Frederico Jose Gueiros Filho.

As perdas de soja devido a áreas infectadas por nematóides variam de 10 a 20% da produção significando uma perda estimada entre 100 a 200 milhões de reais. Dessa forma, o dano econômico para o cultivo de soja devido a nematóides é bastante significativo e deve aumentar na medida em que a prática agrícola intensiva e o uso concomitante de pesticidas promovam o surgimento de variantes resistentes. O biocontrole de pragas tem surgido como uma alternativa ao uso de pesticidas. Dentre seus vários atrativos observamos menores danos ao meio ambiente e menos efeitos tóxicos e mais direcionados aos fito-patógenos. Organismos supressores de fito-patógenos com grande potencial de aplicação são as bactérias que naturalmente colonizam as raízes das plantas, rizobactérias. A relação rizobactéria/planta pode ser altamente benéfica para as plantas, pois, essas bactérias solubilizam fósforo, produzem auxinas que estimulam o crescimento das plantas, antibióticos e sideróforos com efeitos contra agentes fito-patogênicos como fungos, bactérias e nematóides. Estudos recentes sugerem que deve haver uma combinação ideal da bactéria adequada ao solo e à planta para uma efetiva colonização da rizosfera. Uma alternativa para aumentar a efetividade de colonização das linhagens de biocontrole, que não requer a extensa customização do processo de colonização, seria aumentar sua capacidade de produção dos agentes efetores da atividade pesticida. Este projeto se propõe a usar o poder do melhoramento genético clássico para atingir os seguintes objetivos: 1) Identificar mutantes de Bacillus amyloliquefasciens FZB42 com aumento de capacidade nematicida e/ou nematostática contra Meloidogyne, um nematóide causador de importantes perdas à lavoura da soja. 2) Identificar mutantes de FZB42 com capacidade de repelir Meloidogyne. 3) Comparar o desempenho das linhagens isoladas em (1) e (2) com linhagens disponíveis comercialmente em estudos em casa de vegetação. Postulamos que o uso combinado de linhagens com elevada capacidade de repelir e inativar Meloidogyne possa criar um efeito sinérgico de proteção contra esse patógeno e representar um produto para controle biológico com desempenho mais consistente e superior aos atualmente disponíveis no mercado.

A última década marcou uma mudança de paradigma na maneira como entendemos e estudamos a organização subcelular de bactérias. A idéia de "sacos de enzimas" foi substituída pela percepção de que processos essenciais, como replicação do DNA, divisão celular e expansão da parede celular, são realizados por complexos multiprotéicos, cuja localização subcelular e atividade são reguladas com grande precisão espaço-termporal. Apesar desses avanços, ainda não entendemos como a membrana plasmática das bactérias é construída. As enzimas e reações que produzem fosfolipídios são bem conhecidas, mas como a inserção de novos monômeros em uma membrana em expansão é organizada no espaço e no tempo, e como a síntese da membrana é coordenada com o crescimento celular são ainda questões fundamentais da biologia celular bacteriana. O principal objetivo deste projeto é fornecer uma descrição detalhada dos mecanismos moleculares da biogênese da membrana bacteriana, com foco em duas grandes questões: 1) Onde é sintetizada a nova membrana? - e 2) Como as bactérias sabem a quantidade de membrana que precisa ser sintetizada? Para responder a (1), aplicaremos métodos modernos de microscopia de fluorescência para determinar a localização subcelular e a dinâmica das enzimas de síntese de fosfolipídios e se elas funcionam sozinhas ou em um complexo multiprotéico. Para responder a (2), aplicaremos um conjunto complementar de métodos (genética molecular, bioquímica, proteômica e metabolômica) para investigar a interconexão entre a síntese de lipídios e membranas e o segundo mensageiro ppGpp, um regulador chave do crescimento bacteriano. Uma vez que o controle adequado do metabolismo lipídico é essencial para a sobrevivência, um objetivo adicional deste projeto será identificar inibidores de alvos selecionados da biogênese de membranas. Aproveitaremos o conhecimento básico reunido ao longo do projeto para montar ensaios do tipo "target-based whole-cell" e rastrear diferentes coleções de compostos (pequenas moléculas, fragmentos, produtos naturais). Como os alvos escolhidos são inéditos, os inibidores identificados podem representar "leads" para classes completamente novas de antibióticos.

