Silvia Beatriz Boscardin.

Malaria is still the deadliest vector borne disease around the world (www.who.int). Malaria infection is initiated by the inoculation of sporozoites in the host skin during the bite of an infected mosquito. Sporozoites invade blood vessels to reach the liver, multiply inside a hepatocyte and release thousands of erythrocyte-infective stages, which will initiate blood infection and cause the pathology. In Brazil, most of malaria cases are caused by P. vivax (Pv) (World Malaria Report 2022), which can stay dormant inside hepatocytes for weeks to months as hypnozoites. This quiescent stage represents an important challenge for malaria control since it can relapse, re-starting a new blood infection after the primary parasitemia. The problem is aggravated by the fact that hypnozoites are clinically silent, non-diagnosable, and hypnozoiticides, such as primaquine, can cause severe anemia in the population with low G6PD activity, which is strongly correlated with malaria prevalence. We have modelled that by targeting Pv sporozoites, the number of relapses could be significantly reduced if the rate of hypnozoite conversion was kept constant. More recently, passive immunization using a single dose of human monoclonal antibody (hmAb) targeting the Plasmodium falciparum (Pf) circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of sporozoites, was shown to completely block Pf sporozoite infection.

As infecções ocasionadas pelos vírus da dengue (DENV) e da zika (ZIKV) são de extrema importância para a saúde pública, sendo endêmicas em 141 países. Apesar da maioria dos sinais e sintomas da doença serem leves e autolimitados, sabe-se que as infecções causadas por DENV e ZIKV podem levar a complicações graves. De acordo com os dados da Organização Pan-Americana da Saúde, todos os quatro sorotipos do DENV levam a aproximadamente 500.000 hospitalizações de indivíduos com síndrome hemorrágica por ano. Atualmente, não há uma vacina 100 eficaz para combater essas infecções e nem um esquema de tratamento específico. A descoberta de medicamentos antivirais relacionados com esses Flavivirus precisa ser mais explorada. Os anticorpos monoclonais (mAbs, do inglês monoclonal antibodies) têm sido bastante utilizados para o tratamento de infeções virais e, atualmente, não existe nenhum mAb licenciado para o controle da dengue. Estudos anteriores realizados pelo Laboratório de Direcionamento de Antígenos para Células Dendríticas em parceria com o Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, ambos do ICB/USP, caracterizaram in vitro e in vivo um mAb anti-Zika chamado de A9Z. Foi visto que o mAb A9Z reconhece de forma cruzada as proteínas do envelope (E) dos sorotipos 1, 2 e 3 do DENV, além de neutralizar esses vírus in vitro. A administração do mAb A9Z em camundongos imunocomprometidos infectados com o ZIKV permitiu a determinação do potencial protetor, tanto em estratégia profilática como terapêutica. A presente proposta tem como objetivo avaliar a utilização do mAb A9Z como droga para tratamento contra infecção pelo DENV em modelo murino. O estudo será conduzido junto à empresa ImunoTera Soluções Terapêuticas, que terá a função de coordenar e obter os recursos de forma a dar continuidade à caracterização do mAb como estratégia de tratamento contra a infecção ocasionada pelo vírus da dengue.

As microagulhas (MNs) formam uma plataforma de administração de medicamentos segura e não invasiva para aplicações tópicas e sistêmicas. Biocompatibilidade, fácil aplicação, maior eficiência de liberação controlada e baixas concentrações necessárias estão entre os principais benefícios da tecnologia. Elas podem aumentar o acesso da população a terapias de ponta por meio da redução de custos e aumento do bem-estar, diagnóstico bem-sucedido, prognóstico e consequente adesão ao tratamento de pacientes com doenças crônicas devido à redução da dor, aumento do conforto e redução dos efeitos colaterais. Estudos recentes de membros desse consórcio mostraram como as propriedades mecânicas das MNs poliméricas afetam a liberação, melhorando a penetração e o fluxo de drogas hidrofílicas de uso tópico [Ref. 1]. Propomos explorar esta tecnologia desenvolvendo novas ferramentas de entrega transdérmica e como biossensor para o diagnóstico de doenças. Planejamos usar sistemas de MN poliméricas combinadas com anticorpos monoclonais para validar: (1) ferramentas de administração transdérmica para terapia de câncer de pele, administração de vacinas usando anticorpos monoclonais e terapias direcionadas para psoríase; (2) Ferramentas de biossensor transdérmico para detectar biomarcadores para prognóstico e diagnóstico de psoríase e doenças infecciosas através da construção de sistemas de sensores MN de ensaio eletroquímico de fluxo lateral. Neste consórcio, propomos explorar diferentes misturas de polímeros para criar construções personalizadas de MNs como abordagens inovadoras de tratamento para aplicações na saúde.

