Ruy Gastaldoni Jaeger.

Programas Especiais / PAIP - Programa de Apoio à Infraestrutura - EMU - Pequeno-Médio Porte - Chamada de Propostas (2023) (https://fapesp.br/15498/programa-de-equipamentos-multiusuarios-emu)

Interação entre o peptídeo C16, derivado da laminina-111, e a integrina beta1 em células de mama. Mecanismos envolvidos e consequências funcionais

A neoplasia maligna da mama feminina está entre as mais incidentes na população brasileira, correspondendo a 28,1% dos tumores. Nesse contexto, a literatura mostra claramente o importante papel que o microambiente tumoral assume durante a progressão e metástase do câncer. Tal microambiente é composto por diversos tipos de células, as quais estão inseridas na matriz extracelular (MEC). A laminina-111, uma glicoproteína presente na MEC, após clivagem por metaloproteinases, expõe sequências ou fragmentos peptídicos os quais apresentam atividade biológica. Dentre esses, o peptídeo C16 tem chamado a atenção dos pesquisadores devido ao seu grande potencial pró tumoral. Estudos realizados em nosso laboratório mostraram que esse peptídeo influencia importantes etapas da biologia tumoral, como migração, invasão, formação de invadopódios e secreção de proteases. Além disso, a atividade induzida por C16 se reduz em células tumorais com a expressão da integrina β1 depletada por RNAi. Diante disso, nos motivamos a estudar em maior detalhe a interação C16 e a integrina β1. Para tanto, esse projeto tem como objetivo principal buscar compreender os mecanismos envolvidos com a interação entre o peptídeo C16, derivado da laminina-111, e a integrina β1 em células tumorais de mama. Analisaremos também vias de sinalização ativadas por tal interação, bem como os efeitos funcionais inerentes.

Interação entre o peptídeo C16, derivado da laminina-111, e a integrina beta1 em células de mama. Mecanismos envolvidos e consequências funcionais

A neoplasia maligna da mama feminina está entre as mais incidentes na população brasileira, correspondendo a 28,1% dos tumores. Nesse contexto, a literatura mostra claramente o importante papel que o microambiente tumoral assume durante a progressão e metástase do câncer. Tal microambiente é composto por diversos tipos de células, as quais estão inseridas na matriz extracelular (MEC). A laminina-111, uma glicoproteína presente na MEC, após clivagem por metaloproteinases, expõe sequências ou fragmentos peptídicos os quais apresentam atividade biológica. Dentre esses, o peptídeo C16 tem chamado a atenção dos pesquisadores devido ao seu grande potencial pró tumoral. Estudos realizados em nosso laboratório mostraram que esse peptídeo influencia importantes etapas da biologia tumoral, como migração, invasão, formação de invadopódios e secreção de proteases. Além disso, a atividade induzida por C16 se reduz em células tumorais com a expressão da integrina β1 depletada por RNAi. Diante disso, nos motivamos a estudar em maior detalhe a interação C16 e a integrina β1. Para tanto, esse projeto tem como objetivo principal buscar compreender os mecanismos envolvidos com a interação entre o peptídeo C16, derivado da laminina-111, e a integrina β1 em células tumorais de mama. Analisaremos também vias de sinalização ativadas por tal interação, bem como os efeitos funcionais inerentes.

