Angela Kaysel Cruz.

Resumo em Português Mais de 1 bilhão de pessoas correm risco de infecção pelo protozoário parasito Leishmania, transmitido por inseto vetor. Na América do Sul e C entral, espécies de Leishmania no subgênero Viannia, como L. braziliensis, causam leishmaniose cutânea e mucocutânea. Ao contrário de muitas outras Doenças Tropicais Negligenciadas que tiveram grande sucesso recente em medidas de redução, incluindo malária e Doença do Sono, a incidência de leishmaniose está aumentando globalmente. Um objetivo central à pesquisa do parasito Leishmania é entender como ele transita por seu complexo ciclo de vida, se adapta ao seu ambiente e desabilita nossas defesas imunológicas. Entender esses mecanismos em um nível molecular nos permitirá desenvolver novas terapias e vacinas. Até o momento, a maioria dos estudos genéticos de Leishmania se concentrou no papel dos genes codificadores de proteínas na progressão do ciclo de vida. Nossa pesquisa mostrou que vários RNAs não codificadores de proteínas (ncRNAs), conhecidos por desempenhar papéis centrais em processos metastáticos de câncer e outras condições fisiológicas e patológicas em humanos, também desempenham papéis cruciais na sobrevivência e infectividade de L. braziliensis. Nossa hipótese é que o genoma de Leishmania codifica muitos outros ncRNAs não caracterizados que atuam como reguladores-chave da virulência, metástase e potencial de doença do parasita. Para testar essa hipótese no objetivo 1, tentaremos nocautear 650 ncRNAs putativos já identificados em L. braziliensis, que são preferencialmente, ou altamente, expressos em amastigotas, o estágio proliferativo causador da doença que se multiplica intracelularmente no hospedeiro humano. Cada mutante nulo carregará um código de barras genético exclusivo, e os mutantes organizados em grupos (pools) passarão por fenotipagem do ciclo de vida em cultura in vitro, em macrófagos e em camundongos. Ao sequenciar os códigos de barras na população (bar-seq), determinaremos quais ncRNAs são necessários em cada estágio do ciclo de vida. Importante, faremos todos os experimentos in vivo com um modelo de infecção em camundongo recentemente desenvolvido, que dá lesões no dorso do camundongo que são semelhantes às lesões cutâneas humanas. No objetivo 2, selecionaremos ncRNAs em que parasitos nocaute exibem perda de aptidão (Loss of function - LOF) em comparação com parasitas selvagens em infecções de macrófagos ou camundongos. Usaremos 10 a 20 desses ncRNAs principais para investigação mecanística detalhada. Confirmaremos que a perda de aptidão deve-se especificamente à exclusão do ncRNA e não a efeitos colaterais, reintroduzindo a expressão do ncRNA usando parasitos em que o gene é reintroduzido (add-back) ou superexpresso. As linhagens serão testadas, e comparadas por métodos de sequenciamento de RNA e RT-qPCR. Identificaremos os parceiros proteicos desses ncRNAs, o que facilitará nossa compreensão das vias e redes de proteínas e RNAs envolvidos em aspectos-chave do desenvolvimento do parasita e da infecção de mamíferos. Para esta análise, empregaremos dois sistemas in vitro diferentes e desenvolveremos e compararemos ensaios de pulldown in vivo. No objetivo 3, marcaremos ncRNAs regulatórios (por fluorescência ou etiquetas com afinidade a streptavidina) associando proteínas para visualizar interações e tráfego intracelular in vivo e imunoprecipitar algumas das proteínas ligantes destes ncRNAs para confirmar essas interações. Entre os ncRNAs cujos nocautes resultam em infecção prejudicada, 5-10 serão analisados in vivo em camundongos usando imagens in vivo de L. braziliensis bioluminescentes e IVIS longitudinal (microscopia intravital). O objetivo geral é alavancar abordagens de última geração para acelerar a compreensão e descoberta de ncRNAs como alvos moleculares para novas terapias contra leishmaniose, conforme já demonstrado para outras doença

O protozoário Leishmania, agente etiológico de doenças de importância médica indiscutível, possui formas peculiares de organização e expressão do seu genoma. O objetivo desta proposta é investigar elementos-chave da variabilidade genética e da regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em linhas de investigação específicas estudaremos a variação do genoma em resposta ao estresse na replicação do DNA, a expressão e mecanismos de ação de RNAs não-codificadores e o papel de modificações pós-traducionais na interação do parasito com seus hospedeiros. Estes estudos usarão abordagens de ponta em biologia celular e molecular, tais como: edição genômica por CRISPR-Cas9; estratégias globais de análise e/ou prospecção como ChIP-seq e BioID; estudos de interação in-vivo RNA-RNA ou RNA-proteína; e ensaios de FISH de múltiplas cores. A proposta tem um forte componente de fortalecimento de intercâmbios, além de novas colaborações com laboratórios internacionais, reforçando a vocação dos laboratórios envolvidos para a colaboração internacional em rede. Assim, esta proposta espera representar avanços notáveis no campo da regulação de expressão por RNA e da compreensão da variabilidade genômica em tripanossomatídeos.

