Beny Spira.

Mutações são eventos raros e aleatórios que ocorrem no genoma de um organismo. Desde a clássica demonstração de Luria-Delbrück, ficou claro que, em bactérias, as mutações também ocorrem de forma aleatória, ou seja, não são dirigidas a loci específicos em resposta às condições do meio. Entretanto, há uma segunda categoria de mutações bacterianas que aparentam ser dirigidas, as chamadas mutações adaptativas. O mecanismo de origem dessas mutações sugere que elas ocorrem em resposta a estímulos ambientais específicos. A natureza das mutações adaptativas é controversa, e é, ainda hoje, tema de intenso debate. Mutações PHO-constitutivas têm diversas características comuns à mutações adaptativas: surgem somente após contato com o agente seletivo (glicerol-2-fosfato), acumulam longitudinalmente na placa de seleção e apresentam uma curva sigmoide de acúmulo de mutantes. Apesar disso, descobertas
recentes em nosso laboratório sugerem que a origem desses mutantes não é adaptativa.
Acreditamos que as características descritas acima podem ser explicadas por um fenômeno novo: a inibição do crescimento dos mutantes no meio seletivo. Neste projeto iremos investigar o fenômeno da inibição. Este será caracterizado de diversas formas e hipóteses serão testadas.

O genoma de Escherichia coli codifica para sete fatores sigma diferentes. O fator sigma principal,
σ70 , é responsável pela transcrição da maioria dos genes, principalmente daqueles associados ao
crescimento bacteriano. RpoS (σS ) é o segundo em importância, sendo responsável pela transcrição
de mais de uma centena de genes envolvidos na resposta ao estresse. Apesar de sua relevância,
o gene rpoS é apresenta acentuado polimorfismo e os níveis proteicos deste fator sigma são muito
variáveis. A frequência de mutações nulas em rpoS é muito maior do que a esperada para mutações
espontâneas. Isso ocorre porque há uma forte pressão seletiva sobre rpoS e sobre os genes que
regulam a sua expressão. Neste projeto, investigamos o nível de polimorfismo de rpoS na espécie
E. coli em uma análise longitudinal de 12 meses de duração. Amostras coletadas mensalmente são
analisadas em relação à presença de RpoS, seu nível intrínseco, polimorfismo genético, frequência
de mutantes espontâneos, aptidão e outras características.
Uma outra molecula associada à resposta ao estresse que analisamos é a guanosina tetrafosfato
(ppGpp). Além de regular a expressão de genes de estresse, ppGpp coordena também o crescimento
e a homeostase bacteriana, podendo ser considerado o regulador mestre de bactérias. Os níveis
de ppGpp, assim como ocorre com RpoS, também variam intrinsecamente em diferente isolados da
mesma espécie. Nós investigamos diversos elementos celulares influenciados por ppGpp, entre eles,
a produção de toxinas por linhagens patogênicas de E. coli, a relação de ppGpp com a resistência a
antibióticos e o seu envolvimento na resposta à presença do herbicida glifosato.

De acordo com a síntese moderna da evolução das espécies, eventos mutacionais ocorrem espon-
taneamente e são considerados aleatórios em relação ao resultado adaptativo que acarretam ao
organismo. Em outras palavras, mutações benéficas não podem ser selecionadas diretamente, mas
ocorrem por acaso e são filtradas pela seleção natural. No entanto, nos últimos 30 anos vários es-
tudos sugeriram a existência de uma categoria de mutação que escapa aos padrões estabelecidos
pela seleção natural clássica - a chamada "mutação adaptativa". Esse tipo de mutações está associ-
ado a fenótipos não-letais, como a capacidade de crescer com uma fonte de carbono alternativa. As
bactérias que não podem usar uma determinada fonte de carbono evoluem para acumular mutações
em genes que permitem o uso desse nutriente específico. A novidade é que essas mutações ocor-
rem somente após a exposição à fonte de carbono. O mecanismo pelo qual as mutações adaptativas
ocorrem ainda não está esclarecido, sendo debatido vigorosamente na comunidade científica.
Neste projeto, investigamos um tipo de mutação que aparenta ser de natureza adaptativa. Mu-
tantes PHO-constitutivos têm a capacidade de crescer utilizando uma fonte de carbono alterna-
tiva, o glicerol-2-fosfato (G2P). Estes mutantes são selecionados em um meio contendo G2P como
única fonte de carbono. Uma peculariedade dessas mutações é que a frequencia de mutantes PHO-
constitutivos observada em experimentos é pelo menos 100 vezes mais baixa do que a frequência
esperada para mutantes espontâneos em E. coli. Nosso objetivo é descobrir o motivo da baixa
frequencia de mutantes PHO-constitutivos, além de estudar outros aspectos dessas mutações, tais
como, o efeito das mutações sobre a aptidão (fitness) das bactérias, a sua estabilidade, as condi-
ções ambientais que favorecem ou prejudicam o seu surgimento e a sua prevalência em isolados
naturais.

