Marcelo Demarchi Goissis.

O objetivo geral deste projeto é produzir conteúdo de divulgação sobre segurança laboratorial e biossegurança para novos usuários e alunos de cursos de extensão

O primeiro evento de diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário mamífero resulta na formação do trofectoderma (TE) e na massa celular interna (MCI). Para que esse evento biológico ocorra, deve haver um controle espacial e temporal da expressão de fatores de transcrição específicos. Este controle pode envolver diferentes modos de regulação, incluindo ativação de vias metabólicas específicas, as quais não foram ainda estudadas nesse contexto na espécie bovina. Portanto, o presente projeto visa estudar o papel de vias metabólicas na diferenciação do TE em embriões bovinos. São propostos experimentos para testar hipóteses relacionadas a vias de metabolização da glicose e à via de sinalização mTOR. Espera-se com este projeto entender o papel de vias do metabolismo de glicose e da via mTOR na diferenciação celular do TE. O presente projeto pode auxiliar na criação de condições para a modulação da diferenciação celular de embriões bovinos produzidos in vitro

Os processos reprodutivos envolvem eventos complexos e finamente orquestrados que permitem a manutenção e a propagação das espécies. Atualmente, os avanços científicos e tecnológicos permitem que pesquisas sejam conduzidas de forma global, o que pode representar uma revolução na compreensão dos mecanismos envolvidos nesses processos. Além de elucidar os eventos chave destes processos, poderá haver o desenvolvimento de novas ferramentas revolucionárias para a reprodução assistida que levem, principalmente, ao desenvolvimento de indivíduos mais saudáveis. Neste sentido, propomos a criação da Rede de Pesquisa em Comunicação na Reprodução (RePCoR) cujo objetivo principal é conduzir, na forma de projetos integrados, o mapeamento dos processos de comunicação entre os diferentes atores envolvidos nas etapas iniciais da fertilização e do desenvolvimento embrionário inicial in vivo e in vitro. Acreditamos que o ambiente materno influencia de forma benéfica e essencial os gametas e embriões, e que as moléculas envolvidas nessa comunicação, quando introduzidas nos sistemas in vitro, podem gerar embriões mais semelhantes aos desenvolvidos in vivo e, portanto, mais competentes. Para abordarmos essa temática são propostos 6 subprojetos. No subprojeto 1 será desenvolvido um novo sistema in vitro para o estudo do ambiente ovidutário baseado na geração de esferóides mistos compostos por células epiteliais e fibroblasto de oviduto (EMEFO). Serão estabelecidas as melhores condições para estabelecimento e manutenção dos EMEFOs, permitindo a manutenção da morfofisiologia, sendo também submetidos a desafios hormonais mimetizando as diferentes fases do ciclo estral. No subprojeto 2 será estudada a comunicação entre os EMEFOs e o gameta feminino. Serão avaliados parâmetros morfofuncionais e moleculares do oócito na presença dos EMEFOs acreditando-se no aumento da sua competência para suportar o desenvolvimento embrionário após a fertilização. No subprojeto 3, a comunicação passa a ser estudada com outro protagonista: o espermatozoide. Neste subprojeto propõe-se identificar qual o tipo e características dos espermatozoides que chegam no oviduto, e buscar selecionar essa população para incremento dos processos. Além disso, verificar se há diferença de comunicação entre touros. No subprojeto 4, será estudado o evento da fertilização in vitro na presença e na ausência dos EMEFOs, esperando que a comunicação com o tecido materno acarrete maiores taxas de embriões. O subprojeto 5 avaliará se o ambiente com os EMEFOs induz modificações morfofisiológicas, moleculares e epigenéticas nos embriões os aproximando dos desenvolvidos in vivo. O mapeamento de moléculas importantes nesses 5 subprojetos permitirá o desenvolvimento do subprojeto 6, que prevê intervenções no sistema de produção in vitro objetivando aproximar os embriões in vitro do in vivo. O subprojeto 6 representa o componente de inovação da proposta. Em todos os subprojetos optou-se por mapear os processos de comunicação com ferramentas ômicas, cujos resultados serão analisados de forma integrativa. Além disso, para todas as caracterizações, os processos serão comparados ao sistema in vivo. Consideramos esses dois aspectos, bem como o mapeamento global dos eventos reprodutivos como os grandes diferenciais da proposta. Ao gerarmos esse conhecimento, tanto in vitro quanto in vivo, as principais moléculas, alterações morfológicas e/ou moleculares serão detectadas e estudadas, e subsidiarão a geração de um novo sistema de produção in vitro de embriões que leve em consideração não somente os números de indivíduos produzidos, como a qualidade desses animais gerados. Isto poderá, sem dúvida alguma, impactar a produção, a saúde e o bem-estar animal.

