Andrei Leitão.

O processo de descoberta de fármaco consome tempo e usualmente leva a falhas. Isto é notadamente verdadeiro para o estudo de substâncias bioativas para diversos tipos de câncer, nos quais novas alternativas terapêuticas são extremamente necessárias. Inibidores de catepsinas são descritos na literatura como potenciais compostos antineoplásicos, inibindo a migração e invasão de células cancerígenas. Neste trabalho, uma estratégia integrada é estruturada a partir da combinação de estudos in silico, síntese e ensaios in vitro usando dipeptidil nitrilas e derivados peptoides contra um conjunto de linhagens de células cancerígenas. O trabalho computacional mapeará um conjunto de catepsinas (L, B e S) e seus inibidores usando campos de interação molecular, analisados por métodos quimiométricos para definir as propriedades físico-químicas vinculadas à potência e seletividade. Estes estudos in silico guiarão a síntese de um conjunto de quarenta compostos, seguido da caracterização das substâncias e dos bioensaios. Todos os testes serão baseados em células cancerígenas de pâncreas (MIA PaCa-2 e BxPC-3), fígado (HepG2), próstata (DU145 e PC-3) e mama (MDA-MB-231), incluindo linhagens não tumorais para quantificar a seletividade. A atividade citostática em culturas celulares bi e tridimensionais é esperada para estes compostos de acordo com nossos estudos iniciais. Assim, um conjunto de ensaios fenotípicos envolvendo a parada do ciclo celular, inibição da migração e da formação de colônia deve ser realizado, juntamente com aplicação de terapia combinada usando fármacos antineoplásicos conhecidos. O estudo mecanístico abarca as análises do metabolismo do substrato seletivo para cisteíno proteases Z-FR-MCA e da determinação do perfil das distintas cisteíno proteases usando Western blot. Métodos bioanalíticos aplicando as técnicas de HPLC-MS proverão os parâmetros farmacocinéticos relacionados à permeabilidade e estabilidade do composto juntamente com a resposta farmacológica. Estes resultados em conjunto levarão a uma exploração inicial da complexa interface química-biologia envolvida em um projeto de descoberta de fármaco.

Projeto financiado pelo INCT-FAPESP.

1. Caracterizar as propriedades responsáveis pela definição da reversibilidade em CPB Leishmania spp usando warheads 2. Caracterizar as propriedades de reconhecimento não covalentes do sítio ativo da CPB de Leishmania. spp 3. Combinar informações de 1 e 2 como base para propor novos inibidores de Leishmania spp 4. Usar inibidores da cruzaína existentes in-house e modula-los para CPB de Leishmania spp.

Todos os compostos sintetizados no NEQUIMED, financiados pela FAPESP através dos Processos 2011/01893-3, 2011/20572-3 e 2008/04127-7, foram ativos contra a cruzaína em concentrações de baixo-micromolar até sub-micromolar, sendo o composto mais potente o Nequimed409 (Neq409) que inibiu a enzima com um IC50 igual 1,89 0,11 M (pIC50 = 5,7). Além disso, também pela primeira vez, esses compostos apresentaram atividade tripanossomicida contra a forma infetiva tripomastigota/amastigota da cepa Tulahuen lacZ em concentrações menores que 50 M, sendo que o composto protótipo Neq409 é um agente tripanossomicida (dependência concentração-resposta) com valor de IC50 igual a 2,7 0,3 M (pIC50 = 5,6) contra a forma amastigota da mesma cepa. O Neq409 é mais potente que o fármaco benzonidazol (BZ) que foi usado como controle (pIC50 = 4,6) e apresenta citotoxicidade em baço de camundongos > 500 M (valor comparável ao do BZ que é > 500 M). As dipeptidil-nitrilas estudadas apresentam características de compostos matrizes que podem ser otimizadas para candidatos a fármacos: T. cruzi pIC50 > 5 (pIC50(Neq409) = 5,6) com SI > 10 (razão SI = IC50(cito)/IC50(T. cruzi) = 185, BZ = 20,6); PFI < 8 (PFINeq409 = 3,7); # anéis Ar < 5 e MW < 500 Da. Proposta deste projeto: otimizar os compostos matrizes para candidatos a fármacos tripanossomicidas.