A proposta de vacina por administração nasal (vacinal intra-nasal, vacina nasal para simplificação) tem por objetivo promover resposta sistêmica e local na região da orofaringe. Essa vacina induz resposta celular, T CD4 e T CD8, além de anticorpos neutralizantes virais do tipo IgA secretora. A formulação desenvolvida absorve o antígeno em uma nanopartícula que é inserida com adjuvante em outra nanopartícula que tem a capacidade de atravessar as barreiras de cílios e muco para poder fixar nas células muconasais onde provoca a resposta imune. Os testes de imunogenicidade foram feitos em roedores nas mais diversas condições, inclusive como dose de reforço para animais pré-vacinados, em semelhança ao que é a situação atual da maioria dos cidadãos brasileiros. Para chegarmos ao protótipo vacinal MultiCoVax, testamos um grande número de antígenos e formulações. Uma vacina com essas características é almejada em todo mundo, na medida que evita a infecção e a doenças, preenchendo, assim, as necessidades para controle do COVID19 para todos. Nesta proposta, pretendemos finalizar os estudos pré-clínicos já iniciados para continuação do projeto, que incluirá as seguintes fases: (1) Testes para ajustes finais de expressão dos construtos candidatos e desenvolvimento dos processos e (2) Ajustes de processos de produção e purificação de proteínas recombinantes, (3) Desenvolvimento de linhagem celular com expressão estável do antígeno vacinal quimérico, (4) Finalização de experimentos de eficácia não-clínica em camundongos K18-ACE2 transgênicos em NB3, (6) Desenvolvimento do acompanhamento regulátório até ANVISA. (7) Fortalecimento de parcerias estratégicas e comunicação dos resultados do projeto. Após das atividades descritas neste projeto, esperamos iniciar a condução do Ensaio Clínico de Fase I/II, randomizado, duplo cego controlado com placebo e escalonamento de dose, para teste da vacina candidata nasal MultiCoVax, avaliada como reforço nasal de vacinação.

A recente pandemia causada pelo surgimento de um novo coronavírus (SARS-CoV-2) é uma séria emergência global em saúde que necessita de medidas profiláticas e terapêuticas urgentes. Neste contexto, pretendemos produzir e caracterizar anticorpos monoclonais (mAbs) humanos que possuam atividade neutralizante contra o SARS-CoV-2. Esta estratégia é bastante relevante pois estudos utilizando plasma de pacientes curados já mostraram que anticorpos neutralizantes são capazes de inibir a infecção viral e reduzir rapidamente os sintomas e a evolução da doença. Nossa abordagem baseia-se na busca por células B de memória produtoras de anticorpos protetores em indivíduos previamente infectados e que se recuperaram. Para selecionar os linfócitos B específicos para SARS-CoV-2 utilizaremos como isca o domínio de ligação ao receptor (RBD) presente na proteína majoritária da superfície viral (proteína spike, S), responsável pela ligação do vírus à célula alvo. Em seguida, realizaremos a clonagem e expressão de mAbs a partir das sequências de DNA que codificam para a porção variável do receptor de células B específicas para o RBD. A obtenção dos mAbs específicos abre várias possibilidades como por exemplo: (a) o uso de combinações de anticorpos neutralizantes no tratamento de pacientes com COVID-19 grave, (b) o mapeamento dos sítios de ligação destes anticorpos poderá fornecer alvos mais específicos para o desenvolvimento de uma vacina eficaz e (c) uso em ensaios simples de competição para medir os níveis de anticorpos protetores (que competem com os mAbs neutralizantes) na população.

