Marcio Vinicius Bertacine Dias.

O CEPID B3 é uma rede com pólos de pesquisa sediados em São Paulo (IQ-USP, ICB-USP), Campinas (IB-UNICAMP, IAC), Ribeirão Preto (FCFRP-USP, FMRP-USP) e Rio Claro (UNESP) que colaborará na realização de pesquisas básicas de ponta sobre os mecanismos moleculares de importância primordial para a reprodução bacteriana, o comportamento multicelular, a competição, a colonização e as interações de bactérias com seus hospedeiros eucarióticos e bacteriófagos. Os conhecimentos adquiridos serão utilizados na busca e desenvolvimento de novos inibidores químicos e biológicos do crescimento bacteriano.

A parece celular micobacteriana é uma estrutura complexa e altamente regulada e proteínas envolvidas na sua biossíntese ou remodelamento permite um balanço entre alongamento e divisão celular. Tanto as enzimas que estão relacionadas com a montagem dessa estrutura complexa formada por peptidoglicano, arabinogalactano e ácidos micólicos, como enzimas responsáveis por sua regulação são importantes alvos de fármacos, como os antibióticos ²-lactâmicos ou outros fármacos antituberculose; ou são potenciais candidatos na descoberta ou desenvolvimento de novas moléculas. Assim, entender como proteínas interagem para realizar o controle da biossíntese da parede, ou como transpeptidases atuam na realização de ligações cruzadas do peptidoglicano apresenta forte interesse científico, uma vez que pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de controle da tuberculose. Essa doença é a principal causa de morte por doenças infecciosas e causa a morte e sofrimentos de milhares de pessoas anualmente, principalmente em países da Ásia, África e América Latina, incluindo Brasil. Neste projeto pretendemos elucidar as estruturas cristalográficas de transpeptidases clássicas que realização ligações cruzadas do tipo 3-4 do peptidoglicano, sendo elas as PonA1 e PonA2 bem como a realização da caracterização estrutural de uma transpeptidase não clássica, a Ld-transpeptidase 4 (LDtMt4), que é única em um grupo de 5 enzimas que não apresenta estrutura e que está envolvida em ligações do tipo 3-3 do peptidoglicano micobacteriano. Associado aos estudos estruturais, estamos propondo também caracterizar a interação de antibióticos ²-lactâmicos com essas enzimas através de estudos biofísicos utilizando da calorimetria de titulação isotérmica. Além disso, estamos propondo estudar as enzimas RipA, RpfB e PonA1 e suas interações proteína-proteína e que estão associadas com a regulação da síntese da parede celular. Pretendemos também aplicar técnicas biofísicas para entender como essas proteínas interagem, incluindo cristalografia e ressonância magnética nuclear ou ainda outras técnicas, caso necessário. Além disso, pretendemos aplicar técnicas de desenho de fármacos baseado em fragmentos para a RipA e LDtMt4 utilizando uma biblioteca de compostos in house, uma vez que ela tem se mostrado um potencial alvo para o desenvolvimento de novos fármacos contra tuberculose devido seu papel essencial na virulência e viabilidade de Mycobacterium tuberculosis.