A neoplasia maligna da mama feminina está entre as mais incidentes na população brasileira, correspondendo a 28,1% dos tumores. Nesse contexto, a literatura mostra claramente o importante papel que o microambiente tumoral assume durante a progressão e metástase do câncer. Tal microambiente é composto por diversos tipos de células, as quais estão inseridas na matriz extracelular (MEC). A laminina-111, uma glicoproteína presente na MEC, após clivagem por metaloproteinases, expõe sequências ou fragmentos peptídicos os quais apresentam atividade biológica. Dentre esses, o peptídeo C16 tem chamado a atenção dos pesquisadores devido ao seu grande potencial pró tumoral. Estudos realizados em nosso laboratório mostraram que esse peptídeo influencia importantes etapas da biologia tumoral, como migração, invasão, formação de invadopódios e secreção de proteases. Além disso, a atividade induzida por C16 se reduz em células tumorais com a expressão da integrina β1 depletada por RNAi. Diante disso, nos motivamos a estudar em maior detalhe a interação C16 e a integrina β1. Para tanto, esse projeto tem como objetivo principal buscar compreender os mecanismos envolvidos com a interação entre o peptídeo C16, derivado da laminina-111, e a integrina β1 em células tumorais de mama. Analisaremos também vias de sinalização ativadas por tal interação, bem como os efeitos funcionais inerentes.

Pesquisador responsável do Auxílio à Pesquisa FAPESP 2015/03393-9 intitulado ?Estudo da clivagem da laminina em tumores de mama, gerando potenciais peptídeos bioativos.?, com vigência de 01/02/2016 a 31/01/2018. Recursos obtidos R$ 190.000,00.
RESUMO
O câncer de mama representa importante problema de saúde pública com evidente morbidade e mortalidade. O microambiente onde as células neoplásicas se encontram desempenha importante papel na tumorigênese e progressão tumoral. Entre os componentes do microambiente tumoral destaca-se a matriz extracelular (MEC), formada por colágenos, proteoglicanos e glicoproteínas. Nosso Laboratório estuda o efeito da laminina, importante glicoproteína da MEC, em biologia tumoral. Investigamos sistematicamente o efeito in vitro de peptídeos da laminina no câncer. Sabemos que os mesmos são responsáveis por importante etapas da biologia tumoral, como migração, invasão, formação de invadopódios e secreção de proteases. Elucidamos também receptores e vias de sinalização por onde esses peptídeos atuariam. No entanto, um ponto a ser esclarecido e que representa contribuição fundamental nessa área é a determinação de quais peptídeos da laminina estariam presentes nos sítios tumorais in vivo. Esse aspecto até o momento permanece especulativo. Esse projeto possui como objetivo detectar in vivo peptídeos derivados da clivagem proteolítica da laminina. Iniciaremos estudando por imuno histoquímica a distribuição das cadeias alfa, beta e gama da laminina em tumores de humanos. Em paralelo analisaremos o perfil bioquímico da laminina em amostras tumorais in vivo, comparadas com tecidos normais. Esse perfil poderá evidenciar bandas de clivagem da laminina, expondo fragmentos contendo peptídeos bioativos. Entre esses peptídeos poderiam estar as sequências que estudamos anteriormente (Freitas & Jaeger 2002; Capuano & Jaeger 2004; Freitas et al. 2004a; Freitas et al. 2007; Morais Freitas et al. 2007; Gama-de-Souza et al. 2008; Nascimento et al. 2010; Siqueira et al. 2010; Nascimento et al. 2011; Caires dos Santos 2014; De Siqueira 2014). Essas bandas decorrentes de clivagem proteolítica serão submetidas a sequenciamento por métodos proteômicos, visando definir se nessas bandas estariam os peptídeos de interesse. Adicionalmente, essa abordagem poderá permitir a descoberta de novas sequências, cujo potencial bioativo poderá ser posteriormente investigado. Além de estabelecer o perfil de clivagem da laminina em tumores in vivo, realizaremos ensaios in vitro endereçando esse mesmo ponto. Células normais e tumorais em cultivo serão crescidas sobre laminina. Eletroforese e proteômica será posteriormente realizada, visando identificar peptídeos bioativos provenientes de clivagem da laminina. Finalmente, células tumorais serão tratadas pelos peptídeos eventualmente identificados, endereçando o papel dos mesmos em adesão, invasão, formação de invadopódios e tumorigênese.