No baço de camundongos encontram-se principalmente dois subtipos de células dendríticas (DCs), um que expressa o receptor endocítico CD205 (DEC205) e a cadeia alfa do receptor CD8 (DEC205+CD8a+) e outro que expressa o receptor endocítico DCIR2, mas não expressa a molécula CD8 (DCIR2+CD8a-). O subtipo DEC205+CD8a+ tem capacidade de instruir tanto linfócitos T CD4+, quanto fazer apresentação cruzada de antígenos extracelulares e instruir linfócitos T CD8+. Já o subtipo DCIR2+CD8a- está mais associado com a instrução de células T CD4+. Recentemente, através do direcionamento de um antígeno para cada um desses subtipos utilizando anticorpos monoclonais híbridos contra os receptores DEC205 ou DCIR2, identificamos que eles induzem polarizações distintas de células T CD4+ auxiliares. Nesse projeto, pretendemos aprofundar nossos estudos e avaliar o papel das vias de sinalização de STAT1, STAT3, STAT5 e STAT6 nas DCs DEC205+CD8a+ e DCIR2+CD8a-, com o objetivo de estudar a capacidade que cada subtipo possui de instruir a resposta T auxiliar. Para isso, pretendemos utilizar camundongos em que as moléculas STAT 1, STAT3 e STAT5 estarão especificamente deletadas nas DCs e camundongos STAT6 nocaute. As DCs esplênicas provenientes desses animais serão isoladas e sua capacidade de apresentar antígenos para células T CD4+, bem como a instrução das mesmas para os perfis Th1, Th2, Th17, TFH e TReg, serão analisadas in vitro. Para estudar a influência das vias de STATs na instrução de células T CD4+ por ambos os subtipos de DCs in vivo, utilizaremos a estratégia de direcionamento de antígenos para DCs CD8a+ via o receptor DEC205 e CD8a- via o receptor DCIR2. Esperamos contribuir para o entendimento dos mecanismos relacionados com a especialização de cada subtipo de DCs em instruir uma resposta de células T CD4+.

Cerca de metade da população mundial está em risco de contrair malária, a doença parasitária humana mais mortal, responsável por > 200 milhões de casos clínicos e ~ 700 mil mortes por ano. A ausência de uma vacina eficaz contra a malária é um grande obstáculo para o controle e eliminação desta doença devastadora. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina contra a malária é incentivado pela possibilidade de proteção de seres humanos, conhecida desde os anos 70, através da vacinação com múltiplas e altas doses de esporozoítos vivos atenuados, que constituem o estágio parasitário móvel e infeccioso transmitido por mosquitos. Infelizmente, este método não é apropriado para uso em protocolos de vacinação em massa devido a grandes impedimentos operacionais e econômicos relacionados à produção, armazenamento e entrega de um grande número de parasitas vivos atenuados em países tropicais. Inversamente, vacinas de subunidades contra as formas pré-eritrocíticas (PE), que têm como alvo esporozoítos e estágios hepáticos, são mais adequadas para serem utilizadas em vacinação em massa. No entanto, até o presente momento, essas vacinas protegem humanos apenas moderadamente, como observado para a RTS,S, a vacina candidata PE mais proeminente baseada na proteína circumsporozoita (CSP), a principal proteína de superfície dos esporozoítos. Além disso, o número de antígenos PE protetores, entre as milhares de proteínas PE possíveis, é extremamente limitado e os antígenos disponíveis são apenas fracamente protetores. Portanto, nosso projeto de colaboração internacional se propõe a melhorar a proteção induzida por vacinas PE utilizando uma inovadora dupla abordagem biológica-vacinação que combina nossas expertises complementares em direcionamento de antígenos para células dendríticas, em vetorização lentiviral e no estudo da biologia dos parasitas PE da malária usando técnicas de imagem in vivo. A estratégia do nosso projeto baseia-se na utilização de um relevante modelo pré-clínico de malária murina, onde camundongos são extremamente suscetíveis ao desafio com esporozoítos. Neste modelo, vacinas contendo a CSP não são capazes de induzir proteção completa contra um desafio rigoroso com esporozoítos, como observado em seres humanos. Utilizando este modelo, desenvolvemos um protocolo preliminar em que anticorpos anti-CSP protegeram completamente animais desafiados com uma dose de 5.000 esporozoitos. Nós inicialmente propomos elucidar os mecanismos desta proteção esterilizante mediada por anticorpos usando técnicas de imagem in vivo e uma biblioteca de anticorpos monoclonais anti-CSP para determinar quando, onde, como e que tipo de anticorpo está eliminando o parasita na pele e no fígado dos animais protegidos. Em seguida, nos propomos a melhorar este protocolo humoral protetor através da indução de resposta de células T CD8+ induzida pelo direcionamento da CSP para as células dendríticas utilizando anticorpos monoclonais híbridos anti-DEC205 e/ou vetores lentivirais. O terceiro nível de proteção será adicionado pela incorporação de novos antígenos PE protetores provenientes de uma triagem funcional usando vetores lentivirais, onde os cem genes mais abundantes dos estágios PE estão sendo rastreados com base na sua atividade protetora. Em resumo, usando esta abordagem pretendemos: i) caracterizar atividades efetoras esterilizantes em um nível clonal usando métodos inovadores de imagem in vivo, ii) otimizar a resposta das células T CD8+ através do direcionamento de antígenos para células dendríticas, e iii) testar as formulações multi-antigênicas para ampliar as respostas protetoras contra o parasita. Propomos assim uma dissecção funcional de efetores de proteção, primeiro passo para racionalizar a elaboração de vacinas melhores, e uma estratégia passo a passo para melhorar a proteção humoral e celular centrada na CSP.

