Gustavo Pompermaier Garlet.

2R01DE026736-06 - University of Texas at Dallas, Department of Bioengineering & FOB-USP

Variantes da natureza da resposta imune e inflamatória, envolvendo diferenças em sua intensidade, duração, assim como a participação de diferentes tipos celulares e a polarização da resposta imune, atualmente nos permitem considerar que em sua interação com o tecido ósseo a resposta imune inflamatória pode se mostrar tanto destrutiva ou construtiva. Enquanto tal natureza destrutiva é relativamente bem caracterizada devido aos numerosos estudos com foco em inflamações crônicas osteolíticas, estudos com foco específico no papel construtivo da inflamação em situações como o reparo tecidual são mais recentes e menos numerosos. No contexto da inflamação destrutiva, citocinas pro-inflamatórias e associadas a respostas do tipo Th1 e Th17 se mostram associadas à progressão de lesões osteolíticas, como lesões periapicais e periodontais. Por outro lado, nosso grupo descreveu o papel protetor exercido por Tregs (células T regulatórias) no desenvolvimento de lesões periodontais e periapicais, e que resulta em uma drástica mudança no microambiente inflamatório. Entretanto, resultados preliminares demonstram que a migração e ação das Tregs não se mostra isolada, estando outros tipos celulares potencialmente envolvidos no estabelecimento e manutenção do microambiente inflamatório construtivo e pró-reparador. De fato, lesões periapicais inativas também se caracterizam pela atividade imunoregulatória e potencialmente reparativa de células tronco mesenquimais (MSCs), assim como pela predominância de macrófagos M2. Dessa forma, o papel regulatório das Tregs pode ser mediado ou amplificado pelas MSCs ou M2, que por sua vez também podem atuar de forma independente ou inter-relacionada. Neste contexto, é importante destacar que lesões inativas são caracterizadas pela maior expressão de marcadores de reparo tecidual, demonstrando que mesmo em processos inflamatórios crônicos, variações no padrão de resposta podem mediar (ainda que parcialmente) o reparo tecidual, sendo esta uma das evidencias da possível natureza construtiva de determinados processos inflamatórios. De fato, M2 e MSCs são considerados dois tipos celulares determinantes de sucesso do processo de reparo tecidual, assim como estudos sugerem sua participação na determinação do sucesso clínico da implantação de biomateriais, como o Ti. Contudo, apesar de tais suposições, nenhum estudo confirmou o papel imunoregulatório e reparativo de M2 e MSCs no processo de reparo (associado ou não a biomateriais) de forma direta por meio de experimentos causa-e-efeito; assim como no contexto de lesões inflamatórias crônicas de caráter destrutivo. Dessa forma, apresentamos como objetivo geral do presente projeto o estudo de determinantes da natureza construtiva ou destrutiva de microambientes inflamatórios associados ao tecido ósseo, com foco específico em na migração e função de MSCs e M2, sua possível regulação por Tregs; e em como biomateriais podem influenciar o curso da resposta deflagrada por sua implantação determinando o sucesso ou insucesso de sua aplicação. Adicionalmente, propomos análises exploratórias como foco em perfis genéticos com potenciais inflamatório e reparador opostos para a possível identificação de novos mecanismos imunoregulatórios que possam contribuir para a determinação da natureza construtiva/destrutiva de microambientes inflamatórios. Para tanto, realizaremos experimentos in vivo com animais geneticamente modificados, assim experimentos com foco na inibição ou indução (farmacológica) de determinados fatores, e experimentos in vitro, que em conjunto permitirão o estabelecimento de relação causa-e-efeito entre a migração, polarização e ação de subtipos celulares específicos, elucidando seu papel nos mecanismos imunoregulatórios que determinam a natureza construtiva ou destrutiva de microambientes inflamatórios associados ao tecido ósseo, com potencial aplicação para o desenvol