O câncer de mama representa importante problema de saúde pública. O microambiente onde as células neoplásicas se encontram desempenha importante papel na tumorigênese e progressão tumoral. Nosso Laboratório estuda o papel da laminina e de seus peptídeos bioativos na biologia tumoral. Verificamos que o peptídeo C16, derivado da laminina-111, regula a expressão gênica diferencial em tumores de mama (DE SOUZA SANTOS, 2011). O peptídeo C16, presente no braço curto da cadeia gama 1, estimula a expressão dos genes GPNMB e SPOCK1. Esses resultados foram obtidos na linhagem tumoral de mama MDA-MB-231. Nesse projeto, avaliaremos a ação do peptídeo C16 na expressão das moléculas codificadas pelos genes GPNMB e SPOCK1 que, além de regular adesão celular, migração e metástases, podem ser potenciais biomarcadores tumorais. Dessa forma, utilizaremos linhagens de câncer de mama com diferentes comportamentos, como MBA-MB-231 (basal-like, triplo negativo para receptores de estrógeno, progesterona e HER2) e MCF-7 (luminal B HER2 positiva). Para fins comparativos utilizaremos células normais de mama (MCF-10A). As três linhagens serão tratadas por C16, sendo a expressão de GPNMB e SPOCK1 analisada por immunoblot. Para correlacionarmos expressão protéica e função celular, investigaremos se o peptídeo C16 induziria invasividade das linhagens tumorais MDA-MB-231 e MCF-7. Adicionalmente, através de bloqueio de função por anticorpos, analisaremos se GPNMB e SPOCK1 estariam relacionadas à invasão porventura desencadeada pelo peptídeo. Finalizando, visando contextualizar in vivo nossos resultados in vitro, estudaremos o potencial papel de GPNMB e SPOCK1, como biomarcadores tumorais, por meio da imunodetecção dessas moléculas em tecido mamário normal e tumoral, valendo-se de lâminas de Tissue Microarrays, (TMAs). Buscaremos correlacionar o perfil de expressão dessas moléculas com dados clínicos dos pacientes, entre eles estadiamento e curva de sobrevida.

Pesquisador responsável pelo Auxílio de Infra Estrutura, Programa Infra-USP, da Pró Reitoria de Pesquisa da USP. Proposta submetida para o Grupo B do Edital (até 2 milhões de Reais). Recursos aprovados: R$ 1.899.373,04. Vigência: 2014 a 2016. Esses recursos visaram a aquisição de microscópio eletrônico de capacidade tomográfica, único na Universidade. Microscópio hoje instalado e em pleno funcionamento.

Coordenador do projeto que cria Centro de Instrumentação Multiusuários em Microscopia Eletrônica no ICB-USP. Recursos obtidos: R$ 1.899.373,04.
O Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências Biomédicas da USP possui larga tradição em Microscopia Eletrônica, representada por Setor de Microscopia Eletrônica criado na década de 90, quando da aquisição de microscópios eletrônicos de transmissão e varredura. Agora propõe a implantação de Centro de Instrumentação Multiusuários em Microscopia Eletrônica, que trabalhará seguindo a filosofia de funcionamento e instrumentação das Core Facilities Nacionais e Internacionais, permitindo acesso multiusuário universal.
Este modelo de compartilhamento propiciará a racionalização do uso de equipamentos de grande porte, facilitará a sua manutenção e acesso de uso e, estimulará a amplificação de competências científicas. Propiciará ainda a transferência do know how adquirido, bem como serviços especializados à comunidade científica.
O grande desafio para o futuro da pesquisa biomédica é conhecer a arquitetura das células e suas moléculas para modelar a complexidade do comportamento celular. Para endereçar este problema houve na última década um grande avanço na microscopia eletrônica de transmissão. Estes equipamentos agora estão equipados com recursos para gerar imagens tridimensionais e modelos volumétricos em amostras congeladas e vitrificadas (microscopia eletrônica tomográfica em amostras crio-fixadas). Dessa forma o objetivo desse projeto é solicitar a aquisição de microscópio eletrônico tomográfico, que representa o estado da arte em microcopia eletrônica