Os mecanismos epigenéticos que regem a capacidade do gameta feminino (o oócito) de se tornar totipotente estão no centro de muitas questões não respondidas na biologia. A melhor compreensão desses fenômenos básicos oferece uma oportunidade única para desenvolver novas biotecnologias com benefícios de amplo alcance para humanos e animais. Este projeto temático reúne renomados especialistas do Canadá e do Brasil que atuam em diversos campos científicos que vão do nível subcelular ao nível do organismo, e que, juntos, buscam responder à questão: Quais são os sinais epigenéticos fornecidos pelo ambiente folicular que permitem a produção de um oócito capaz de derivar todas as células de um organismo, incluindo sua perpetuação por meio da produção de gametas para a próxima geração? Por meio do uso modelos experimentais únicos, com abordagens retrospectivas, e ferramentas de bioinformática de última geração para analisar os componentes epigenéticos a nível molecular e celular esta proposta almeja (1) identificar os principais constituintes moleculares envolvidos nas interações oócito-folículo, (2) intervir na retomada meiótica in vitro para simular a foliculogênese in vivo e (3) examinar modelos alternativos para desvendar mecanismos essenciais da totipotência. Trata-se de uma proposta única, coesa e com integração de especialidades complementares, que oferece uma oportunidade singular para lançar mais luz sobre os mecanismos epigenéticos fundamentais que controlam a aquisição da totipotência pelo oócito. Como relevância prática, no longo prazo humanos e animais se beneficiarão diretamente com o aprimoramento e o advento de novas biotécnicas de reprodução assistida auxiliando a restauração da fertilidade de casais inférteis, acelerando a disseminação de genótipos superiores em espécies domésticas, e restaurando espécies selvagens em vias de extinção.