Microrganismos presentes no solo são responsáveis pela produção de um grande número de antibióticos devido à alta competividade neste ambiente por espaço e nutrientes. Tais moléculas ainda podem ser utilizadas pelo homem no tratamento de uma série de enfermidades, incluindo doenças infecciosas e câncer. Algumas classes de antibióticos, como os aminoglicosídeos, revolucionaram a medicina devido aos benefícios que estes trouxeram para ao tratamento de doenças. Porém, a maneira com que os microrganismos produzem esses compostos tem-se tornado um importante ramo da química biológica, tanto pelo potencial biotecnológico que as enzimas relacionadas apresentam, quanto pelos mecanismos catalíticos e estruturas pouco usuais. Nosso grupo de pesquisa tem procurado compreender a biossíntese de algumas dessas moléculas, que incluem os aminoglicosídeos e os ionóforos poliéteres. Neste projeto, pretendemos aprofundar nossos estudos estruturais na biossíntese de duas classes de aminoglicosídeos, que incluem as gentamicinas e a butirosina. Além disso, pretendemos entender estruturalmente enzimas relacionadas com o fechamento de anéis em dois antibióticos ionóforos poliéteres, a tetronasina e tetronomicina. Para a biossíntese de gentamicina, uma série de enzimas dependentes de PLP (GenB1-GenB4) estão envolvidas na produção das gentamicinas do complexo C. Porém, embora essas enzimas apresentem similaridade sequencial, elas realizam reações únicas e atuam como aminotransferases, epimerases e dehidratases. Temos como um dos objetivos deste projeto, determinar as estruturas dessas enzimas, entender os mecanismos estruturais de catálise e também as especificidades por substratos. Por outro lado, a butirosina é um aminoglicosídeo que apresenta um grupo (S)-4-amino-2-hidroxibutirato (AHBA) ligado a um dos seus aminoaçúcares. Este grupo torna a butirosina menos suscetíveis aos mecanismos enzimáticos de resistência. Desta maneira, pretendemos entender estruturalmente duas enzimas que apresentam sequências pouco conservadas, sendo uma relacionada com a biossíntese da porção AHBA e outra relacionado a ligação da porção AHBA à ribostamicina, gerando a butirosina. Com isso, temos como objetivo ganhar insights estruturais que possam levar a aplicações biotecnológicas na produção de novos derivados de aminoglicosídeos. E finalmente, o fechamento de dois anéis na tetronasina e tetronomicina parece ser catalisado por uma classe de enzimas denominada de Diels-Alderases e neste projeto, temos ainda como objetivo iniciar os estudos estruturais de Diels-Alderases hipotéticas da biossíntese desses compostos, com o interesse de mapear os seus sítios ativos e entender a interação com análogos de substratos. Assim, esses resultados podem levar à insights sobre seus mecanismos catalíticos. De maneira geral, pretendemos neste projeto, estudar estruturalmente diferentes problemas relacionados com a biossíntese de produtos naturais que possam ser tanto explorados biotecnologicamente na produção de novos derivados de antibióticos, bem como entender peculiaridades da Natureza em relação as suas enzimas.

Apesar de ser uma das doenças mais antigas e estudadas da humanidade, a infecção causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis segue líder nos índices de incidência e mortalidade, dentre infecções bacterianas. De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 9,6 milhões de novos casos de tuberculose e 1,5 milhão de óbitos foram notificados, em 2014. Além disso, é estimado que cerca de um terço da população mundial esteja infectado pela forma latente do patógeno. Sob este cenário, a busca por novas estratégias de tratamento que combatam o patógeno, em seus estados ativo e latente, se faz necessária. No âmbito da biologia estrutural e funcional, pesquisas recentes têm contribuído para o maior entendimento acerca de mecanismos vitais de M. tuberculosis, como aqueles que envolvem os processos de elongação e divisão celular. Estudos sobre a biossíntese da parede celular, mais especificamente, descobriram que há interação sinérgica entre a endopeptidase RipA e a glicosilase RpfB. Além disso, o complexo por elas formado (RipA-RpfB) é inibido pela proteína de ligação à penicilina PonA1. Isto porque PonA1 e RpfB competem pelo sítio de interação à RipA, dando origem à um mecanismo pós-translacional de regulação das atividades de síntese e hidrólise de peptideoglicano. Entretanto, não existem dados estruturais que auxiliem a compreender o estabelecimento de tais interações intermoleculares e, consequentemente, os mecanismos regulatórios que delas derivam. Além disso, as proteínas RipA e PonA1 apresentam atividade enzimática e são essenciais para o crescimento e estabelecimento da infecção por M. tuberculosis, o que torna essas enzimas alvos atrativos para o desenvolvimentos de novos fármacos. Assim sendo, o presente projeto de pesquisa visa obter e analisar estruturalmente os complexos RipA-RpfB e RipA-PonA1, a fim de colaborar para maior compreensão acerca dos processos fisiológicos nos quais estas proteínas atuam. E, paralelamente, contribuir no campo do desenvolvimento de agentes antituberculares a partir da identificação de compostos líderes pela aplicação de FBDD para as proteínas RipA e PonA1.