O câncer de mama representa importante problema de saúde pública. O microambiente onde as células neoplásicas se encontram desempenha importante papel na tumorigênese e progressão tumoral. Nosso Laboratório estuda o papel da laminina e de seus peptídeos bioativos na biologia tumoral. Verificamos que o peptídeo C16, derivado da laminina-111, regula a expressão gênica diferencial em tumores de mama (DE SOUZA SANTOS, 2011). O peptídeo C16, presente no braço curto da cadeia gama 1, estimula a expressão dos genes GPNMB e SPOCK1. Esses resultados foram obtidos na linhagem tumoral de mama MDA-MB-231. Nesse projeto, avaliaremos a ação do peptídeo C16 na expressão das moléculas codificadas pelos genes GPNMB e SPOCK1 que, além de regular adesão celular, migração e metástases, podem ser potenciais biomarcadores tumorais. Dessa forma, utilizaremos linhagens de câncer de mama com diferentes comportamentos, como MBA-MB-231 (basal-like, triplo negativo para receptores de estrógeno, progesterona e HER2) e MCF-7 (luminal B HER2 positiva). Para fins comparativos utilizaremos células normais de mama (MCF-10A). As três linhagens serão tratadas por C16, sendo a expressão de GPNMB e SPOCK1 analisada por immunoblot. Para correlacionarmos expressão protéica e função celular, investigaremos se o peptídeo C16 induziria invasividade das linhagens tumorais MDA-MB-231 e MCF-7. Adicionalmente, através de bloqueio de função por anticorpos, analisaremos se GPNMB e SPOCK1 estariam relacionadas à invasão porventura desencadeada pelo peptídeo. Finalizando, visando contextualizar in vivo nossos resultados in vitro, estudaremos o potencial papel de GPNMB e SPOCK1, como biomarcadores tumorais, por meio da imunodetecção dessas moléculas em tecido mamário normal e tumoral, valendo-se de lâminas de Tissue Microarrays, (TMAs). Buscaremos correlacionar o perfil de expressão dessas moléculas com dados clínicos dos pacientes, entre eles estadiamento e curva de sobrevida.

Projeto intitulado "Peptídeos bioativos da laminina regulando a formação de invadopódios em linhagens tumorais. Estudo dinâmico por microscopia 4D". 
Invadopódios são estruturas com papel fundamental na invasão e disseminação
de tumores malignos. Caracterizam-se como protrusões citoplasmáticas ricas em
actina e proteínas ligantes de actina. Além disso, essas protrusões possuem atividade
de degradação da matriz peri-celular mediadas por metaloproteinases da matriz
(MMPs). Nesse projeto estudaremos por microscopia 4D a dinâmica de formação de
invadopódios em linhagens tumorais tratadas por peptídeos bioativos da laminina.
Tal tipo de estudo se justifica, uma vez que já demonstramos que peptídeos bioativos
da laminina, como YIGSR, SIKVAV, AG73 e C16, estão envolvidos com migração,
invasão e atividade de protease em células tumorais (Freitas et al. 2004; Freitas et al.
2007; Morais Freitas et al. 2007; Gama-de-Souza et al. 2008; Gama-de-Souza et al.
2008 ). Linhagens tumorais serão tratadas por peptídeos da laminina e crescidas
sobre substrato fluorescente (gelatina ou Matrigel). O crescimento celular sobre esses
substratos determina focos de digestão que caracterizam atividade funcional de
invadopódios. Contagem do número de focos de digestão, bem como mensuração da
área dos mesmos, mostrará se determinado peptídeo da laminina induziu aumento da
atividade de invadopódios. A dinâmica de formação dessas estruturas em linhagens
tratadas pelos peptídeos da laminina será observada em microscopia 4D. Células
tumorais tratadas e controles serão transfectadas com plasmídeos codificando
diferentes proteínas fluorescentes de invadopódios, como actina ?mCherry? e
cortactina-GFP. Em seguida, essas células serão crescidas sobre substrato
fluorescente. Secções ópticas no eixo Z serão obtidas em diferentes intervalos de
tempo, para análise espacial e temporal da estruturação de invadopódios
eventualmente induzidos por peptídeos da laminina. Além disso, reconst