Edital Universal CNPq - Faixa C - 471031/2013-5
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O adequado desenvolvimento do processo de reparo ósseo é fundamental para o restabelecimento da homeostasia tecidual e recuperação de suas funções, ou para possibilitar terapias reabilitadoras. Dentre as possíveis estratégias para a modulação terapêutica do reparo ósseo alveolar, podemos destacar a modulação da resposta imune/inflamatória, que se mostra extremamente importante ao processo de reparo ósseo, porém cujas funções ainda não são claramente compreendidas. Enquanto respostas imune/inflamatórias exacerbadas se mostram associadas basicamente a reabsorção óssea, uma resposta imune/inflamatória transitória de baixa magnitude é essencial no processo de reparo ósseo. Nesse contexto, a sinalização mediada por receptores do tipo Toll (TLRs) e receptores do tipo Nod (NLRs) desempenha um papel fundamental no início da resposta imune/inflamatória através do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs). Uma vez ativados, TLRs e NLRs são capazes de gerar diversos mediadores inflamatórios, como o TNF-α, que apresenta um papel importante no processo de reparo ósseo alveolar. Contudo, uma vez que não são claros os mecanismos de "trigger" da produção de citocinas e mediadores inflamatórios no contexto do reparo ósseo, temos como objetivo de estudo do presente projeto investigar a importância de TLRs e NLRs na geração da resposta imune/inflamatória e no reparo ósseo subsequente à extração do incisivo superior de camundongos. Os resultados em conjunto da análise comparativa dos dados histomorfométricos e moleculares das diferentes linhagens certamente contribuirá para o aprimoramento dos conhecimentos dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos na resposta imune/inflamatória necessária para o reparo do tecido ósseo, podendo assim, ampliar os panoramas científicos, não só para futuros desenvolvimentos de fármacos como também na individualização do tratamento de traumas e doenças ósseas, visando um reparo mais rápido e efetivo.

Processo FAPESP 2012/15133-3

Papel do eixo DAMPS-CD14-MYD88 na modulação da resposta inflamatória e reparo tecidual frente à implantação de biomateriais ?clássicos?

It is becoming clear that periodontitis is not only characterized by pathogenic infection, but even more so by a loss of immunological homeostasis. Strategies toward resolution of regenerating the periodontium without completely blocking immune responses against local and systemic infections would be ideal. Our long-term objective is to address the physiological cause of periodontitis through an understanding of the inflammatory
and regulatory processes of the periodontium. Correspondingly, recent data in our laboratories indicate that periodontitis symptoms are accompanied by the absence of an important cell subset called regulatory T-cells. We hypothesize that controlled release formulations of Treg-recruiting factors is a viable way to regenerate the periodontal space. This hypothesis is supported by our preliminary data demonstrating that controlled release of Treg recruiting factors leads to an increase in regulatory T-cells in the periodontium, in the draining lymph nodes, and, consequently, resolution of periodontal disease symptoms 2 mouse models. 1 R01 DE021058-01A1