A tuberculose é a doença infecciosa com maior taxa de mortalidade a nível global depois da AIDS. Esta doença é causada por Mycobacterium tuberculosis, afetando principalmente os pulmões e disseminando-se por via aérea. O fato de que a bactéria esteja bem adaptada a nossos mecanismos de defensa, a crescente epidemia de AIDS, os poucos medicamentos eficazes disponíveis para combatê-la e o surgimento de cepas resistentes (MDR-TB e XDR-TB) tornaram esta doença um sério problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Neste contexto, a necessidade de novas alternativas e estratégias para controlar a tuberculose são urgentes. Entender os mecanismos de resistência desenvolvidos pela bactéria pode permitir um melhor planejamento de fármacos. A via de biossíntese do folato é uma rota atrativa para o desenvolvimento de novas moléculas devido à dependência das células para seu crescimento. Uma das primeiras moléculas a ser empregada na terapia antituberculosa foi o ácido para-aminosalicílico (PAS), que atualmente é um dos medicamentos de segunda linha usado para tratar esta doença, justamente devido ao relato de um grande número de cepas resistentes. Embora o PAS seja um dos agentes terapêuticos mais antigos, ainda não se tem certeza do seu mecanismo de ação, e consequentemente sobre o seu mecanismo de resistência. Entretanto, o surgimento de cepas resistentes ao PAS abriu-se a possibilidade de desvendar os seus mecanismos de resistência. Entretanto há relatos do sobre qual seria o seu possível mecanismo de resistência, uma vez que têm-se caracterizado mutações nos genes dhfA e thyA que codificam para as enzimas dihidrofolato reductase (DHFR) e timidilato sintase (ThyA). Entretanto um estudo estrutural dos mutantes para estas enzimas ainda não foi realizado e assim o efeito destas mutações na estrutura destas enzimas é desconhecido. Neste projeto pretendemos obter estruturas cristalográficas para mutantes isolados clínicos da DHFR e da ThyA em complexo com substratos na tentativa de entender as bases moleculares do mecanismo de resistência ao PAS em M. tuberculosis.

Os aminoglicosídeos são antibióticos que apresentam um núcleo central condensado com vários outros açúcares não usuais, como aminoaçúcares e deoxiaçúcares, que junto com os seus grupos funcionais são críticos para a sua atividade antibiótica, que está relacionada com a inibição da síntese proteica, devido a sua interação com a subunidade 305 do ribossomo bacteriano. Os antibióticos aminoglicosídeos são moléculas largamente utilizadas na medicina, apesar dos seus efeitos tóxicos, para o tratamento de doenças infecciosas. Nosso grupo de pesquisa, juntamente com o Grupo de Pesquisa do Professor Peter Leadlay, do Departament of Biochemistry - University of Cambridge-UK, vem estudando uma série de enzimas da biossíntese de alguns aminoglicosídeos, como a gentamicina e sisomicina. Várias dessas enzimas apresentam completa ausência de estudos funcionais, tanto in vitro como in vivo e as funções das mesmas são somente hipotéticas baseado em análises de homologia sequencial. Além disso, essas biossínteses apresentam peculiaridades que podem ser exploradas em biossíntese combinatorial gerando novos derivados de aminoglicosídeos que possam apresentar atividades biológicas alteradas. Preliminarmente vários dos genes responsáveis para estas enzimas já foram clonados, suas atividades cinéticas caracterizadas pelo laboratório do Prof. Peter Leadlay e estudos cristalográficos e biofísicos estão sendo realizados por nosso laboratório, na qual pelo menos duas dessas enzimas já foram cristalizadas e as estruturas serão resolvidas por métodos experimentais devido à baixa similaridade com qualquer outra estrutura. A possibilidade de mobilização dos grupos de pesquisa poderá contribuir fortemente em uma formação multidisciplinar por ambas as partes no processo de desenvolvimento de novos antibióticos, permitindo a troca de conhecimentos de técnicas biofísicas, caracterização cinética e de genética e biologia molecular de Streptomyces.

