Claudia Ferreira da Rosa Sobreira.

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A baixa performance muscular observada em crianças e adolescentes com doenças crônicas entremeia o descondicionamento cardiopulmonar e a fadiga muscular periférica. O panorama científico guarda lacunas que impedem os terapeutas de estabelecerem condutas assertivas e com maior impacto na qualidade de vida destes cidadãos e de seus cuidadores. O conhecimento detalhado de variáveis relacionadas aos processos supracitados oferece perspectivas inovadoras de investigação e de tratamento clínico para algumas morbidades crônicas e/ou progressivas

escrição: Mitocôndrias desempenham papeis fundamentais tanto no metabolismo energético quanto em sinalização em células eucarióticas. Essas organelas são responsáveis pela produção de ATP, e desempenham funções centrais na sinalização redox, homeostase de cálcio e sinalização apoptótica. Um aspecto particular da biologia mitocondrial é que essas organelas contêm um genoma próprio, independente do genoma nuclear. Em humanos, o genoma mitocondrial (mtDNA) contem 16.569 pares de bases e codifica 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs. A estabilidade do mtDNA é essencial para a integridade funcional da organela e da célula, e mutações nesse genoma estão associadas com várias doenças. No entanto, o genoma mitocondrial está exposto a vários agentes genotóxicos, incluindo espécies reativas de oxigênio geradas normalmente como subprodutos do transporte de elétrons durante a fosforilação oxidativa. De fato, o mtDNA acumula lesões de DNA em níveis maiores do que o genoma nuclear. Desta forma, o entendimento dos mecanismos envolvidos na manutenção da estabilidade genética e funcional do mtDNA é fundamental para a melhor compreensão de processos fisiológicos e/ou patológicos. Esse projeto é subdivido em 5 subprojetos que abordam desde aspectos moleculares dos mecanismos de manutenção da integridade do mtDNA até a relevância funcional desses em patologias humanas. Esses são: 1) estudo dos mecanismos moleculares de reparo de DNA em mitocôndrias de mamíferos; 2) estudo do papel de proteínas de replicação na estabilidade do mtDNA; 3) estudo do papel de Rad51 mitocondrial na linhagem germinativa feminina e na fertilidade; 4) estudo da heterogeneidade do mtDNA em carcinoma renal; e 5) investigação de defeitos na manutenção do mtDNA em pacientes com intolerância ao exercício. Os resultados obtidos aqui devem avançar significativamente o entendimento molecular dos mecanismos de manutenção da estabilidade genômica em mitocôndrias, bem como da participação de alterações nessas vias em processos patológicos, e assim podem contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas ou preventivas.

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As doenças mitocondriais se manifestam de forma heterogênea, sendo observadas desde síndromes clínicas caracterizadas por acometimento isolado de determinado tecido ou órgão até síndromes multissistêmicas. Ataxia é descrita em diferentes formas de apresentação das doenças mitocondriais, entretanto, em algumas situações necessita melhor caracterização. No presente projeto propomos análise quantitativa da ataxia em dois grupos de pacientes com doença mitocondrial: aqueles que se apresentam com oftalmoplegia externa progressiva e aqueles com intolerância ao exercício como sintoma predominante.

Partindo das observações morfológicas de ausência de atividade oxidativa por falta de mitocôndrias nos central cores, das evidentes relações entre distúrbios na homeostase do cálcio intracelular ligados a mutações no gene RYR1 e a ocorrência de alterações na COX, objetivamos estudar a função mitocondrial em pacientes com doença com central cores, para que, diante da observação de evidências de disfunção (morfológica, bioquímica ou molecular), possamos analisar a influência das alterações da função mitocondrial nesta doença e contribuir para a elucidação das bases patogênicas desta miopatia.

Avaliação clínica, bioquímica e molecular de pacientes com miopatia mitocondrial com deleções múltiplas do DNA mitocondrial.
Propomos o estudo das doenças mitocondriais que surgem pelo desenvolvimento de deleções múltiplas no DNA mitocondrial (mtDNA) através da avaliação de suas causas e conseqüências no âmbito morfológico, bioquímico e molecular, em biópsias musculares e em mioblastos em cultura, visando melhor conhecimento da fisiologia mitocondrial e da fisiopatologia dessas doenças, e o delineamento de propostas terapêuticas eficazes. Inicialmente analisaremos o quadro clínico-laboratorial dos pacientes com deleções múltiplas do mtDNA seguidos no HC-FMRP-USP e classificaremos os pacientes de acordo com o fenótipo apresentado. A seguir, estudaremos as causas através do avaliação da atividade da enzima timidina fosforilase e do estudo molecular dos genes POLG1, ANT1, Twinkle e da timidina fosforilase, situados no DNA nuclear, determinando os fenótipos associados a cada tipo de mutação. As consequências morfológicas serão analisadas através de estudos histoenzimológicos e morfométrico, determinando o padrão de atrofia dos vários tipos de fibras musculares, comparando o padrão observado nesses pacientes com o de pacientes que apresentam outras formas de miopatia mitocondrial; estudando a relação dos achados morfométricos com o fenótipo e o grau de incapacidade física dos pacientes; comparando a ocorrência e magnitude da mialgia em relação a pacientes que apresentam exclusivamente atrofia das fibras do tipo 1 (miopatia com desproporção dos tipos de fibra). As conseqüências bioquímicas serão avaliadas através do estudo da atividade das enzimas da cadeia respiratória, determinando a relação entre as alterações e as características clínicas. Avaliaremos, a seguir, as deleções múltiplas do mtDNA nas biópsias musculares e em clones isolados de mioblastos, para determinar se o padrão das deleções varia em diferentes células e qual a interferência de fatores ambientais n

Avaliação do envolvimento da musculatura da mão na distrofia muscular de Duchenne.