Invadopódios são estruturas com papel fundamental na invasão e disseminação de tumores malignos. Caracterizam-se como protrusões citoplasmáticas ricas em actina e proteínas ligantes de actina. Além disso, essas protrusões possuem atividade de degradação da matriz peri-celular mediadas por metaloproteinases da matriz (MMPs). Nesse projeto estudaremos por microscopia 4D a dinâmica de formação de invadopódios em linhagens tumorais tratadas por peptídeos bioativos da laminina. Tal tipo de estudo se justifica, uma vez que já demonstramos que peptídeos bioativos da laminina, como YIGSR, SIKVAV, AG73 e C16, estão envolvidos com migração, invasão e atividade de protease em células tumorais (Freitas et al. 2004; Freitas et al. 2007; Morais Freitas et al. 2007; Gama-de-Souza et al. 2008; Gama-de-Souza et al. 2008 ). Linhagens tumorais serão tratadas por peptídeos da laminina e crescidas sobre substrato fluorescente (gelatina ou Matrigel). O crescimento celular sobre esses substratos determina focos de digestão que caracterizam atividade funcional de invadopódios. Contagem do número de focos de digestão, bem como mensuração da área dos mesmos, mostrará se determinado peptídeo da laminina induziu aumento da atividade de invadopódios. A dinâmica de formação dessas estruturas em linhagens tratadas pelos peptídeos da laminina será observada em microscopia 4D. Células tumorais tratadas e controles serão transfectadas com plasmídeos codificando diferentes proteínas fluorescentes de invadopódios, como actina ?mCherry? e cortactina-GFP. Em seguida, essas células serão crescidas sobre substrato fluorescente. Secções ópticas no eixo Z serão obtidas em diferentes intervalos de tempo, para análise espacial e temporal da estruturação de invadopódios eventualmente induzidos por peptídeos da laminina. Além disso, reconstrução tri-dimensional e renderização volumétrica trará importantes informações sobre a relação invadopódio-substrato nas linhagens tumorais. Finalizando estudare

Os tumores malignos orais e de glândula mamária representam importantes problemas de saúde pública. Conjunto complexo de alterações genéticas está envolvido no processo de tumorigênese, as quais podem conferir aos tumores maior potencial proliferativo, evasão à apoptose, angiogênese sustentada e capacidade de invadir e formar metástases. Nesse processo, moléculas da matriz extracelular desempenham importante papel e estão frequentemente alteradas em tumores invasivos. Nosso Laboratório vem estudando o papel da laminina e de seus peptídeos bioativos na biologia de tumores glandulares. Demonstramos que diferentes peptídeos da laminina regulam linhagens celulares derivadas de neoplasias de glândula salivar. Isso nos motivou a analisar se esses peptídeos influenciariam a expressão gênica tumoral. Nesse estudo, linhagens tumorais derivadas de carcinomas e adenocarcinomas serão tratadas com os peptídeos bioativos da laminina C16 e AG73. Como controle células serão tratadas por peptídeos scrambled, que não apresentam função biológica. Em seguida, utilizaremos técnica de microarray para evidenciar genes diferencialmente expressos nessas linhagens celulares tumorais tratadas com peptídeos da laminina, em comparação aos controles. Após tratamento das células com os peptídeos, será extraido o RNA total, seguida de síntese de cDNA, síntese e purificação de cRNA e hibridização com membranas de microarray. A detecção dos cRNAs hibridizados será realizada por quimioluminescência e o programa GEArray Expression Analysis Suite será utilizado para normalização e análise estatística dos dados. Os resultados de microarray serão validados por qPCR, Western Blot e estudos funcionais que visem comprovar a participação dos genes diferencialmente expressos nas atividades biológicas exercidas por C16 e AG73.