O Sub-Projeto MABSZIKA tem como título: Desvendando a resposta humoral induzida pela infecção com o vírus Zika utilizando proteínas recombinantes do envelope viral de flavivírus. A febre Zika é causada por um flavivírus, gênero de vírus de RNA fita simples sentido positivo, pertencente à família Flaviviridae. Este gênero agrupa mais de 50 espécies, sendo muitas de importância médica por infectarem o ser humano. No Brasil, como membros desta mesma família, podemos destacar o vírus da Febre Amarela, para o qual já existe uma vacina bastante eficiente, e o vírus Dengue (DENV), que circula no país há décadas e tem sido responsável por diversas epidemias recentes. O vírus Zika (ZIKV) foi introduzido mais recentemente no Brasil (provavelmente em meados de 2013) e vem sendo associado a um aumento expressivo no número de bebês com microcefalia nascidos de mães supostamente infectadas. Os vírus desta família são transmitidos geralmente por picadas de fêmeas do mosquito Aedes aegypti, e podem causar desde infecções brandas, com quadro febril semelhante ao da gripe, até manifestações clínicas graves como hemorragias e encefalites. Uma comparação entre as proteínas codificadas pelos genomas de ZIKV e DENV, por exemplo, mostra que há cerca de 55 de identidade entre o ZIKV e os diferentes sorotipos de DENV (1-4) circulantes no Brasil. Essa alta identidade pode levar a um reconhecimento cruzado de diferentes proteínas pelo sistema imunológico, fato que pode ter implicações tanto para proteção quanto para a patogenia destas doenças. Por exemplo, o reconhecimento cruzado de anticorpos contra os diferentes sorotipos de DENV pode levar a um fenômeno conhecido como ADE (antibody dependent enhancement) que prevê a potencialização de uma infecção secundária quando a infecção primária for causada por um vírus de sorotipo diferente. De fato, vários estudos corroboram essa teoria. Atualmente no Brasil, o ZIKV está circulando simultaneamente em áreas em que há circulação de DENV.Por esse motivo, torna-se bastante relevante estudar o componente humoral da resposta contra o ZIKV e avaliar se os anticorpos induzidos durante a infecção podem apresentar alguma reatividade cruzada contra DENV. O conhecimento gerado neste contexto pode trazer informações relevantes sobre epítopos amplamente neutralizantes ou que desempenham um importante papel na patogenia da doença que podem ser então estudados no contexto do desenvolvimento de vacinas mais eficientes. Assim, este subprojeto tem por objetivo estudar em detalhe a resposta imune humoral induzida em pacientes infectados pelo vírus Zika (ZIKV) utilizando uma abordagem inovadora que consiste na clonagem e expressão de mAbs a partir de sequências obtidas de plasmablastos de pacientes com infecção recente pelo ZIKV. Para tanto, pretendemos isolar plasmablastos do sangue periférico de pacientes recentemente infectados (dias 6-7 após o início dos sintomas) utilizando uma técnica inicialmente descrita pelo grupo do Dr. Michel C. Nussenzweig (The Rockefeller University, EUA). Nesta técnica, os genes que codificam para as porções variáveis das cadeias leve e pesada das imunoglobulinas provenientes de linfócitos B únicos (separados por sorting) são clonados em vetores de expressão em células eucarióticas fusionados à porção constante da IgG1 humana. Desta forma, um grande número de anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para a infecção por ZIKV serão produzidos in vitro e poderemos fazer uma análise bastante detalhada das propriedades de ligação, afinidade e neutralização de tais anticorpos contra o vírus inteiro ou também contra proteínas virais específicas.