Um aspecto crucial porém pouco reconhecido do crescimento e sobrevivência celular é a necessidade de que a biosíntese de suas macromoléculas constituintes seja precisamente coordenada. No caso de bactérias, isso significa produzir quantidades adequadas de quatro classes de macromoléculas: ácidos nucléicos, proteínas, lipídeos e os polissacarídeos que constituem a parede celular. A base molecular dessa coordenação é conhecida em alguns casos. Em outros, ela ainda é um mistério. Neste projeto propomos investigar como bactérias Gram positivas coordenam a síntese de lipídeos e membranas com suas outras atividades biossintéticas, e em resposta às condições ambientais e aos diferentes eventos do ciclo celular. Planejamos focar em dois aspectos: 1) o papel da enzima PlsX no acoplamento da síntese de ácidos graxos e fosfolipídeos, e 2) o papel do nucleotídeo sinalizador ppGpp na coordenação entre síntese de lipídeos e crescimento celular. Para atingir estes objetivos, aplicaremos técnicas modernas de microscopia de fluorescência, genética microbiana e bioquímica para determinar como PlsX se associa com a membrana celular e como esta associação afeta sua atividade enzimática e sua regulação. Uma gama de abordagens igualmente ampla será utilizada para estudar como que a carência de lipídeos ativa RelA, a sintetase produtora de ppGpp, e como este nucleotídeo contribui para a manutenção da viabilidade celular quando a síntese de lipídeos está bloqueada. Finalmente, desenvolveremos ensaios para a triagem de pequenas moléculas capazes de inibir PlsX e RelA. Como o correto controle da síntese de lipídeos é essencial para viabilidade, as descobertas deste projeto poderão levar a identificação de novos candidatos a antibióticos.

A crucial but often overlooked aspect of cell biogenesis and survival is the need for precise coordination between the biosynthesis of its macromolecular constituents. In the case of bacterial cells, this means producing appropriate amounts of four classes of macromolecules : nucleic acids, proteins, lipids and the polysaccharides of the cell wall. The molecular basis of coordination is well known in some cases. In others it is still rather misterious. In this project we propose to investigate how Gram-positive bacteria coordinate lipid and membrane synthesis with its other biosynthetic activities and in response to environmental conditions and the different events of the cell cycle. We plan to focus on two principal aspects: 1) the role of the enzyme PlsX in the coupling of fatty acid and phospholipids synthesis, and 2) the role of the signaling nucleotide ppGpp in the two-way coordination between lipid synthesis and cell growth. 
	The complementary expertise of the groups of Drs. Gueiros-Filho and de Mendoza will allow a multidisciplinary and sustained attack of the fundamental issues that underline coordination of fatty acid and phospholipid content with cell division and growth, via modern fluorescence microscopy, microbial genetics and chemical biology approaches. Because proper control of lipid metabolism is essential for survival, the discoveries from this project should also reveal potential novel targets for antibiotics.

O processo de divisão bacteriana é centralmente dependente de FtsZ, um homólogo procariótico das tubulinas. FtsZ desencadeia a divisão ao formar o "anel Z", uma estrutura supramolecular constituída por polímeros de FtsZ que circunda o interior da célula e funciona como arcabouço do aparato de divisão. A formação do anel Z é regulada por moduladores, proteínas que afetam tanto negativamente como positivamente a capacidade de FtsZ polimerizar-se. Neste projeto propomos uma abordagem multidisciplinar para desvendar os detalhes moleculares da interação entre FtsZ e três de seus moduladores: ZapA, MinC e MciZ. Triagens genéticas identificaram mutações em FtsZ que a tornam refratária a ação de cada um dos três moduladores citados. Estas mutações representam substituições de aminoácidos que provavelmente afetaram o sítio de interação em FtsZ para estes moduladores. Para corroborar e complementar estes dados, propomos o estabelecimento de uma "plataforma" de RMN capaz de medir a interação entre FtsZ e seus moduladores e mapear, a nível atômico, os contatos entre estas proteínas. O estabelecimento desta plataforma requererá inicialmente o assinalamento dos resíduos de FtsZ, e culminará com a realização de experimentos de perturbação do deslocamento químico no espectro de 15N-HSQC em misturas contendo FtsZ e seus moduladores. Um segundo objetivo deste projeto é a resolução da estrutura de MciZ, um peptídeo de 40 aminoácidos com potente atividade inibidora de FtsZ. Além de representar informação fundamental inédita, a compreensão dos detalhes estruturais e funcionais da interação de FtsZ com inibidores como MciZ e MinC pode servir como ponto de partida para o desenho racional de inibidores da divisão bacteriana.