O "UK: Brazil Joint Center Partnership in Leishmaniasis (JCPiL)" financiará cinco projetos inter-relacionados e três workshops para promover a pesquisa na interface da ciência básica e clínica, para ampliar as colaborações existentes entre o Reino Unido e o Brasil e desenvolver novas parcerias e formas interdisciplinares de trabalho. Viagens de curta e longa duração contribuirão para o treinamento e a "cross-fertilization" entre os Pesquisadores, pós-doutorandos (PDRAs) e estudantes de doutorado nas principais tecnologias e conhecimentos de ponta disponíveis atualmente. Os estudos serão focados na compreensão da diversidade genética do parasito no contexto das variações da infectividade de Leishmania e expressão do fator de virulência, mecanismos de evasão imune, diversidade de resposta do hospedeiro, imunopatologia resultante e ativação sustentada que direciona à doença crônica. Vamos investigar novos alvos moleculares de vias vulneráveis que são essenciais para a viabilidade do parasito, otimizar técnicas e marcadores de diagnóstico que permitam prever e categorizar de forma mais definitiva os perfis de patologia dos pacientes para definir desenhos terapêuticos mais eficazes e sob medida. Nossa JCPiL criará novas colaborações para construir projetos futuros sustentáveis e financiáveis que impactem essa doença mortal.

Leishmania spp, agentes etiológicos da leishmaniose, ameaçam 350 milhões de pessoas em mais de 80 países. A descoberta e estabelecimento de novos tratamentos e vacinas são urgentes. Reino Unido e Brasil estão comprometidos com a Organização Mundial de Saúde para financiar a pesquisa em doenças negligenciadas. 
Enquanto um parasito unicelular, a Leishmania sofre diferenciação em formas distintas no processo de adaptação aos seus hospedeiros invertebrado e vertebrado. As grandes alterações morfológicas, metabólicas e de virulência ocorrem durante as transições que permitem a sobrevivência dos parasitos. 
O controle da expressão gênica em Leishmania se dá marcantemente no nível de controle de abundância/atividade de mRNAs. Ao longo do ciclo de vida, em resposta às variações de estímulos, proteínas ligantes de mRNAs contribuem com a definição do destino destes mRNAs e portanto com o conteúdo proteico nas diferentes situações do ciclo de vida. No conjunto de proteínas essenciais para a sobrevivência no hospedeiro mamífero, há proteínas relevantes para a virulência 
Nós caracterizamos parcialmente a proteína "Reguladora", PRMT7, e demonstramos que ela está envolvida no controle de virulência do parasito ao infectar camundongos. Poucas proteínas reguladoras foram identificadas em Leishmania e nosso achado, em associação com o trabalho aqui proposto, deve permitir examinar essa via regulatória e compreender sua relação com a virulência. 
Para estudar a via regulatória da PRMT7 compusemos um grupo de colaboradores com expertises complementares; da genética do parasito ao controle de expressão gênica. É possível propor que a compreensão dessa via regulatória venha a contribuir para a compreensão do sucesso da infecção. 
Pretendemos identificar novos alvos de PRMT7, caracterizar as interações de algumas dessas proteínas-alvo com ácidos nucleicos ou outras proteínas e seu envolvimento com a virulência do parasito ou sobrevivência. A importância e o inovador em nosso projeto reside em 4 principais aspectos. 
1. PRMT7 é a única Protein aRginine Methyl Transferase já caracterizada em Leishmania e demonstramos a correlação negativa entre o nível da proteína e a virulência (Ferreira et al., 2014).
2. A metilação, enquanto modificação pós-traducional, nunca foi caracterizada em Leishmania.
3. Proteínas ligantes de RNA e regulatórias são importante nos processos de diferenciação do parasito durante o ciclo de vida, infectividade e virulência e são pouco conhecidas em Leishmania 
4. As estruturas moleculares tridimensionais de RBPs e complexos mRNAs:proteínas são pouco conhecidas, em geral, e desconhecidas em Leishmania.