A febre Zika é causada por um flavivírus, vírus de RNA fita simples sentido positivo, pertencente à família Flaviviridae. Esta família agrupa mais de 50 espécies, sendo muitas de importância médica por infectarem o ser humano. No Brasil, como membros desta mesma família, podemos destacar o vírus da Febre Amarela (YFV), para o qual já existe uma vacina bastante eficiente, e o vírus Dengue (DENV), que circula no país há décadas e tem sido responsável por diversas epidemias recentes. O vírus Zika (ZIKV) foi introduzido mais recentemente no Brasil [provavelmente em meados de 2013 e vem sendo associado a um aumento expressivo no número de bebês com microcefalia nascidos de mães supostamente infectadas (Zanluca et al., 2015). Os vírus desta família são transmitidos geralmente por picadas de fêmeas do mosquito Aedes aegypti e podem causar desde infecções brandas, com quadro febril semelhante ao da gripe, até manifestações clínicas graves como hemorragias e encefalites. Uma comparação entre as proteínas codificadas pelos genomas de ZIKV e DENV, por exemplo, mostra que há cerca de 55 de identidade entre o ZIKV e os diferentes sorotipos de DENV (1-4) circulantes no Brasil. Essa alta identidade pode levar a um reconhecimento cruzado de diferentes proteínas pelo sistema imunológico, fato que pode ter implicações tanto para proteção quanto para a patogenia destas doenças. Por exemplo, o reconhecimento cruzado de anticorpos contra os diferentes sorotipos de DENV pode levar a um fenômeno conhecido como ADE (antibody dependent enhancement) que prevê a potencialização de uma infecção secundária quando a infecção primária for causada por um vírus de sorotipo diferente. De fato, vários estudos corroboram essa teoria. Atualmente no Brasil o ZIKV está circulando simultaneamente em áreas em que há circulação de DENV. Por esse motivo, torna-se bastante relevante estudar o componente humoral da resposta contra o ZIKV e avaliar se os anticorpos induzidos durante a infecção podem apresentar alguma reatividade cruzada contra DENV. De fato, um estudo preliminar utilizando anticorpos monoclonais obtidos de pacientes com infecção pelo ZIKV mostrou alta reatividade cruzada contra porções específicas da proteína do envelope (E) viral entre DENV e ZIKV. A extensão desta reatividade precisa ser abordada de forma mais sistemática e utilizando soros de um número maior de pacientes, tanto infectados com DENV quanto com ZIKV. O conhecimento gerado neste contexto pode trazer informações relevantes sobre as regiões da proteína E que induzem anticorpos amplamente neutralizantes ou que desempenham um importante papel na patogenia da doença. Assim, este projeto tem por objetivo principal estudar detalhadamente a resposta imune humoral induzida em pacientes infectados por ZIKV ou DENV utilizando diferentes proteínas recombinantes do envelope viral. Para tanto, pretendemos produzir especificamente em células de inseto a proteína do envelope (E) tanto do ZIKV quanto dos 4 sorotipos do DENV. Esta proteína pode ser dividida em 3 domínios estruturais e funcionais: o domínio central (EDI), o domínio responsável pela dimerização que contém o peptídeo de fusão (EDII) e o domínio (EDIII) envolvido na ligação à célula alvo. Produziremos ainda os domínios EDI/II e EDIII separadamente tanto para ZIKV quanto para os 4 sorotipos de DENV. Soros de pacientes previamente infectados por DENV ou ZIKV serão então testados por ELISA para reatividade contra as proteínas E inteiras ou contra seus diferentes domínios. Adicionalmente, os mesmos soros serão testados em ensaios de neutralização utilizando células VERO ou em ensaios de ADE utilizando células K562. Pretendemos com este projeto avaliar de forma mais detalhada a resposta humoral dos pacientes previamente infectados com DENV ou ZIKV contra as diferentes proteínas E.