Moléculas co-estimulatórias de osteoclastos: caracterização da cinética de expressão dos complexos DAP12/TREM-2/ SIRPβ1 e FcRγ/OSCAR/PIR-A na doença periodontal experimental, e de sua modulação por citocinas. A destruição óssea causada pela ativação exacerbada do sistema imunológico vem chamando atenção em doenças ósseas inflamatórias, como é o caso das doenças periodontais (DPs). Assim, os mecanismos envolvidos na diferenciação e a ativação de osteoclastos tornaram-se um dos principais alvos no estudo de tais patologias. Estudos recentes demonstram que, para que haja a osteoclastogênese não só é necessária a ligação das moléculas RANK/RANKL, mas também de moléculas co-estimulatórias tais como DAP12, TREM-2 e SIRPβ1, e FcRγ, OSCAR e PIR-A , que induzem a via de sinalização cálcio/calcineurina, aumentando a quantidade de cálcio intracelular, o que é fundamental para a ativação do NFATc1, principal fator de transcrição na diferenciação e ativação do osteoclasto. Entretanto, a possível contribuição de tais moléculas para a progressão da doença periodontal (humana e experimental) permanece desconhecida, uma vez que não existem relatos na literatura a este respeito. Resultados preliminares de nosso laboratório demonstram um aumento na expressão de tais fatores em biopsias de periodontite crônica quando comparados a tecidos saudáveis. Como demonstrado para o sistema RANK/RANKL, citocinas de diferentes classes (pró- e anti-inflamatórias, Th1 e Th17) exercem um papel fundamental no desenvolvimento da perda óssea inflamatória através da modulação direta dos fatores envolvidos na osteoclastogênese, o que potencialmente inclui as moléculas co-estimulatórias de osteoclastos. Entretanto, o grau de influência que diferentes citocinas exercem sobre a expressão de moléculas co-estimulatórias permanece desconhecido. 
Neste projeto, avaliaremos a cinética de expressão de moléculas co-estimulatórias de osteoclastos (DAP12, TREM-2 e SIRPβ1, e FcRγ, OSCA

EMU: AQUISIÇÃO DE APARELHO DE MICRO TOMOGRAFIA IN VIVO PARA O LABORATÓRIO DE CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DE RESPOSTA BIOLÓGICA - Projeto Multiusuario FAPESP 2009/54080-0 - Skyscan 1176 High resolution in vivo Micro CT system

EMU: AQUISICAO DE 1 EQUIPAMENTO DE GRANDE PORTE (VIIA 7TM REAL-TIME PCR SYSTEM) PARA A REALIZACAO DE PESQUISAS POR PESQUISADORES DE DIVERSOS DEPARTAMENTOS DA FOB/USP E DE OUTRAS INSTITUIÇÕES DE PESQUISA - Projeto Multiiusuario FAPESP 2009/53848-1

Projeto CNPq - Edital Universal 2011-2013 - 470933/2011-9

O metabolismo ósseo é influenciado por fatores endócrinos, genéticos e de crescimento, além de moléculas regulatórias comuns aos sistemas ósseo e imunológico, como as citocinas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos no reparo ósseo alveolar, seja em condições homeostáticas quanto infecciosas (como na alveolite experimental, que resulta em intensa resposta inflamatória e em retardo do processo de reparo). Assim, o objetivo deste projeto é determinar através da caracterização histomorfométrica e molecular, o papel de citocinas pró (TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-10), e de genótipos inflamatórios extremos (máximo e mínimo), no reparo ósseo alveolar em condições homeostáticas e infecciosas (alveolite experimental), através da aplicação do modelo em camundongos de diferentes linhagens: geneticamente deficientes para o receptor de TNF-α (p55KO) e IL-10 (IL-10KO) e a linhagem controle WT (C57Bl/6), e geneticamente selecionados para máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) reação inflamatória. As diferentes linhagens serão subdivididas em grupos Controle e Alveolite experimental (induzida pela inoculação no alvéolo de uma suspensão de cultura bacteriana contendo microrganismos associados à alveolite humana), e analisados nos períodos de 0, 7, 14 e 21 dias. As amostras serão submetidas ao processamento histológico e analisadas ao microscópio óptico para caracterização histomorfométrica (qualitativa e quantitativa), e a análise molecular será realizada utilizando o RealTimePCR para quantificação de mRNA de citocinas e marcadores de formação e reabsorção óssea. Ao longo do projeto, tais resultados serão validados por ELISA. Os dados serão analisados estatisticamente e comparados entre as diferentes linhagens nos diferentes grupos e períodos. A análise conjunta de tais dados certamente contribuirá para um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de reparo ósseo alveolar, promovendo conhecimentos específicos que poderão contri