Propomos o estudo das doenças mitocondriais que surgem pelo desenvolvimento de deleções múltiplas no DNA mitocondrial (mtDNA) através da avaliação de suas causas e conseqüências no âmbito morfológico, bioquímico e molecular, em biópsias musculares e em mioblastos em cultura, visando melhor conhecimento da fisiologia mitocondrial e da fisiopatologia dessas doenças, e o delineamento de propostas terapêuticas eficazes. Inicialmente analisaremos o quadro clínico-laboratorial dos pacientes com deleções múltiplas do mtDNA seguidos no HC-FMRP-USP e classificaremos os pacientes de acordo com o fenótipo apresentado. A seguir, estudaremos as causas através do avaliação da atividade da enzima timidina fosforilase e do estudo molecular dos genes POLG1, ANT1, Twinkle e da timidina fosforilase, situados no DNA nuclear, determinando os fenótipos associados a cada tipo de mutação. As consequências morfológicas serão analisadas através de estudos histoenzimológicos e morfométrico, determinando o padrão de atrofia dos vários tipos de fibras musculares, comparando o padrão observado nesses pacientes com o de pacientes que apresentam outras formas de miopatia mitocondrial; estudando a relação dos achados morfométricos com o fenótipo e o grau de incapacidade física dos pacientes; comparando a ocorrência e magnitude da mialgia em relação a pacientes que apresentam exclusivamente atrofia das fibras do tipo 1 (miopatia com desproporção dos tipos de fibra). As conseqüências bioquímicas serão avaliadas através do estudo da atividade das enzimas da cadeia respiratória, determinando a relação entre as alterações e as características clínicas. Avaliaremos, a seguir, as deleções múltiplas do mtDNA nas biópsias musculares e em clones isolados de mioblastos, para determinar se o padrão das deleções varia em diferentes células e qual a interferência de fatores ambientais no aparecimento das mesmas. Por fim, analisaremos a influência da coenzima Q10 e da vitamina C, ambos antioxidantes potentes, n

A doença com multi-minicores é uma miopatia caracterizada morfologicamente pela presença de múltiplas e pequenas áreas de ausência de atividade oxidativa, destituídas de mitocôndrias, que se estendem por dois ou três sarcômeros. Tais alterações estão presentes em fibras musculares esqueléticas dos tipos I e II (multi-minicores), sendo visualizadas por reações histoquímicas para enzimas oxidativas como NADH2-TR (nicotinamida adenina dinucleotídeo forma reduzida - tetrazólio redutase)Em projeto anterior, aprovado pelo PIBIC 2003-2004, tivemos como objetivo avaliar se a ausência de mitocôndrias nos multi-minicores geraria uma disfunção mitocondrial. Análise das características clínicas, laboratoriais, morfológicas e bioquímicas (das enzimas da cadeia respiratória) de 12 pacientes com doença multi-minicore sugeriram a ocorrência de disfunção mitocondrial em 8 dos 12 pacientes. 
Observamos diminuição da atividade do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial no músculo esquelético de dois pacientes com multi-minicores. Um destes apresentou concomitantemente deficiência do complexo IV. Outros três pacientes apresentaram deficiência isolada do complexo IV. Diminuição da atividade dos complexos II+III foi observada em outro paciente. Dois pacientes com atividade normal dos complexos protéicos da cadeia respiratória apresentaram elevação de lactato sérico e alterações morfológicas e histoenzimológicas indicativas de disfunção mitocondrial.
Nossos resultados e a descrição por Santorelli et al. (1999)4 de um paciente com lesões do tipo multi-minicores e miocardiopatia associadas a uma mutação heteroplásmica A1555G no gene de RNA ribossômico 12S do DNA mitocondrial (mtDNA) fazem necessária avaliação mais detalhada da expressão das subunidades dos complexos protéicos da cadeia respiratória e da integridade do mtDNA, com o intuito de determinar se as disfunções observadas são decorrentes de envolvimento de subunidades codificadas pelo mtDNA ou DNA nuclear (nDNA). 
Como

Estudo da função mitocondrial em biópsias musculares de pacientes com doença com multi-minicores.

Medida da amplitude de movimento das principais articulações e avaliação da capacidade funcional em pacientes com miopatias diversas.

A avaliação das mitocôndrias morfologicamente anormais em cortes histológicos de tecido muscular, o estudo do comportamento dessas mitocôndrias em cultura de células musculares e a análise da expressão de proteínas mitocondriais nas organelas morfologicamente anormais são objetos de estudo do presente projeto de pesquisa. Além de contribuir para o aprofundamento dos conhecimentos a respeito das alterações patogênicas nas doenças mitocondriais, a elucidação do comportamento biológico das mitocôndrias morfologicamente anormais terá certamente relevância no desenvolvimento de opções terapêuticas eficazes.