As células dendríticas (DCs) possuem importância crítica na interação entre o sistema imune inato e adaptativo, fagocitando antígenos e apresentando-os para linfócitos, sendo capazes de induzir tolerância ou fortes respostas adaptativas contra os patógenos. Esta propriedade faz com que estas células sejam um interessante alvo para o desenvolvimento de novas estratégias vacinais. Nos últimos 5 anos, implantamos pela primeira vez no Brasil uma estratégia que visa o direcionamento de antígenos para as DCs in vivo. Esta estratégia consiste na utilização de um anticorpo monoclonal (mAb) contra um receptor presente na superfície da DC em fusão com o antígeno de interesse. A administração de baixas doses do mAb de fusão, na presença de estímulos de maturação para as DCs, é capaz de ativar células T antígeno-específicas e induzir a produção de altos títulos de anticorpos contra o antígeno. Atualmente as DCs constituem uma população de células bastante heterogênea. Alguns marcadores de superfície são capazes de definir subpopulações que possuem capacidades diferentes para processar e apresentar antígenos, sendo esta capacidade diferencial a responsável pela ativação de populações específicas de células T. Em um artigo recentemente publicado (1), fomos capazes de direcionar a proteína não-estrutural 1 (NS1) do vírus da dengue para duas subpopulações de DCs. O direcionamento do antígeno para a população que expressa o receptor endocítico DEC205 induziu forte resposta imune anti-NS1 e foi capaz de proteger animais contra um desafio com o vírus DENV-2 (cepa NGC), quando utilizamos poly I:C como adjuvante. Esta resposta parece ser mediada principalmente por linfócitos T, porém a participação dos anticorpos na patogenia ou proteção também precisa ser estudada em maiores detalhes. Com o intuito de estudar melhor a resposta mediada pelos linfócitos T, pretendemos mapear o(s) epitopo(s) específico(s) presente(s) na NS1 que é (são) responsáveis pela geração das células T CD4+ específicas e protetoras em nosso modelo. O papel dos anticorpos anti-NS1 na proteção ou patogenia da doença será estudado através de ensaios de transferência passiva e através da análise da função plaquetária nos animais imunizados. Além da proteína NS1, a proteína do envelope (E) do vírus da dengue também é alvo do sistema imune e anticorpos que a reconhecem podem ter atividade neutralizante. Por outro lado, há relatos de que tais anticorpos podem também ter efeito deletério e contribuir para a patogenia da doença. Para estudar o papel dos anticorpos anti-E em nosso modelo de direcionamento, pretendemos gerar mAbs de fusão (#945;DEC ou #945;DCIR2) com a proteína E e avaliar cada componente de resposta imune anti-E na proteção e/ou patogenia da doença. Em resumo, neste projeto pretendemos então analisar o papel das respostas imunes celular e humoral na proteção ou na patogenia da dengue quando as proteínas NS1 e E são direcionadas para duas populações distintas de DCs.

As células dendríticas (DCs) possuem importância crítica na interação entre o sistema imune inato e adaptativo, fagocitando antígenos e apresentando-os para linfócitos, sendo capazes de induzir tolerância ou fortes respostas adaptativas contra os patógenos. Esta propriedade faz com que estas células sejam um interessante alvo para o desenvolvimento de novas estratégias vacinais. Nos últimos 4 anos, implantamos pela primeira vez no Brasil uma estratégia que visa o direcionamento de antígenos para as DCs in vivo. Esta estratégia consiste na utilização de um anticorpo monoclonal (mAb) contra um receptor presente na superfície da DC em fusão com o antígeno de interesse. A administração de baixas doses do mAb de fusão, na presença de estímulos de maturação para as DCs, é capaz de ativar células T antígeno-específicas e induzir a produção de altos títulos de anticorpos contra o antígeno. Atualmente as DCs constituem uma população de células bastante heterogênea. Alguns marcadores de superfície são capazes de definir subpopulações que possuem capacidades diferentes para processar e apresentar antígenos, sendo esta capacidade diferencial a responsável pela ativação de populações específicas de células T. Anteriormente, fomos capazes de direcionar a proteína não-estrutural 1 (NS1) do vírus da dengue para duas subpopulações de DCs. O direcionamento do antígeno para a população que expressa o receptor endocítico DEC205 induziu forte resposta imune anti-NS1 e foi capaz de proteger animais contra um desafio com o vírus DENV-2 (cepa NGC), quando utilizamos poly I:C como adjuvante. Esta resposta parece ser mediada principalmente por linfócitos T, porém a participação dos anticorpos na patogenia ou proteção também precisa ser estudada em maiores detalhes. Com o intuito de estudar melhor a resposta mediada por pelos linfócitos T, pretendemos mapear o(s) epitopo(s) específico(s) presente(s) na NS1 que é (são) responsáveis pela geração das células T CD4+ específicas e protetoras em nosso modelo. O papel dos anticorpos anti-NS1 na proteção ou patogenia da doença será estudado através de ensaios de transferência passiva e através da análise da função plaquetária nos animais imunizados. Além da proteína NS1, a proteína do envelope (E) do vírus da dengue também é alvo do sistema imune e anticorpos que a reconhecem podem ter atividade neutralizante. Por outro lado, há relatos de que tais anticorpos podem também ter efeito deletério e contribuir para a patogenia da doença. Para estudar o papel dos anticorpos anti-E em nosso modelo de direcionamento, pretendemos gerar mAbs de fusão (anti-DEC ou anti-DCIR2) com a proteína E e avaliar cada componente de resposta imune anti-E na proteção e/ou patogenia da doença. Em resumo, neste projeto pretendemos então analisar o papel das respostas imunes celular e humoral na proteção ou na patogenia da dengue quando as proteínas NS1 e E são direcionadas para duas populações distintas de DCs.