A doenças periodontais (DPs) são doenças inflamatórias crônicas e multifatorias, que envolvem em sua patogênese fatores locais e microbianos, sendo sua evolução influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro. Enquanto o predomínio da resposta imune do tipo Th1 se mostra associada à destruição dos tecidos periodontais, mediadores do tipo Th2 atenuam a severidade da doença. Entretanto, estudos recentes têm demonstrado que fatores ambientais, genéticos e epigenéticos, assim como a interação das DPs com outras patologias sistêmicas pode potencializar ou atenuar sua progressão. Estudos demonstram uma correlação positiva entre a prevalência e a severidade das doenças periodontais e da artrite reumatóide (AR) em humanos, e sugerem que tal associação se fundamenta na similaridade dos mecanismos imunológicos envolvidos na patogênese de ambas doenças, em que uma resposta Th1 crônica exacerbada leva à destruição tecidual. Por outro lado, dois grandes levantamentos epidemiológicos demonstram uma correlação negativa entre a ocorrência de alergia (AL), caracteristicamente associada a uma resposta do tipo Th2, e a ocorrência e severidade das DPs. De fato, estudos experimentais e em humanos tem demonstrado interferências na ocorrência simultânea de diferentes processos patológicos, mesmo quando tais processos ocorrer em órgãos/sítios distintos, e tais interferências são antígeno-independentes. Em ambas interações, AR/DP, e AL/DP, sugere-se que tanto a susceptibilidade/resistência determinada pelo background genético do indivíduo, assim como possíveis interferências funcionais no desenvolvimento da resposta imune podem estar envolvidos nos mecanismos de modulação entre tais patologias. Neste projeto, propomos um estudo in vivo utilizando os modelos animais de artrite induzida por Pristane e alergia induzida por OVA para investigar as possíveis associações (influência genética e interferências funcionais) entre as duas condições e a doença periodontal experimenta

Para este estudo, grupos de camundongos das diferentes linhagens (C57Bl/6[WT], MIPa-KO e CCR5-KO) serão submetidos ao protocolo de indução de doença periodontal através da inoculação oral com Actinobacillus actinomycetemcomitans (AA). Desta forma, analisaremos o papel de MIP1a e CCR5 no estabelecimento e evolução da periodontite, com base na análise do infiltrado inflamatório e na reabsorção óssea alveolar apresentada pelos animais experimentais, assim como no controle da infecção experimental. A severidade da doença periodontal em cada tempo e em cada grupo experimental será analisada pela intensidade da reação inflamatória e pela reabsorção óssea apresentada pelos animais, medida como a distância da crista óssea alveolar à junção amelo-cementária na face palatina dos molares superiores, com um sistema de análise de imagens. 
Amostras de tecido periodontal de tais animais serão utilizadas para a análise imunohistológica da reação inflamatória local, na qual as células presentes no infiltrado serão caracterizadas fenotipicamente através técnicas de citometria de fluxo e de imunohistoquimica. Utilizando tais técnicas, também caracterizaremos as populações celulares responsáveis pela produção de MIP1a durante o curso da DP experimental, assim determinaremos o fenótipo e o estado de ativação das células CCR5+, e as citocinas por elas produzidas. Reações de RealTime-PCR serão utilizadas para a quantificação de mediadores inflamatórios, metaloproteases e seus inibidores, fatores de diferenciação e ativação de osteoclastos, nos tecidos periodontais durante o curso da doença. Também analisaremos o controle da infecção experimental através do monitoramento da carga bacteriana no tecido peridontal, bem como através da análise de mediadores antimicrobianos como NO e MPO, e da dosagem de anticorpos anti AA no soro dos animais. Projeto JovemPesquisador FAPESP # 06/00534-1(R$ 109.000,00, US$ 47.000,00)

Estudo da contribuição de fatores genéticos, microbianos e de interferências funcionais na regulação da expressão gênica e polarização da resposta imune, e seus efeitos na imunomodulação das doenças periodontais humana e experimental