Nesse projeto, estudaremos o papel de peptídeos bioativos da laminina na migração e invasão de linhagens celulares derivadas de neoplasias de glândulas salivares. Também são objetivos do projeto isolar, purificar e sequenciar receptores envolvidos nesses processos. Adicionalmente determinaremos as vias de sinalização celular relacionadas às atividades dos peptídeos. Utilizaremos linhagens derivadas de neoplasias benignas (mioepitelioma, células M1) e malignas (carcinoma adenóide cístico, células CAC2). Inicialmente estudaremos se os peptídeos induzem migração e/ou invasão. Para estudarmos se o peptídeo induz atividade migratória utilizaremos diversos métodos, como ensaio de ?ferida? em monocamadas, análise de migração em câmaras bipartites (Transwell) e estudo da migração em ?time lapse?. Para o estudo do comportamento invasivo das linhagens celulares, faremos uso de câmaras de invasão (Boyden), com as células colocadas na câmara superior, sobre filtro coberto por membrana basal reconstituída (Matrigel). Diferentes concentrações do peptídeo de interesse serão diluídas no meio que preencherá a câmara inferior. As células que digerirem o Matrigel e atravessarem o filtro serão analisadas por método fluorimétrico ou por contagem. Para o estudo dos potenciais receptores dos peptídeos envolvidos com atividade migratória e/ou invasiva faremos colunas de afinidade com esses peptídeos imobilizados. Preparações de membranas das linhagens celulares CAC2 e M1 serão passadas em colunas de afinidade com o peptídeo acoplado, visando a eluição dos potenciais ligantes. Esses ligantes serão resolvidos em gel de eletroforese, seqüenciados por espectrometria de massa e ?peptide fingerprinting?. Para estudar se os ligantes identificados pela técnicas proteômicas estariam associados à atividade migratória e/ou invasiva realizaremos bloqueio de função desses receptores por anticorpos ou por RNA de interferência. Células com receptores bloqueados serão submetidas a ensaios de

Projeto intitulado "Peptídeos da laminina modulando migração e invasão de células de neoplasias de glândulas salivares". Nesse projeto, estudaremos o papel de peptídeos bioativos da laminina na migração e invasão de linhagens celulares derivadas de neoplasias de glândulas salivares. Também são objetivos do projeto isolar, purificar e sequenciar receptores envolvidos nesses processos. Adicionalmente determinaremos as vias de sinalização celular relacionadas às atividades dos peptídeos. Utilizaremos linhagens derivadas de neoplasias benignas (mioepitelioma, células M1) e malignas (carcinoma adenóide cístico, células CAC2). Inicialmente estudaremos se os peptídeos induzem migração e/ou invasão. Para estudarmos se o peptídeo induz atividade migratória utilizaremos diversos métodos, como ensaio de ?ferida? em monocamadas, análise de migração em câmaras bipartites (Transwell) e estudo da migração em ?time lapse?. Para o estudo do comportamento invasivo das linhagens celulares, faremos uso de câmaras de invasão (Boyden), com as células colocadas na câmara superior, sobre filtro coberto por membrana basal reconstituída (Matrigel). Diferentes concentrações do peptídeo de interesse serão diluídas no meio que preencherá a câmara inferior. As células que digerirem o Matrigel e atravessarem o filtro serão analisadas por método fluorimétrico ou por contagem. Para o estudo dos potenciais receptores dos peptídeos envolvidos com atividade migratória e/ou invasiva faremos colunas de afinidade com esses peptídeos imobilizados. Preparações de membranas das linhagens celulares CAC2 e M1 serão passadas em colunas de afinidade com o peptídeo acoplado, visando a eluição dos potenciais ligantes. Esses ligantes serão resolvidos em gel de eletroforese, seqüenciados por espectrometria de massa e ?peptide fingerprinting?. Para estudar se os ligantes identificados pela técnicas proteômicas estariam associados à atividade migratória e/ou invasiva realizaremos bloqueio de função desse