Fósforo é um componente vital para a agricultura. As fontes atuais de fósforo são limitadas e se
esgotarão em algumas dezenas de ano. A reciclagem de fósforo para uso agrícola é, portanto, um
imperativo. Por outro lado, a presença de fósforo em águas residuárias é um problema ambiental
de dimensões crescentes. O objetivo deste projeto é a obtenção de bactérias da espécie Pseudo-
monas aeruginosa modificadas geneticamente para otimizar os processos de captação de fosfato
e solubilização de sais de fosfato insolúveis presentes no solo. Uma vez acumulado na bactéria, o
fosfato poderá ser utilizado como fertilizante agrícola, caracterizando um processo de reciclagem
de fósforo. Neste esquema estaremos resolvendo dois problemas simultaneamente: 1) extração de
fósforo de águas residuárias evitando assim a eutrofização de efluentes; e 2) obtenção de uma fonte
renovável de fósforo.
Foi construído no laboratório um mutante no gene phoU que possui uma capacidade aumentada
em acumular polifosfato. Os diversos efeitos da mutação phoU sobre o metabolismo bacteriano são
analisados. Por exemplo, a mutação phoU causa, além do aumento de polifosfato, maior sesibili-
dade a estresses ambientais, menor resistência a antibióticos, diminuição no ritmo de crescimento
(replicação). Adicionalmente, o mutante phoU serve de ponto de partida para a evolução em um
aparelho chamado quimiostato, onde bactérias podem crescer continuamente em condições mais
ou menos constantes durante longos períodos de tempo e acumular mutações novas que permitam
a sua adaptação à condições de escassez de nutrientes. O crescimento contínuo no quimiostato
é utilizado para acompanhar a evolução de bactérias em tempo-real. Além de aprender sobre o
processo biológico de evolução bacteriana, o crescimento contínuo é utilizado para o melhoramento
genético de bactérias acumuladoras de polifosfato.

Bactérias da espécie Escherichia coli possuem 7 fatores sigma conhecidos. O fator sigma principal, sigma-70, é responsável pela transcrição da maior parte dos genes da bactéria, enquanto que sigma-S, o segundo em importância, é responsável pela transcrição de genes envolvidos na resposta geral ao estresse e fase estacionária de crescimento. Nestas condições, a bactéria produz proteínas que conferem proteção contra eventuais estresses. Em condições de limitação (ou estresse) nutricional sigma-S acumula-se no citoplasma e acaba competindo com sigma-70 pela ligação ao cerne da RNA polimerase. Esta competição irá ao longo de vários dias de cultivo, resultar na seleção de mutações em rpoS. Por este motivo isolados naturais de E. coli tendem a apresentar uma alta porcentagem de mutações em rpoS. Por outro lado, há fortes indícios na literatura relacionando sigma-S e a virulência de diversas espécies bacterianas.
	Neste projeto estaremos avaliando um possível envolvimento de σS nos mecanismos de patogenicidade de dois grupos de E. coli diarreiogênicas- EPEC (enteropatogênica) e ETEC (enterotoxigênica). Além disto, diversos isolados clínicos de EPEC e ETEC serão avaliados em relação ao alelo de rpoS e suas características fenotípicas.