Estudaremos também o papel das células T CD4+CD25+ e Th17 na doença periodontal experimental. Para tanto, camundongos serão submetidos ao protocolo de indução de doença periodontal através da inoculação oral com Actinobacillus actinomycetemcomitans (AA). Em subgrupos experimentais será realizada a depleção das células CD4+CD25+ e Th17, visando o estudo de seu papel no estabelecimento e evolução da periodontite, assim como no controle da infecção experimental. A severidade da doença periodontal em cada tempo e em cada grupo experimental será analisada pela reabsorção óssea alveolar apresentada pelos animais (medida como a distância da crista óssea alveolar à junção amelo-cementária na face palatina dos molares superiores), assim como através da quantificação das células inflamatórias extraídas do tecido periodontal. Biopsias de tais animais serão utilizadas para a análise imunohistológica da reação inflamatória local, na qual as células presentes no infiltrado serão caracterizadas fenotipicamente através de citometria de fluxo e imunohistoquímica, assim como através de ensaios de co-cultura, como descritos anteriormente. Reações de RealTime PCR e ELISA serão utilizadas para a análise da expressão de fatores envolvidos na função das células T CD4+CD25+, como CTLA-4, TGF-b e IL-10, além da análise da expressão de citocinas pró-inflamatórias, MMPs, RANKL e respectivos inibidores, nos tecidos periodontais durante o curso da doença. Também analisaremos papel das células T CD4+CD25+ no controle da infecção experimental através do monitoramento da carga bacteriana no tecido peridontal, bem através da análise de mediadores antimicrobianos como NO e MPO, da dosagem de anticorpos anti AA no soro dos animais, assim como através da análise da resposta de fase aguda. A análise conjunta de tais dados, envolvendo os dados relativos ao papel das células T CD4+CD25+ na DP humana, assim como a suscetibilidade ou resistência de cada grupo experimental à doença periodontal, na regulação

A movimentação ortodontica se baseia na reabsorção o formação óssea seletivas após a aplicação de uma força mecanica, e parece envolver enventos imunoinflamatórios. Estudos recentes sugerem que os sistemas imune e ósseo possuem uma variedade de moléculas regulatórias, como por exemplo, as citocinas, em comum. Várias citocinas inflamatórias têm sido demonstradas desempenhando papel na osteoclastogênese, incluindo TNF-a e IL-1b, enquanto citocinas anti-inflamatórias como a IL-10 parecem exercer efeito antagonista. Dessa forma, tais mediadores estão potencialmente envolvidos na regulação dos mecanismos moleculares da movimentação dentaria ortodôntica. Além disso, tais citocinas também parecem modular os efeitos catabólicos e anabólicos deflagrados pela força ortodôntica e que participam da remodelação do ligamento periodontal durante a movimentação dentaria. Tendo em vista as evidências que demonstram a relação entre os sistemas imune e esquelético; a ausência de trabalhos que esclareçam diversos mecanismos imunológicos na remodelação dos tecidos ósseo e ligamentar, e ainda a importância de se promover conhecimentos específicos para futuras intervenções que potencializem o processo de movimentação dentária, o nosso projeto investigará a expressão de citocinas e quimiocinas nos lados de pressão e tensão de dentes submetidos a força ortodôntica, e sua possivel correlação com marcadores de formação e reabsorção óssea, assim como de marcadores da remodelação do ligamento periodontal.