Todos os anos cerca de 50 milhões de mulheres grávidas estão expostas à malária, o que representa um elevado risco de vida para a mãe e para o feto em desenvolvimento. A malária associada à gravidez (PAM, do inglês Pregnancy-Associated Malaria ) caracteriza-se pela adesão de parasitas na placenta, anemia materna, crescimento intra-uterino retardado, bem como diminuição da viabilidade fetal. O grande número de fatores potencialmente envolvidos na PAM, associado às grandes dificuldades no estudo da doença em humanos, faz com que as bases moleculares desta disfunção placentária permaneçam ainda mal compreendidas. Uma grande parte dos problemas gerados pelo plasmódio na gestação deve-se ao fato da placenta oferecer um ambiente único para o desenvolvimento de subpopulações do parasita. Assim, o desenvolvimento de estratégias vacinais que possibilitem minimizar o sequestramento de eritrócitos infectados neste órgão poderia evitar os danos causados à gestação. Este projeto visa, por meio de uma abordagem multiparamétrica, identificar os componentes celulares e moleculares da imunidade inata e adquirida que contribuem para o desenvolvimento da PAM. Paralelamente, pretende-se desenvolver protocolos vacinais baseados em uma nova tecnologia que é capaz de direcionar antígenos para células dendríticas (DCs, do inglês Dendritic Cells ). Esta metodologia tem se mostrado bastante promissora, pois é capaz de direcionar o antígeno de interesse diretamente para as DCs (as principais responsáveis pela ativação da resposta imune adquirida). Para tanto, utilizam-se anticorpos quiméricos direcionados para receptores endocíticos presentes na superfície das DCs em fusão com o antígeno de interesse. Neste projeto pretendemos ainda inserir sequências de proteínas expressas por parasitas do gênero Plasmodium (entre outras) em fusão com as sequência dos anticorpos anti-DC e gerar anticorpos quiméricos capazes de direcionar estas proteínas para as DCs.

Projeto 15203*12 - CNPq / INCTV.
Uma nova estratégia para aumentar a imunogenicidade de proteínas recombinantes solúveis foi descrita na qual o antígeno é expresso em fusão com anticorpos dirigidos para receptores específicos presentes na superfície de células dendríticas (DCs). Quando pequenas doses destes anticorpos recombinantes são administradas a animais, a indução de forte imunidade celular e humoral pode ser observada. Os receptores de DCs utilizados pelo nosso grupo são o DEC-205 e o DCIR2. Anticorpos quiméricos anti-DEC 205 e/ou anti-DCIR2 serão produzidos em fusão com proteínas derivadas dos parasitas Plasmodium yoelii (P. yoelii) e P. vivax. As proteínas selecionadas para o nosso estudo serão inicialmente a MSP142 de P. yoelii e de P. vivax. Baseado nos resultados iniciais poderemos gerar também proteínas recombinantes quiméricas das proteínas AMA-1 e MAEBL. 
A análise da resposta imune humoral e celular será feita após a administração de uma única dose dos anticorpos quiméricos anti-DEC ou 33D1, ou seguida de uma dose de reforço consistindo do próprio anticorpo, ou de proteína recombinante bacteriana ou de outra fonte. Imunização de camundongos com os diferentes anticorpos quiméricos será feita na presença de diferentes estímulos de ativação para as CDs (anti-CD40 e ligantes de TLRs). No caso de camundongos imunizados com proteínas contendo os genes de P. yoelii poderemos efetuar o desafio com formas sanguíneas destes parasitas. No caso da proteína de P. vivax, testaremos a capacidade de inibir a infecção in vitro.