O processo de divisão bacteriana é executado por pelo menos 15 polipeptídeos que se organizam na forma de um complexo macromolecular conhecido como divisomo. O divisomo é uma máquina proteica capaz de promover o invaginamento coordenado da membrana plasmática e da parede de peptideoglicano e assim levar à construção do septo de divisão. Nosso laboratório tem estudado o funcionamento do divisomo, usando Bacillus subtilis como sistema modelo. Um dos aspectos menos compreendidos sobre o divisomo diz respeito ao mecanismo de sua montagem e como esta é regulada. Neste âmbito, propomos responder a duas perguntas neste projeto: 1) Como é a seqüência de eventos que leva à montagem do divisomo? 2) Existe regulação da expressão de proteínas divisomais ao longo do ciclo celular? Para responder a estas perguntas adotaremos abordagens de microscopia de fluorescência vital ("live cell microscopy"). Para estudar a seqüência temporal de montagem do divisomo, utilizaremos medidas sistemáticas da freqüência de co-localização entre FtsZ, a primeira proteína a localizar-se no sítio de divisão, e as demais proteínas divisomais. Para determinarmos se há regulação da expressão utilizaremos GFP como repórter e métodos de análise automatizada de imagens para quantificar a expressão de proteínas divisomais ao longo do ciclo celular em células individuais. Um outro aspecto importante da pesquisa em divisão bacteriana diz respeito à composição do divisomo. A cada ano novas proteínas divisomais são descritas indicando que nosso conhecimento sobre a composição do complexo ainda é incompleto. Nosso laboratório tem utilizado previsões de genômica comparativa de maneira bem sucedida para identificar novas proteínas de divisão. Propomos dar continuidade a estes estudos, testando novos candidatos previstos por genômica comparativa e caracterizando YrzD, uma nova proteína divisomal de B. subtilis.

A etapa-chave da formação do septo de divisão em bactérias é a polimerização da proteína FtsZ, a tubulina procariótica, em uma estrutura chamada anel Z. É o anel Z que define onde e quando o novo septo será formado e sua formação é decorrência tanto da tendência intrínseca da FtsZ de polimerizar-se como da ação de proteínas moduladoras capazes de estimular ou inibir a polimerização da FtsZ. Recentemente, foi usada uma estratégia genética para identificar um novo modulador da formação do anel Z, que batizamos de ZapA. ZapA é uma proteína de 85 aminoácidos que se localiza no complexo de divisão e exerce um efeito positivo na formação do anel Z. Estudos bioquímicos iniciais demonstraram que ZapA é capaz de interagir com FtsZ diretamente e promover a sua autoassociação em polímeros complexos. A identificação e a caracterização inicial de ZapA propiciam o entendimento do processo de formação do anel Z. Ao mesmo tempo, geram questões importantes a respeito do mecanismo de ação desses fatores e sobre a possibilidade de que existam outros moduladores da FtsZ que ainda não foram descobertos. Só a partir do entendimento detalhado de como é controlada a formação do anel Z se poderá desvendar os mecanismos de regulação espaço-temporal da divisão celular bacteriana. Nesse sentido, será importante expandir o conhecimento das proteínas que são capazes de modular a formação do anel Z, assim como investigar os mecanismos pelos quais elas exercem seus efeitos. Assim, o projeto proposto apresenta os seguintes objetivos: 1) aprofundamento do estudo molecular da função de ZapA; 1.1) estudo da relação estrutura-função em ZapA; 1.2) estudo da regulação da expressão e atividade de ZapA ao longo do ciclo celular; 2) identificação sistemática de novas proteínas moduladoras da polimerização da FtsZ em B. subtilis, por meio de abordagens exaustivas e complementares; 3) estudo molecular das novas proteínas moduladoras da polimerização de FtsZ que venham a ser descobertas em decorrência do objetivo (2). A investigação da relação estrutura-função de ZapA será executada por meio da criação de mutantes sítio-dirigidos e posterior análise de sua funcionalidade em dois tipos de ensaios. Um dos ensaios usará fusões a GFP e microscopia de fluorescência para determinar a capacidade de localização das proteínas mutantes. O segundo ensaio determinará se os diferentes mutantes ainda são capazes de promover a formação do anel Z e suprimir o fenótipo causado pela superexpressão de um inibidor de divisão. Para determinar se expressão e atividade de ZapA são reguladas durante o ciclo celular, será usada uma abordagem citológica, novamente baseada em fusões entre ZapA e GFP. A expressão de ZapA ao longo do ciclo celular deverá corresponder à fluorescência produzida pela porção GFP da fusão GFP-ZapA e será monitorada por microscopia quantitativa. Evidências de um controle no nível da atividade da proteína serão buscadas em experimentos de colocalização de ZapA e FtsZ ao longo do ciclo celular. Para esses experimentos, ZapA e FtsZ serão fundidas a variantes espectrais de GFP e o padrão de localização das duas proteínas será determinado simultaneamente em uma mesma célula. A existência de um período do ciclo celular no qual as proteínas não se colocalizam indicará que a interação entre elas não é sempre permitida e que moduladores positivos podem ter sua atividade regulada. Para a identificação de novas proteínas moduladoras da FtsZ, propõe-se a adoção de quatro abordagens, baseadas em estratégias genéticas, bioquímicas e de duplo-híbrido independentes. As estratégias genéticas incluem uma triagem para genes supressores do bloqueio de divisão causado por um alelo FtsZ sensível à temperatura e uma triagem para mutações letais sintéticas quando em combinação com mutação em ZapA.