O INCT Reprodução Animal (INCT RA) resulta do trabalho colaborativo de pesquisadores de 29 instituições, em 14unidades federativas distribuídas em todas as regiões do Brasil. Os mais de 70 integrantes das instituiçõesbrasileiras e partícipes desta proposta possuem produção técnico-científica relevante, atuando em programas de pósgraduaçãoem ciência veterinária, zootecnia, biotecnologia e áreas afins, a grande maioria com conceitos 5, 6 e 7.Considerando o período desde 2017, os pesquisadores brasileiros partícipes deste INCT publicaram quase 2.000 artigoscientíficos em conceituados periódicos internacionais como Biology of Reproduction, Scientific Reports, Plos One,Reproduction, Journal of Animal Science, Journal of Dairy Science, Theriogenology, Molecular, Reproduction andDevelopment, BMC Genomics, Reproductive Toxicology, Analytical Chemistry, dentre outros. Tais artigos sãoreferenciados por cientistas de vários países e muitos dos integrantes deste INCT têm atuado como palestrantes emalguns dos mais representativos eventos em reprodução do mundo, como as reuniões da Society for the Study ofReproduction (SSR), International Embryo Transfer Society (IETS), International Congress on Animal Reproduction(ICAR) e International Ruminant Reproduction Symposium (IRRS). Integrantes deste INCT contribuíram, desde 2017, paraa formação de quase 200 doutores e 370 mestres, registraram mais de 30 patentes, desenvolveram trabalhos detransferência de tecnologia e treinamento de profissionais em todos os estados brasileiros. Desta forma, osproponentes do INCT-RA formaram toda uma geração de profissionais que atuam em instituições do Brasil e exterior.Atualmente, as principais empresas ligadas à reprodução animal do Brasil, incluindo os grandes laboratórios deprodução in vitro de embriões, têm em seus quadros profissionais formados nas instituições parceiras deste INCT.Comapoio das respectivas instituições, os cientistas brasileiros dedicados ao INCT RA captaram mais de R$ 60 milhõesnas últimas 2 décadas, recursos investidos em geração de conhecimento, tecnologia e formação de mão-de-obraqualificada. Pesquisadores do INCT-RA têm projetos aprovados em praticamente todos os editais e modalidades defomento à pesquisa lançados no Brasil recentemente. Trata-se, portanto, de cientistas de comprovada excelênciaacadêmico-científica, integrados a instituições com décadas de serviços prestados à educação, geração deconhecimento e transferência de tecnologia. Estas instituições representam a diversidade regional e socioeconômicado Brasil e tem, portanto, a capacidade de impulsionar o país através do conhecimento, educação e tecnologia. Oprojeto INCT RA conta com a colaboração de pesquisadores dos EUA, Itália, Espanha e Canadá, ícones em suasrespectivas áreas de atuação e membros de instituições com histórico de consolidadas parcerias com empresas eUniversidades brasileiras. A Universidade da Florida, por exemplo, tem extensa contribuição com pesquisas no Brasil,recebe constantemente alunos e pesquisadores para treinamento e muitos dos seus quadros conhecem a fundo o Brasil esuas instituições. A Praire View AM University, por sua vez, integra o sistema da Texas AM e possui excepcionalinfraestrutura para pesquisas com caprinos, além de ser um marco para estímulo à diversidade sociocultural no meiocientífico. Semelhante cenário há com relação à Universidade McGill, o CNR italiano e o Scripps Research Institute,as quais possuem extensa experiência em cooperação internacional e contribuição com programas de graduação e pósgraduaçãobrasileiros. O Scripps Res. Institute, na sede de La Lolla, EUA, possui 3 prêmios Nobel, um dos quaisagraciado com a comenda na área de Fisiologia e Medicina, em 2021. Em conclusão, as instituições e partícipes desteINCT tem consolidado histórico de resultados científicos e tecnológicos, com impact

A separação entre massa interna celular (MCI) e trofectoderma
(TE) é o primeiro evento de diferenciação celular que ocorre no embrião
mamífero. Esse evento é determinado pela regulação temporal e espacial de
genes ligados ao desenvolvimento embrionário. Apesar de intensamente
estudo em camundongos, este processo não foi completamente elucidado e
dados em bovinos são poucos. As técnicas para estudo dos embriões
normalmente envolvem a destruição dos mesmos e não permitem
acompanhar em tempo real a dinâmica dos genes relacionados à
diferenciação em MCI e TE. Novas técnicas como CRISPR/Cas9 permitem
alteração direcionada da sequência de DNA genômico. A introdução
direcionada de proteínas fluorescentes repórteres permitiria a visualização
em tempo real da expressão de genes de interesse nos embriões.Espera-se com este projeto desenvolver uma ferramenta para
introdução direcionada de genes repórteres em embriões bovinos e ao
mesmo tempo, compreender aspectos moleculares da diferenciação celular
embrionária em tempo real. No âmbito geral, este projeto visa prover
informações de caráter básico para melhorias das técnicas que envolvam a
produção in vitro de embriões bovinos.

Os primeiros eventos de diferenciação celular em mamíferos ocorrem antes daimplantação embrionária. Estes consistem na separação entre a massa celular internae o trofectoderma, seguida pela separação entre epiblasto e endoderma primitivodentro da massa celular interna. Os mecanismos moleculares que controlam essadiferenciação podem envolver desde polarização celular à expressão temporal defatores de transcrição específicos. Dados recentes indicam que o desenvolvimentoembrionário inicial bovino seria um bom modelo para humanos. O presente projeto visaestudar diferentes mecanismos que possam estar relacionados a diferenciação dasprimeiras linhagens celulares no desenvolvimento do embrião. São propostosexperimentos para testar hipóteses relacionadas ao primeiro e segundo eventos dediferenciação celular embrionária. Pretende-se avaliar a influência da polarizaçãocelular e a atividade da via de sinalização Hippo na segregação de massa internacelular e trofectoderma; para depois tentar identificar fatores pontuais que controlemesse evento. Será também testada a participação dos fatores de transcrição NANOG eGATA6 na separação do epiblasto e endoderma primitivo.