Duas doenças que são causadas por micobactéria e representam sérios problemas de saúde pública tanto no Brasil, como em outros países em desenvolvimento, são a tuberculose e hanseníase. A tuberculose, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, é uma das principais causas de morte por doenças infecciosas na população humana. Enquanto que a hanseníase, causada pelo M. leprae, apesar de não ser letal, causa a invalidez dos portadores em estágio avançado da infecção e é considerada uma das doenças mais antigas da humanidade. Entretanto, apesar da importância socioeconômica destas duas doenças, o entendimento da biologia dos agentes infecciosos e o desenvolvimento de novas drogas ainda são necessários. A via de biossíntese de folato é uma via atrativa para o desenvolvimento de novas moléculas por ser essencial para o crescimento de ambos os microorganismos. Na verdade, hanseníase pode ser tratada com a droga dapsona, que é uma sulfonamida, e que inibe a enzima dihidropteroato sintase (DHPS), o quarto passo da via de síntese de folato, apesar de haver relatos de cepas resistentes. Por outro lado, nenhuma droga sulfonamida tem efeito sobre M. tuberculosis, mesmo com a alta identidade seqüencial entre estas duas enzimas. Além disso, apesar de a estrutura da DHPS de M. tuberculosis ser conhecida, não se sabe o mecanismo de ligação para o seu substrato p-ABA, e não há qualquer estrutura para a DHPS de M. leprae. Assim nesta proposta, pretendemos obter dados estruturais do mecanismo de ligação de drogas sulfonamidas para as enzimas de M. tuberculosis e de M. leprae e também compreender o seu mecanismo de especificidade para estes dois organismos. Para isso, construções mutantes para ambos as enzimas serão geradas e dados de calorimetria de titulação isotérmica e de cinética enzimática serão obtidos. Com esses dados esperamos auxiliar no entendimento do mecanismo de ligação das drogas sulfonamidas em micobactérias e contribuir para o desenvolvimento de novas moléculas bioativas.

A natureza produz um grande número de moléculas que apresentam aplicações clinicas, incluindo antibióticos, antitumorais e imunosupressivos. Esses compostos são produzidos principalmente por plantas, fungos e bactérias através de vias biossintéticas. Atualmente existe uma vasta literatura a respeito desses compostos, dos organismos que os produzem e das proteínas relacionadas com sua síntese. Esse conhecimento por sua vez, pode ser aplicado ao desenvolvimento de estratégias que permitem o desenvolvimento de ferramentas e abordagens para a produção de derivativos de produtos naturais com maior eficácia ou atividade farmacológica alterada. Entre as ferramentas e abordagens utilizadas, encontram se aqueles na qual se emprega biologia molecular para criar novas moléculas baseado na diversificação de grupos funcionais. Essas técnicas utilizam tanto a síntese de novos compostos in vivo como in vitro. Nas técnicas in vitro diferentes scaffoldings de antibióticos podem ser incubados com determinados grupos funcionais na presença de transferases. Mutação sítio dirigida ou a trocas de domínios funcionais com o objetivo de alterar ou relaxar a especificidade de transferases tem permitindo a incorporação de diferentes radicais. Entretanto, para a utilização destas técnicas, o conhecimento das estruturas tridimensionais é necessário e apenas um limitado número de estruturas é conhecido. As glicosiltransferases representam uma classe de enzimas na qual estas abordagens vêm sendo utilizadas com sucesso, principalmente aquelas envolvidas na biossíntese de antibióticos glicopeptídicos, aminoglicosídicos e macrolídicos. Outras classes de enzimas que essas técnicas têm sido aplicadas são as halogenases, devido à comprovação, que átomos, principalmente, o cloro altera em muitas ordens de grandeza as propriedades farmacológicas de determinados compostos. Porém, há somente um limitado número de estudos estruturais a respeito das halogenases. Desta forma, neste projeto, pretendemos elucidar as estruturas cristalográficas de diferente transferases e halogenases das vias biossintéticas de antibióticos glicopeptídicos, macrolídeos e aminoglicosídeos. As transferases alvo deste projeto são principalmente glicosiltransferases presentes nos clusters gênicos dos antibióticos macrolídeos e aminoglicosídeos, e halogenases presentes nos clusters gênicos dos antibióticos glicopeptídicos. Para isso, os genes referentes a estas enzimas serão clonados e expressos e seus produtos purificados, principalmente através de colunas de afinidade. Serão obtidos cristais para as proteínas e as estruturas cristalográficas serão determinadas. Pesquisadores da University of Cambridge estarão colaborando neste projeto. Eles ficarão responsáveis pelos estudos funcionais das enzimas a serem estudadas e também da aplicação de técnicas para obtenção de enzimas com especificidade relaxada para os substratos com o propósito de geração de moléculas com novas propriedades farmacológicas.