O câncer de próstata é uma das patologias que causa maior preocupação na população&#10;masculina em todo o mundo, sobretudo após os 40 anos. As alternativas terapêuticas atuais&#10;são baseadas na terapia de supressão do andrógeno, mas poucos tratamentos estão&#10;disponíveis para o câncer resistente. Este cenário leva a muitas possibilidades para a&#10;descoberta de novas moléculas bioativas inibidoras de catepsinas, que apresentam atividade&#10;antineoplásica descrita para vários tipos de tumores. Neste trabalho colaborativo, novas&#10;substâncias antineoplásicas serão ensaiadas in vitro usando modelos celulares para o câncer&#10;de próstata resistente. As substâncias foram planejadas a partir de técnicas de bio e&#10;quimioinformática. A aplicação da inovadora técnica de cultura tridimensional de células em&#10;conjunto com a bidimensional constitui outro passo importante para a caracterização mais&#10;aprofundada da bioatividade das moléculas em um modelo que mimetiza melhor o&#10;microambiente do câncer. O perfil biológico de algumas substâncias e o contexto da&#10;arquitetura de rede onde os alvos biológicos estão localizados serão analisados para ampliar o&#10;espectro de atividade para outros tipos de câncer, como o de mama, de fígado e&#10;adenocarcinoma de pâncreas. A integração de técnicas, conhecimento e esforços levarão à&#10;descoberta de novas alternativas terapêuticas para os diversos tipos de câncer.

O câncer de próstata apresenta elevada incidência dentre as neoplasias em homens&#10;de meia-idade, de acordo com dados do DATASUS-INCA. Esta patologia é hormôniodependente,&#10;sendo que o receptor andrógeno (AR) é o alvo dos fármacos antitumorais&#10;bicalutamida, flutamida e nilutamida. No entanto, a terapia de supressão dos efeitos&#10;androgênicos pode se tornar ineficaz em uma fase tardia e faz-se necessário usar compostos&#10;que atuam em outras vias de sinalização que são AR-independentes. Neste caso, algumas&#10;moléculas relacionadas a processos apoptóticos têm sido estudadas e encontram-se atualmente&#10;em estudo clínico. O enfoque deste trabalho está voltado à identificação de novas entidades&#10;químicas (NCEs) que inibam a sinalização AR-dependente, ou que atuem de forma ARindependente&#10;levando à morte celular (por meio da modulação da sinalização celular de&#10;mTOR e survivina) constituindo-se uma nova estratégia para o tratamento do câncer de&#10;próstata. O trabalho é estruturado a partir da gênese planejada de fármacos, por meio de&#10;estudos computacionais baseados nos compostos bioativos conhecidos (LBVS) e nas&#10;estruturas de macromoléculas (SBVS) dentre elas o AR, mTOR e survivina, em conjunto com&#10;cálculos de propriedades farmacocinéticas. Entre 30 e 40 moléculas pré-otimizadas in silico&#10;serão selecionadas para ensaios in vitro baseados em células. As moléculas serão testadas por&#10;citometria de fluxo para observar a mudança fenotípica em duas linhagens de células que&#10;mimetizam o câncer de próstata (LNCaP e DU 145) para a granulação celular, em um estudo&#10;do tipo HCS, além da análise da inibição do ciclo celular. As ?impressões digitais? fenotípicas&#10;observadas em uma série de referência previamente selecionada (composta por fármacos e&#10;moléculas bioativas de interesse) serão analisadas comparativamente com as novas moléculas,&#10;para obter relações estrutura-atividade (SAR) que serão usadas no processo de otimização&#10;molecular e análise dos modelos e hipóteses estabelecidas