A Leishmania é um eucarioto ancestral e parasito de grande relevância médica que desperta interesse enquanto modelo biológico por exibir uma série notável de processos biológicos ímpares entre os eucariotos, particularmente no que se refere ao RNA. Nossos objetivos são decifrar mecanismos moleculares que suportam os diferentes modos de regulação pós-transcricional dos genes de Leishmania. Vamos estudar elementos conservados presentes nas 3?UTRs de mRNAs do parasito e investigar a presença, distribuição e possíveis papéis de RNAs não codificadores (ncRNAs) que controlam a expressão gênica ao longo do ciclo de vida de Leishmania e que podem ser críticos para a adaptação do parasito nos seus hospedeiros. Assim, a proposta de estudar o controle da expressão gênica em Leishmania tem como objetivos centrais: (1) o estudo dos mecanismos pelos quais elementos conservados de 3?UTRs regulam o ?turnover? de RNA e/ou a tradução nos dois estágios de desenvolvimento em Leishmania, e qual o papel destes cis-elementos no controle pós-transcricional e mais especificamente na manutenção de ?regulons transcricionais? do parasito; (2) o estudo sobre função(ões) dos RNAs não codificadores em Leishmania pelo uso dos dados de sequenciamento de RNA em larga escala (high-throughput RNA sequencing). Em seguida à análise global, um grupo pequeno de ncRNAs diferencialmente regulados serão investigados quanto ao potencial papel na regulação da expressão gênica e patogênese. (3) o estudo sobre a biogênese de ODD3, um potencial RNA não codificador, alvos e mecanismo de ação; (4) a investigação de alguns de fatores epigenéticos que controlam a expressão de genes em Leishmania, tais como processos e maquinaria enzimática envolvida na metilaçao de proteínas

FAPESP - Auxílio à Pesquisa - Projeto Temático - processo nº 2006/50323-7, "Estudo do controle da expressão gênica e plasticidade genética em Leishmania", no período de 01 de julho de 2006 a 30 de junho de 2010.

Caracterização dos mecanismos de expressão e compartimentalização das isoformas da fosfoglicerato quinase de Leishmania. Processo nº 474465/2006-3. Auxlílio Financeiro R$ 32.900,00. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq. Vigência: 01/11/2006 a 31/10/2008.

UNICEF/UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (TDR). Projeto "Applications of transfection technology for drug screening and immunological studies in tropical parasitic diseases". Aprovado pelo Committee on Pathogenesis and Applied Genomics (PAG) o valor de $99,800 para o primeiro ano. Genebra, Suíça, em 31 de janiro de 2005. Vigência: 06/2005 a 05/2007.

FAPESp - Auxílio à Pesquisa - programa equipamentos especiais multiusuários 2, processo nº 2004/08859-1. "Genômica funcional: núclo de análise de expressão gênica", no período de 01 de abril de 2005 a 31 de março de 2007. US$ 45,000.

Pró-Reitoria de Graduação da USP - PROMAT. Projeto "Desenvolvimento de material didático multimídia para o módulo Genética Molecular e Tecnologia do DNA recombinante da disciplina de Genética Humana e Molecular". No período de 1º de abril de 2003 a 20 de março de 2004.

FAPESP - Auxílio à Pesquisa - Projeto Temático - processo n 99/12403-3.

FAPESP - Projeto de infra-estrutura de pesquisa, fase 4, módulo 5, infra-estrutura geral, processo nº 98/09432-9.

FAPESP - Projeto de infra-estrutura de pesquisa, equiapemtnos especiais multiusuários, processo n 98/14225-2.

Organização Mundial de Sáude/TDR - Projeto. Proc. ID 970519. Início em dezembro de 1997 até novembro de 1998.

FAPESP - Auxílio à Pesquisa, processo n 97/2196-5.

FAPESP - Projeto de infra-estrutura de pesquisa, fase 2, módulo 1, equipamentos especiais multiusuários, processo nº 97/11274-0.

FAPESP - Projeto de infra-estrutura de pesquisa, fase 2, módulo 1, equipamentos especiais multiusuários, proceso nº 95/6199-3.

FAPESP - Projeto de infra-estrutura de pesquisa, fase 2, módulo 1, equipamentos especiais multiusuários, processo nº 95/6188-1.

Organização Mundial de Saúde/TDR - Projeto. Proc. ID 940518. Início em setembro de 1994, pelo período de 3 anos, com renovações anuais dependentes de relatórios parciais.

Pró-Reitoria de Pesquisa da USP - Projeto Especial 1, processo nº 94.1.38216.1.4, desde o ano de 1994.

FAPESP - Projeto Individual, processo nº 94/5917-7.

Organização Mundial de Saúde/TDR - Projeto. Processo ID 920185. Início em setembro de 1993, pelo período de 1 ano.

Projeto processo nº 92/3553-2.