Tetranomicina, tetranosina e lasalocid são antibióticos ionóforos produzidos por diferentes espécies de streptomyces. Entretanto na via de biossíntese deses antibióticos, assim como na via de outros antibióticos ionófors é encontrado em um dos seus passos uma epoxide hidrolase. Esta enzima, apesar de apresentar alta homolgia entre as diferentes vias, possuem mecanismo de cátalise totalmente distintos devido a sua alta espeficidade pelos seus substratos. Devido ao pouco entendimento do mecanismo de catálise destas enzimas devido a realização de uma catálise bastante atípica e também ao conhecimento limitado da estrutura destas enzimas o objetivo do projeto e a determinação das estruturas destas enzimas tanto na sua forma apo como na presença de análogos de substrato.

A enzima dehidroquinato dehidratase (DHQase) é a terceira enzima da via do ácido chiquimico. Esta via tem sido intensivamente estudada devido ao seu potencial na descoberta de novas drogas contra agentes infecciosos, principalmente pelo fato dela estar presente em microorganismos mas não estar presente no homem. Neste projeto temos como objetivo determinar as bases estruturais de várias móleculas com propriedades inibitórias para esta enzima sintetizadas baseado no estado de transição e também na identificação de compostos que ocupam uma segunda cavidade próxima ao sítio ativo.

Devido ao surgimento de cepas de bactérias, principalmente methicillin resistant S. aureus resistentes a vancomicina, o campo de estudo na descoberta de novos antibitóticos tem cada vez mais sendo necessário. Neste projeto nós mostramos que a construção de proteínas quimeras utilizando diferente enzimas das vias de biossíntese de antibióticos glicopeptídicos apresentam como um potencial na geração de derivativos de antibióticos, principalmente derivativos de vancomicina e teicoplanin. O objetivo do projeto e validar estruturalmente a transferência de diferentes açúcares para o núcleo de antibióticos glicopeptídicos atravéz da determinação de estruturas quiméricas em complexo com nucleotídeos, análogos e vancomicina.

Fluoroacetato é um composto altamente tóxico (geralmente utilizado como veneno contra ratos) que é sintetizado por algumas espécies de plantas e bactérias, principalmente do gênero Streptomyces. Neste projeto, temos com objetivo determinar a estrutura cristalográfica da última enzima da via deste composto em S. catleya que responsável tanto pela resistência como para liberação de fluoroacetato. Está enzima é uma tioesterase com um hot dog folding, que apesar de apresentar baixa homologia e similaridade com outras tioesterase, apresenta o folding bastante conservado. Entretanto a tioesterase presente nesta via biossintética apresenta uma atípica triade catalítica. Neste projeto temos como objetivo estudar estruturalmente e cineticamente o efeito de mutações sítio dirigida nos resíduoes desta triade.