O gene rpoS, que codifica sigma-S , é altamente polimórfico sendo que mutações neste gene são comuns. A mutação pontual C→T na posição 97 do ORF de rpoS, resulta em um códon de parada TAG (âmbar) (rpoSam). Um Shine-Dalgarno alternativo e um códon de início de tradução na posição 157 dá início a uma proteína RpoS truncada. Mesmo apresentando um menor tamanho, a proteína truncada permanece parcialmente funcional.
A privação de fosfato inorgânico é uma situação de estresse na qual o regulon comandado por sigma-S é ativado. Porém, na limitação deste nutriente ocorre também a ativação do regulon PHO. Resultados anteriores em nosso laboratório mostraram a relação conflituosa entre sigma-S e a expressão de PHO, cujos genes são predominantemente transcritos por sigma-70. Neste trabalho será investigada a forma truncada de sigma-S e sua relação com a expressão do regulon PHO. Há indícios de que a forma truncada de RpoS não afeta negativamente a expressão dos genes de PHO, mas, pelo contrário, participa ativamente de sua transcrição. Uma vez que a forma truncada de RpoS é comumente encontrada em isolados naturais de E. coli, o estudo de rpoSam aumentaria nosso entendimento sobre a adaptação de bactérias ao meio. O alelo rpoSam será introduzido na cepa selvagem que será testada em relação à expressão dos genes de PHO, outro genes dependentes de sigma-70 (lacZ ), e genes dependentes de RpoS, tal como proU e osmY. Ensaios de imunoprecipitação de cromatina serão realizados para testar se RpoS truncada é capaz de reconhecer a sequência promotora destes genes. O fitness da cepa que carrega rpoSam será testado em ensaios de competição com a cepa selvagem ou com o mutante nulo de rpoS.

A concentração de fósforo no Rio negro é de no máximo 0.5 uM (15.6 ug/l). Bactérias, como C. violaceum que proliferam neste habitat devem ser muito competentes na captação de Pi do meio. Seria, portanto, extremamente interessante estudar os sistemas de captação de Pi em C. violaceum. As características do metabolismo de fósforo em C. violaceum estão sendo analisadas. A regulação dos sistemas de captação e assimilação de fosfato está sendo estudada através do isolamento de mutantes espontâneos e também pela introdução de mutações sítio-dirigidas em genes regulatórios.

A reciclagem de fósforo para uso agrícola é de extrema importância, dada a extração não sustentavel de fósforo que vem ocorrido até o presente.Por outro lado, a presença de fósforo em águas residuarias é um problema ambiental de dimensões crescentes. A proposta deste projeto é de reciclar o fósforo do efluente seundário e transferi-lo para uso agrícola, desenvolvendo para isto biofilmes bacterianos super-acumuladores de polifosfato.

As Glutationa-S-transferases (GSTs) formam uma família de enzimas relacionadas diretamente ao processo de detoxificação de compostos tóxicos e carcinogênicos. Estas proteínas protegem o organismo da ação destes compostos neutralizando-os. Por outro lado, as GSTs estão também relacionadas a resistência que tumores malignos adquirem ao tratamento quimioterápico, infligindo um sério problema a pacientes portadores de câncer. As florestas brasileiras apresentam uma gama variada de plantas de potencial medicinal. Extratos de plantas que tenham efeito inibitório sobre GST poderiam contribuir ao tratamento quimioterápico, ao passo que plantas que induzam a expressão de GST contribuiriam para uma dieta saudável. 
Utilizando hepatócitos e linfócitos leucêmicos como modelo, nós estudamos o padrão de expressão das GSTs em resposta a tratamentos com extratos de plantas medicinais. Este trabalho é realizado ao nível de expressão do gene, através da medição de seu RNA mensageiro especifico e também ao nível de expressão da proteína e sua atividade enzimática.