Nesse projeto, estudaremos o papel de peptídeos bioativos da laminina na migração e invasão de linhagens celulares derivadas de neoplasias de glândulas salivares. Também são objetivos do projeto isolar, purificar e sequenciar receptores envolvidos nesses processos. Adicionalmente determinaremos as vias de sinalização celular relacionadas às atividades dos peptídeos. Utilizaremos linhagens derivadas de neoplasias benignas (mioepitelioma, células M1) e malignas (carcinoma adenóide cístico, células CAC2). Inicialmente estudaremos se os peptídeos induzem migração e/ou invasão. Para estudarmos se o peptídeo induz atividade migratória utilizaremos diversos métodos, como ensaio de ?ferida? em monocamadas, análise de migração em câmaras bipartites (Transwell) e estudo da migração em ?time lapse?. Para o estudo do comportamento invasivo das linhagens celulares, faremos uso de câmaras de invasão (Boyden), com as células colocadas na câmara superior, sobre filtro coberto por membrana basal reconstituída (Matrigel). Diferentes concentrações do peptídeo de interesse serão diluídas no meio que preencherá a câmara inferior. As células que digerirem o Matrigel e atravessarem o filtro serão analisadas por método fluorimétrico ou por contagem. Para o estudo dos potenciais receptores dos peptídeos envolvidos com atividade migratória e/ou invasiva faremos colunas de afinidade com esses peptídeos imobilizados. Preparações de membranas das linhagens celulares CAC2 e M1 serão passadas em colunas de afinidade com o peptídeo acoplado, visando a eluição dos potenciais ligantes. Esses ligantes serão resolvidos em gel de eletroforese, seqüenciados por espectrometria de massa e ?peptide fingerprinting?. Para estudar se os ligantes identificados pela técnicas proteômicas estariam associados à atividade migratória e/ou invasiva realizaremos bloqueio de função desses receptores por anticorpos ou por RNA de interferência. Células com receptores bloqueados serão submetidas a ensaios de

Em projeto em andamento (FAPESP 00/04693-0) verificamos que peptídios bioativos da laminina induzem alterações fenotípicas importantes em linhagem celular (CAC2) derivada de carcinoma adenóide cístico humano. Possuímos dados que sugerem que os peptídios da laminina SIKVAV e RKRLQVQLSIRT induzem secreção de metaloproteinases da matriz (MMPs) pelas células CAC2. Nesse projeto, trataremos células CAC2 com preparações enriquecidas por SIKVAV e RKRLQVQLSIRT, analisando posteriormente a síntese de MMPs por imunohistoquímica, zimografia e Western Blot. Tendo em vista que a laminina age nas células através de receptores específicos, em especial integrinas, realizaremos experimentos complementares para analisar que receptores estariam envolvidos na possível atividade proteolítica induzida pela laminina

Em projeto FAPESP (00/04693-0), estudamos o efeito da laminina e seus peptídios bioativos em linhagens de neoplasias de glândulas salivares. O projeto atual visa aprofundar resultados obtidos no projeto 00/04693-0, referentes ao efeito do peptídio SIKVAV em células derivadas de carcinoma adenóide cístico e mioepitelioma humanos (CAC2 e M1 respectivamente). SIKVAV induz a linhagem CAC2 a formar pseudocistos, estruturas características da neoplasia in vivo. Zimografia mostrou que SIKVAV aumenta a produção da MMP 2. Isso sugere que esse peptídio induziria pseudocistos por atividade proteolítica. Adicionalmente, bloqueio da integrina alfa3beta1 inibiu a formação dos pseudocistos. De um lado, temos evidências que SIKVAV induz pseudocistos por atividade proteolítica. Por outro lado, bloqueio de integrinas inibiu a formação de pseudocistos. Dessa forma, o bloqueio de integrinas poderia inibir a atividade proteolítica induzida por SIKVAV. Bloqueamos a integrina beta1 e crescemos células CAC2 dentro de laminina enriquecida por SIKVAV. Zimografia mostrou inibição de MMPs. Essas evidências apontam para interação química entre SIKVAV e integrinas das células CAC2. Esse é um fato importante, pois esse peptídio ainda não possui nenhum receptor caracterizado. Temos também resultados interessantes relacionados ao efeito de SIKVAV no mioepitelioma. Esse peptídio diferencia células derivadas de mioepitelioma (M1) no fenótipo plasmocitóide, semelhante ao que ocorre in vivo. Embora com presença marcante nas neoplasias de glândulas salivares, a origem da célula plasmocitóide permanece ignorada. Sugerimos que a laminina, através de SIKVAV, seria a responsável pela diferenciação plasmocitóide das células do mioepitelioma. Como esse peptídio exerce função biológica em células do carcinoma adenóide cístico e mioepitelioma, resolvemos estudar se SIKVAV agiria através de integrinas presentes ou em células CAC2 ou em células M1. Inicialmente realizaremos ensaios de adesão ond