The second lineage decision in the early developing mouse embryo is the segregation of the epiblast and the hypoblast. The epiblast remains pluripotent and will go on to form the embryo proper, while the hypoblast will give rise to the extraembryonic endoderm lineages, including the yolk sac. There is compelling evidence that FGF signalling is responsible for inducing hypoblast cell formation in the developing embryo. Utilizing live imaging techniques and novel reporter systems we will investigate the response of FGF signalling in the developing embryo. These techniques will be utilized at the single cell level to manipulate cell signalling and assess changes in cell fate decisions and behaviour during differentiation of the epiblast and hypoblast lineage in the mouse blastocyst.

Células-tronco espermatogoniais (SSCs) são as responsáveis por manter a espermatogênese contínua durante a vida de um indivíduo. Estas células podem ser isoladas e transplantadas de modo a colonizar testículos e reconstituir sua funcionalidade. Devido a essa propriedade, SSCs têm o potencial de aplicação biotecnológico na produção de animais transgênicos. Entretanto, marcadores utilizados na seleção celular não reconhecem exclusivamente as verdadeiras células-tronco do testículo e estudos de caracterização destas células em bovinos são mais escassos que em murinos. Neste projeto, pretende-se testar a hipótese que SOX2, NANOG ou OCT4 são marcadores de SSCs indiferenciadas em bovinos em três experimentos. Primeiro, a expressão desses genes será verificada no parênquima testicular, assim como a co-localização desta proteína com outras já utilizadas para marcação de SSCs. Na sequência, pretende-se identificar genes diferencialmente expressos em populações que expressam ou não um desses marcadores. Em um terceiro experimento, pretende-se transplantar células espermatogoniais isoladas por citometria de fluxo para avaliar a formação de colônias. Espera-se com este projeto identificar um marcador de SSC indiferenciadas bovinas, assim como identificar marcadores de membrana que estejam presentes nesta população de células. Desta maneira, espera-se obter uma população celular que seja mais eficiente na colonização testicular após transplante.

The first observable differentiation event during mammalian embryo development is the specification of trophectoderm (TE) and inner cell mass (ICM). The TE will contribute to the formation of the placenta, while the pluripotent cells of ICM will differentiate into the three germ layers and form the fetus. Trophectoderm and ICM cell specification has been intensively studied in mouse while has not been thoroughly studied in cattle. Comprehension of events leading to inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) specification would be of interest to help understand some of the problems observed in embryos produced in vitro. We hypothesized that Cdx2, a TE specific marker, is not required for formation of the TE in bovine embryos, but it is important for its integrity.

Establishment of pluripotent embryonic stem cells (ESCs) from bovine embryos has been so far, unsuccessful. The lack of reliable pluripotency markers is also an important drawback when attempting to derive these cells. In this study, we aimed to find genes upregulated in the inner cell mass (ICM) of bovine blastocysts and we then selected SOX2 for further characterization.

The production of healthy, live cloned animals by somatic cell nuclear transfer (SCNT), in all species cloned to date, has been hampered by low efficiencies. Significant epigenetic changes must take place in order to ensure proper chromatin remodeling in SCNT. We hypothesized that exogenous expression of OCT4 in the donor fibroblast prior to its fusion with an enucleated oocyte would facilitate SCNT reprogramming by the oocyte.