As periapicopatias são processos inflamatórios próprios da região periapical dental e constituem o grupo mais freqüente entre as alterações ósseas dos maxilares. No entanto, os precisos mecanismos patológicos envolvidos nas lesões periapicais permanecem desconhecidos. Neste trabalho será utilizado o modelo de lesão periapical induzida pela exposição pulpar em dentes molares de camundongos a fim de se avaliar o papel do óxido nítrico, prostaglandinas, leucotrieno B4 (LTB4), citocinas como interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral (TNF-a) e interferon -g (IFN-g) e da quimiocina MIP-1a na formação de lesões periapicais, além de analisar a expressão de proteínas dentinárias na região apical durante o processo. Para tal avaliação, lesões periapicais serão induzidas em camundongos deficientes para o receptor p55 do TNF-a (p55-/-), para a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS-/-), para IFN-g (IFN-g-/-), para MIP-1a (MIP-1a-/-), em animais tratados com drogas anti-inflamatórias que bloqueiam a síntese de leucotrienos e prostaglandinas e com o antagonista do receptor da IL-1 (IL-1ra). A expressão de mediadores inflamatórios nas lesões periapicais será realizada pelo ensaio de proteção de RNAse (RPA) e a localização de proteínas dentinárias e fenotipagem do infiltrado inflamatório por imuno-histoquímica. A área da lesão e a extensão da reabsorção óssea e dentária serão avaliadas histomorfometricamente.

As doenças periodontais afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por microrganismos gram-negativos anaeróbios, como o Actinobacillus actinomycetemcomitans. A evolução da doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares, os quais produzem uma vasta gama de mediadores, como as quimiocinas, citocinas e enzimas, que atuam no microambiente local modulando a resposta do hospedeiro em busca do controle da infecção. Pouco se sabe sobre o papel de tais fatores na determinação de resistência às doenças periodontais ou no desencadeamento do dano tecidual decorrente da resposta. Neste projeto, avaliaremos o papel das citocinas IFN-gamma, TNF-alpha e IL-4, e da enzima iNOS no processo de doença periodontal induzida em camundongos. Tais fatores tem sido identificados na doença periodontal em humanos, bem como em um modelo animal utilizado em nosso laboratório. Animais geneticamente deficientes de tais fatores serão submetidos a um protocolo de indução de doença pela inoculação oral de A. actinomycetemcomitans, nos quais será analisada a suscetibilidade a doença, modulação da expressão de citocinas, quimiocinas e de fatores envolvidos na reabsorção óssea, bem como as populações celulares envolvidas nesse processo.

As doenças periodontais são alterações inflamatórias dos tecidos de suporte dos órgãos dentais, tem sua etiologia relacionada a bactérias periodontopatogênicas e altamente influenciada pela resposta imune do hospedeiro. Uma vez que tal resposta compreende a formação um de infiltrado inflamatório crônico, fatores envolvidos na migração celular para os tecidos periodontais estão potencialmente envolvidos na imunopatogênese da doença. Neste estudo avaliamos a expressão de quimiocinas, uma família de citocinas quimiotáticas envolvidas no recrutamento celular e modulação da resposta imune local, nas doenças periodontais humana e experimental. Pacientes com PEP apresentam um resposta predominantemente do tipo Th1, expressando com maior prevalência e maior intensidade MIP-1a, RANTES e CCR5, IP-10 e CXCR3, além de IFN-g. Por outro lado, em pacientes com PA, a expressão de MCP-1 e CCR4, BCA-1 e CXCR5, além de IL-10, com maior prevalência e intensidade, caracteriza tal resposta como Th2. Durante o curso da doença periodontal experimental, a cinética de expressão de diversas quimiocinas e seus receptores foi determinada, sendo que o padrão de resposta é inicialmente do tipo Th1, se tornando em seguida um padrão misto Th1 Th2. Tal expressão, tanto na doença humana como na experimental, estaria relacionada a quimioatração das células caracteristicamente presentes em lesões periodontais. Nossos resultados sugerem uma nova visão a respeito da polarização da resposta imune nas doenças periodontais, bem como proporciona informações para futuros estudos, visando analisar individualmente tais fatores, buscando novas estratégias terapêuticas para o controle de tais patologias.

Imunomodulação das doenças periodontais humana e experimental.

Estudo do papel das restaurações proximais com excesso e sua relação com as condições peridontais adjacentes