Células dendríticas (DCs) são críticas no processo de indução de imunidade e tolerância periférica. Este fato abriu a possibilidade de que estas células venham a ser alvos de possíveis manipulações visando a geração de imunoterápicos indutores ou supressores da resposta imune. Recentemente, foi demonstrado que é possível enviar antígenos diretamente para as DCs. Quando isto acontece na ausência de um estímulo inflamatório concomitante, o resultado é a indução de tolerância imunológica. Por outro lado, quando o antígeno é enviado a estas mesmas células na presença de um estímulo inflamatório, o resultado é a indução de uma forte resposta imunológica. O direcionamento do antígeno para as DCs in vivo é feito pela administração de baixas doses de uma proteína recombinante quimérica consistindo de um anticorpo monoclonal específico para receptores presentes na superfície das CDs em fusão com o antígeno de interesse. Atualmente estamos utilizando anticorpos monoclonais que tem a capacidade de ligar-se aos receptores DEC 205 (anticorpo anti-DEC 205) e DCIR2 (anticorpo 33D1). 
Em estudos que estamos desenvolvendo, demonstramos que estes anticorpos quiméricos são potentes imunógenos capazes de induzir imunidade celular (mediada por linfócitos T CD4+ e CD8+) e humoral duradouras contra o antígeno de interesse. 
Assim, o objetivo principal deste projeto é utilizar os anticorpos quiméricos anti-DEC 205 ou 33D1 em fusão com proteínas derivadas dos parasitas Trypanosoma cruzi e Plasmodium yoelii e do vírus da dengue em protocolos de imunização.

Objetivos: 1.Demonstrar que o direcionamento de proteínas para células dendríticas maduras é um meio eficiente para induzir imunidade mediada por células T na infecção pelo vírus da imunideficiência humano (HIV); 2. Demonstrar que o direcionamento de proteínas do vírus da imunodeficiência símia (SIV) para o receptor DEC-205 presente em células dendríticas maduras em macacos rhesus é eficiente para a indução de imunidade protetora; 3. Desenvolver um método de vacinação contra malária através do envio de proteínas dos parasitas do gênero Plasmodium diretamente para células dendríticas maduras in vivo; 4. Desenvolver uma vacina para malária baseada no vírus da febre amarela (cepa 17D).

Objetivos: Imunizações com DNA plasmidial contendo genes de proteínas expressas em formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi foram capazes de induzir resposta imune estimada pela produção de anticorpos e ativação de linfócitos T CD4 e CD8. O mais importante é que este tipo de imunização aumentou significativamente a resistência de camundongos à infecção experimental pelo T. cruzi. Como os genes usados até agora são expressos especificamente nas formas tripomastigotas, talvez a imunidade possa ser incrementada pela utilização de genes expressos nas formas de multiplicação intracelular (amastigotas). Baseado nesta possibilidade, pretendemos nos aprofundar em alguns aspectos da imunização genética na doença de Chagas experimental imunizando animais com genes expressos em formas tripomastigotas ou amastigotas. Acreditamos que as informações obtidas neste modelo contribuirão para o entendimento dos múltiplos aspectos imunológicos envolvidos por um lado na doença de Chagas e, por outro lado, na vacinação genética. Serão os objetivos específicos deste projeto: 1) Determinar se diferentes plasmídios contendo ou o gene inteiro da trans-sialidase ou partes deste apresentam as mesmas propriedades imunogênicas que o plasmídio 154/13. 2) Isolamento e caracterização dos genes que codificam para proteínas similares as ASP-1 e ASP-2 expressos em amastigotos da cepa Y de T. cruzi. 3) Clonagem deste(s) gene(s) no vetor pcDNA3 para imunização com DNA e nos vetores pET ou pGST para expressão em bactérias. 4) Caracterização da resposta imune induzida pela imunização com plasmídios contendo o(s) gene(s) expresso(s) nas formas amastigotas. 5) Comparação da resposta imune induzida pela imunização com plasmídios contendo gene(s) expresso(s) em amastigotas (ASP-2) ou tripomastigotas (TS) de T. cruzi. 6 Avaliação do possível efeito aditivo na resposta imune protetora gerada pela imunização simultânea de camundongos com genes expressos nas formas amastigotas e tripomastigotas do T. cruzi

1. Caracterização de genes de Trypanosoma cruzi codificadores de proteínas envolvidas na invasão das células hospedeiras;
2. Projeto genoma do T. cruzi: construção do mapa físico e cariótipo molecular;
3. Caracterização de antígenos de T. cruzi de valor no serodiagnóstico da doença de Chagas.