Células-tronco embrionárias são úteis em estudos sobre o desenvolvimento embrionário, diferenciação e manipulação genética. Além disso essas células podem ser utilizadas na terapia celular e organogênese in vitro. Na pesquisa sobre terapia celular a partir de células-tronco embrionárias oriundas de embriões humanos, considerações éticas, morais e religiosas têm sido feitas por pesquisadores e leigos. Portanto, o uso de um modelo animal como o suíno (Sus scrofa) é bastante válido por transpor tais barreiras, visto que o suíno possui parâmetros fisiológicos semelhantes aos humanos. Apesar do alto potencial biomédico das células-tronco embrionárias, existem dificuldades na manutenção da pluripotência in vitro dessas células, inclusive na espécie suína. Portanto, estudos que visam elucidar os mecanismos de manutenção da pluripotência de células-tronco embrionárias in vitro são necessários para viabilizar o cultivo dessas células

Pesquisas com células tronco embrionárias permitem o estudo de diversas áreas do campo da biologia do desenvolvimento e da biotecnologia. Um dos principais objetivos dessas pesquisas é a terapia celular em humanos, porém o uso dessas células oriundas de embriões humanos provoca discussões relacionadas a ética, moral e religião. O uso de um modelo animal como o suíno seria interessante para sobrepor essas barreiras. Contudo, encontram-se dificuldades na manutenção da pluripotência in vitro de células tronco embrionárias suínas. Estudos visando a identificação e resolução dessas dificuldades serão importantes para estabelecer um padrão de cultivo de células tronco embrionárias em suínos.

Projeto de iniciação científica sob orientação do Prof. Dr. José Antonio Visintin, no Laboratório de Fecundação in vitro, Clonagem e Transgenia Animal

INICIAÇÃO CIENTÍFICA - Sob orientação do Prof. Dr. José Antônio Visintin - Laboratório de Fecundação in vitro, Clonagem e Transgenia Animal

O sucesso da clonagem animal depende de vários fatores, dentre eles o ciclo da célula doadora de núcleo. O estágio do ciclo celular é importante na manutenção da ploidia correta do embrião reconstruído e na reprogramação genética para o desenvolvimento embrionário. Sugere-se o uso de células nas fases G0/G1, pois há manutenção da ploidia e estariam aptas à reprogramação. Para conseguir células doadoras em G0/G1, pode-se realizar carência de soro fetal bovino no meio de cultivo, a qual induziria a quiescência celular ou utilizar drogas capazes de inibir as proteínas responsáveis pelo ciclo celular como ciclohexamida (CHX). Objetiva-se com este projeto avaliar o ciclo celular de fibroblastos fetal suíno submetido a carência de soro fetal bovino e ao tratamento com CHX.

INICIAÇÃO CIENTÍFICA - Sob orientação do Prof. Dr. Mário Binelli - Laboratório de Fisiologia e Endocrinologia Molecular - Injeções de estradiol no meio do ciclo estral de fêmeas bovinas estimulam a liberação aguda de prostaglandina F2 (PGF2 ) induzindo o processo de luteólise e o cio. Buscando compreender o papel do 17- estradiol (E2) na luteólise em bovinos, realizou-se experimentos in vivo e analisou-se a liberação de PGF2 induzida por injeções de E2 no dia 17 do ciclo estral. Para padronizar os ciclos estrais dos animais nesses experimentos, foi aplicado o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) no dia 5 do ciclo visando obter vacas com ciclo de três ondas foliculares. Esse procedimento leva à formação de um CL acessório e conseqüentemente a um aumento da concentração plasmática de progesterona (P4). Objetiva-se com este projeto verificar a influência dessas altas concentrações de P4 na liberação de PGF2 induzida por E2.

Projeto de iniciação científica sob a orientação do Prof. Dr. Mário Binelli, realizado no Laboratório de Fisiologia e Endocrinologia Molecular

INICIAÇÃO CIENTÍFICA - Sob supervisão da Dra. Carmen Fernandez-Becerra e orientação do Prof. Dr. Hernando A. del Portillo - Laboratório de Genética Molecular de Malária

Projeto de Doutorado sob orientação do Prof. Dr. José Antonio Visintin, no Laboratório de Fecundação in vitro, Clonagem e Transgenia Animal