ocasionem problemas clínicos. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho é investigar a atividade de macrófagos peritoneais de camundongos jovens e idosos, com relação à capacidade fagocítica e produção de óxido nítrico (NO), frente ao estímulo, in vitro, com C. albicans. Para isso, serão obtidos macrófagos peritoneais de camundongos C57BL/6, os quais serão cultivados na presença de diferentes concentrações de C. albicans, viáveis ou mortas pelo calor. O sobrenadante será coletado para dosagens de NO pelo método de Griess. Para o ensaio de fagocitose, os macrófagos peritoneais desafiados com leveduras de C. albicans serão avaliados em microscopia de fluorescência. Os resultados serão expressos como média ± desvio padrão (SD) dos valores obtidos para cada grupo, e analisados por meio do teste estatístico ANOVA, seguido do teste de Tukey. Valores de p<0.05 serão considerados como indicativos de significância estatística.

As células dendríticas são eficientes células apresentadoras de antígenos e importantes na indução das imunidades inata e adaptativa. Apresentam-se nas formas imatura e madura localizadas nos órgãos não linfáticos e nos linfonodos, respectivamente. O termo imunossenescência refere-se ao envelhecimento do sistema imune. O envelhecimento induz ao declínio das funções do sistema imune, aumentando a susceptibilidade do organismo às infecções, considerando alterações específicas em células T, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas. Dentre os microrganismos, o fungo Candida albicans (C. albicans) representa um importante patógeno para o desenvolvimento de infecções invasivas, especialmente em indivíduos imunodeprimidos. O papel das células dendríticas na imunossenescência, em especial na infecção por Candida albicans, tem sido pouco estudado. Comparativamente, utilizando amostras de sangue de indivíduos idosos e jovens saudáveis para a geração das células dendríticas a partir de monócitos do sangue periférico, propomos avaliar aspectos da função imunomodulatória das células dendríticas de idosos, em resposta ao desafio com o fungo, por meio da produção de TNF-&#61537;, IL-6, IL-23 e IL-10, bem como a participação dos receptores TLR2 e TLR4 presentes nas células dendríticas maduras, nesta atividade imunomodulatória. Ainda, pretendemos avaliar a capacidade fagocítica, após desafio in vitro com C. albicans, das células dendríticas maduras. A avaliação envolverá a dosagem de citocinas por meio de ELISA, e a participação dos receptores tipo TOLL 2 e 4 avaliados por ensaios de fagocitose e imunofluorescência através da expressão de marcadores de membrana das células dendríticas maduras.

A partir da análise microscópica de biópsias de mucosa bucal de pacientes submetidos ao transplante de medula óssea alogênico, pretende-se: 1. Determinar a relação da expressão tecidual de CCL20 e seu receptor CCR6 com a concentração de células de Langerhans (CD1a+) na mucosa bucal de pacientes com Doença enxerto contra hospedeiro crônica (GVHDc); 2. Por meio da técnica imuno-histoquímica, quantificar os níveis e identificar os sítios de expressão de CCL20 e CCR6 em biópsias de mucosa bucal de pacientes hematológicos submetidos ao transplante alogênico de medula óssea, com e sem doença enxerto contra hospedeiro crônica (GVHDc); 3. - Relacionar os achados da expressão da quimiocina CCL20 e seu receptor CCR6 em ambos os grupos (com GVHDc e sem GVHDc), com a avaliação quantitativa das células de Langerhans(CD1a+).

O interesse na melhoria das condições de saúde do idoso cresce juntamente com a expectativa de vida da população, que atingiu em 2006 a marca de 72 anos para os nascidos neste ano. Este aumento na longevidade acarreta em uma busca crescente do conhecimento dos fatores biológicos inerentes do idoso, como por exemplo, aqueles relacionados com a resposta imune. Os idosos possuem alterações nos mecanismos imunes e no desenvolvimento dos processos inflamatórios em comparação aos jovens, incluindo a produção de citocinas pró e antiinflamatórias, importantes na ativação de leucócitos e modulação dos mecanismos de defesa. Os monócitos e linfócitos, importantes células da imunidade inata e adaptativa, desempenham funções essenciais, como a produção de citocinas, resultando em respostas imunes e inflamatórias apropriadas. Indivíduos idosos apresentam alterações na produção de citocinas pró e antiinflamatórias pelos monócitos e PBMC, embora alguns dados ainda sejam contraditórios. Uma vez esta sinalização comprometida, o combate aos agentes agressores é dificultado e ou ineficaz fazendo com que estas disfunções ocasionem problemas clínicos como o aumento da incidência de tumores, doenças auto-imunes e infecções. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a produção de citocinas pró e antiinflamatórias, fator de necrose tumoral-&#945; (TNF-&#945;) e interleucina-10 (IL-10) respectivamente, pelos monócitos e pelos PBMC obtidos de voluntários idosos, em comparação com jovens (controle), ambos saudáveis. Para isso, foram obtidas amostras de sangue periférico dos voluntários, e as PBMC e os monócitos isolados e cultivados em placas de cultura de 24 poços, por 18 horas, na ausência ou presença de lipopolissacarídeo (LPS). Após este período, o sobrenadante foi coletado para as dosagens das referidas citocinas, pelo método ELISA.

No presente trabalho, pretendemos comparar entre indivíduos idosos e adultos não idosos, apresentando ou não estomatite protética, os seguintes aspectos:&#10;- Imunofenótipo de neutrófilos salivares e sanguíneos;&#10;- Ativação funcional de neutrófilos salivares e sanguíneos, bem como monócitos, quanto à capacidade fagocítica e atividade microbicida contra C. albicans;&#10;-Função imunomodulatória dos neutrófilos sanguíneos e salivares e de monócitos.