Atualmente, grande parte da comunidade científica procura compreender os mecanismos íntimos de interação entre a matriz extracelular e a célula neoplásica. Esse projeto acompanha essa tendência, visando estender nossos achados anteriores e obter informações em nível molecular sobre o efeito da laminina em diferentes neoplasias de glândula salivar. Investigamos o papel da laminina e de seus peptídios bioativos na morfo e citodiferenciação de diferentes linhagens neoplásicas derivadas de glândula salivar. Possuímos consistentes resultados sugerindo que a laminina é importante reguladora do fenótipo do carcinoma adenóide cístico, neoplasia maligna que possui como característica importante a disseminação peri-vascular ou peri-neural. A laminina é biologicamente ativa, como demonstrado in vivo e in vitro. Regula tanto diferenciação quanto proliferação celular, através da interação com receptores da superfície celular. Entre esses receptores se encontram as integrinas, uma grande família de proteínas trans-membrânicas, compostas de subunidades alfa e beta, responsáveis pela mediação do efeito da laminina na célula. Esses efeitos biológicos são principalmente relacionados a peptídios localizados em diferentes domínios da molécula de laminina. Diversos sítios ativos da laminina já foram identificados. YIGSR, da cadeia beta, promove adesão e migração celular. Por outro lado, SIKVAV, da cadeia alfa, é envolvido em adesão celular, proliferação de células normais e neoplásicas, angiogênese e atividade proteolítica. Nesse projeto, células derivadas de carcinoma adenóide cístico humano (linhagem CAC2) foram crescidas no interior de gel de laminina-1. Esse ensaio induziu a formação estruturas sólidas, ductiformes e pseudo-císticas, similares aos padrões da neoplasia in vivo Nosso ensaio com peptídios sintéticos trouxe outras informações sobre o efeito da laminina no fenótipo de células CAC2. Células CAC2 crescidas dentro de de laminina enriquecida por SIKVAV exibiram sinais de dig

Foi estudada a distribuição do filamento intermediário vimentina em linhagens derivadas de neoplasias de glândula salivar. Nessas células a vimetina se distribui de maneira única, formando filamentos curtos, isolados da rede principais. Analisamos a distribuição desse filamento em relação aos demais componentes do cito-esqueleto, como actina e microtúbullos. Verificamos que a ruptura das redes de actina e microtúbulos não influencia a distribuição dos filamentos curtos de vimentina. Video-microscopia mostrou que os filamentos aparecem nas areas de maior motilidade celular. Tratamento das linhagem celulares com drogas que aumentam a fosforilação proteica induziu aumento dos filamentos nas regiões de maior motilidade. Concluímos que esses filamentos curtos de vimentina aparecem devido à despolimerização da rede, à medida que a célula se movimenta. Tendo em vista que já foi demostrado que a vimentina sofre despolimerização induzida por fosforilação, sugerimos que a formação dos filamentos curtos seja fosforilação-dependente.