Eduardo Magalhães Rego.

Os atuais modelos murinos de xenotransplante utilizados como modelos de estudo in vivo dos processos leucêmicos humanos tem falhado na reconstrução dos processos fisiopatológicos relacionados a doença devido a não similaridade com o nicho medular humano. Deste modo, a avaliação dos processos de alto-renovação, diferenciação e transformação das células tronco hematopoiéticas humanas (HSCs) e leucêmicas (LSCs), bem como sua avaliação quanto a eficácia de novas modalidades de tratamento, devem ser realizadas em microambientes espécie-específicos. Isto é suportado pelo fato de alguns subtipos leucêmicos (presentes no grupo de prognóstico favorável da doença), como a leucemia promielocítica humana (LPA), apresentam recorrente falha de enxertia em modelos de xenotransplante, e apesar do seu prognóstico favorável frente a outros subtipos de leucemias agudas, estes subtipos ainda apresentam altas taxas de mortalidade e risco de recaída. Neste sentido, acredita-se que variações genéticas que confiram maior resistência ao clone leucêmico podem influenciar na capacidade de enxertia destas células, favorecendo sua avaliação in vivo. Estudos prévios do nosso grupo demonstraram que uma maior relação de expressão ?Np73/TAp73 está associada com pior prognóstico na LPA (menor sobrevida global e sobrevida livre de doença) e resistência à apoptose induzida por citarabina. O ?Np73, forma truncada do gene TP73, atua como um potente inibidor da atividade transcripcional das proteínas TP53 e TAp73, desempenhando, desta forma, um importante papel na proliferação e morte celular. Assim, a atividade oncogênica do gene TP73 é determinada pelo balanço entre suas isoformas transcricionalmente ativa (TAp73) e inativa (?Np73), e essa relação correlaciona-se com o prognóstico clínico e falha no tratamento em diversas neoplasias humanas. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar se alterações na via do TP53/TP73 estão associadas com uma maior capacidade de enxertia em células CD34+ induzidas e de pacientes com LPA em modelos de xenotransplante humanizados. Subjacente a isto, investigaremos os mecanismos pelos quais a via TP53/TP73 podem conferir às células PML-RARa+ vantagens de enxertia, tais como modificações na proliferação, viabilidade, ciclo celular, apoptose e capacidade clonogênica. Ademais, avaliaremos o transcriptoma de pacientes com LPA que obtiveram e que falharam na enxertia em modelos de xenotransplante, afim de identificar possíveis alvos de regulação do TP53/TP73. A expressão dos alvos da via TP53/T73 será investigada por PCR em tempo real e Western blotting.

O presente estudo tem por objetivos caracterizar e analisar os episódios de neutropenia febril, agentes infecciosos, fase do tratamento, profilaxia, mortalidade e as causas de óbito após a primeira indução de remissão, em pacientes acometidos por leucemia mielóide aguda, a partir de dados secundários de prontuários do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, no período de 2012 a 2017. Trata-se de estudo retrospectivo e descritivo, em que a coleta de dados será baseada em um levantamento de informações dos pacientes, de acordo com dados de diagnóstico, tratamento, complicações, evolução, resposta ao tratamento, profilaxia e mortalidade. Os critérios de inclusão serão: pacientes adultos, diagnóstico de leucemia mielóide aguda ou síndrome mielodisplásica e tratamento com quimioterapia mielossupressora; e os critérios de exclusão serão: pacientes menores de 18 anos de idade e tratamento com quimioterapia não mielossupressora. A análise dos dados realizará um mapeamento da frequência das complicações infecciosas pelo tratamento proposto, fase do tratamento, seus ciclos e a mortalidade. As variáveis contínuas serão descritas por meio do valor mediano e a sua variância pelos intervalos interquartis. As variáveis categóricas serão descritas por frequência. A avaliação das variáveis: idade, gênero, glóbulos brancos no momento do diagnóstico, grupo de risco segundo a ELN, número absoluto de neutrófilos no momento do diagnóstico e o risco de desenvolver episódios de neutropenia febril, será realizada através do modelo de regressão por Poisson.

A proposta de continuidade do Centro de Terapia Celular - CTC concentra nossos esforços de pesquisa nos próximos seis anos em três tipos de células principais: células-tronco mesenquimais; linfócitos geneticamente modificados (incluindo células CAR-T) e células-tronco hematopoéticas. A pesquisa é delineada de acordo com o estágio de desenvolvimento: pré-clínica, clínica e transferência de tecnologia. O estágio pré-clínico também envolve a patogênese de doenças hematológicas candidatas que são para terapia celular, bem como o estudo do nicho da medula óssea e o desenvolvimento de modelos in vitro e in vivo para a terapia celular.

Macrófagos associados ao tumor (do inglês: Tumor associated macrophages - TAM) são macrófagos classificados como subtipo M2 e encontrados habitualmente em tumores sólidos. Os estudos científicos demonstraram que a presença dos TAM´s auxiliam os diferentes tipos de tumores, possibilitando sua proliferação, migração e escape do sistema imunológico. Até o momento os trabalhos avaliando o papel dos TAM´s eram limitados apenas aos tumores sólidos e pouco se sabe até então sobre o papel do sistema imune na fisiopatologia da leucemia mieloide aguda (LMA). Em nosso estudo nós escolhemos investigar a presença e função dos TAM´s na leucemia promielocitica aguda (LPA), que é caracterizada como um subtipo de LMA com prognóstico favorável. Recentemente, nós conseguimos identificar e caracterizar os TAM´s na medula óssea dos pacientes com LPA e observamos através de experimentos funcionais (in vitro) que a presença dos blastos da LPA é capaz de induzir a polarização de monócitos provenientes do sangue periférico (obtidos de um doador saudável) para o subtipo M2, bem como, os mesmos achados foram encontrados em macrófagos murinos provenientes da medula óssea de camundongos wild-type para a mutação do PML-RARA. Baseado nos nossos resultados in vitro, nós queremos estudar a função e o impacto dos TAM´s no desenvolvimento da LPA in vivo. Contudo, até o momento, os estudos de xenotransplante com células primárias de LPA mostraram resultados insatisfatórios devido a falha de enxertia deste subtipo leucêmico (de bom prognóstico). Deste modo, utilizaremos a estratégia de modelo murino humanizado (do inglês - humanized xenograft mouse model - disponível na Universidade de Groningen), que reproduz o microambiente medular humano, aumentando a probabilidade de enxertia da LPA. Deste modo, nosso primeiro objetivo é avaliar a enxertia de células primárias de LPA utilizando o modelo proposto. Subjacente a isto, nos planejamos transplantar células primarias de LPA juntamente com os diferentes subtipos de macrófagos (M0, M1 e M2) para avaliar o impacto destes diferentes subtipos na capacidade de enxertia e desenvolvimento da LPA. Ademais, utilizando uma estratégia de larga escala, analisaremos as diferenças transcricionais e funcionais dos macrófagos sorteados para CD163+/CD206+ dos pacientes com LPA comparados com os doadores saudáveis. Por fim, investigaremos o efeito do tratamento com ATRA na modulação do perfil de macrófagos nos pacientes com LPA, bem como, no modelo murino utilizado.

A leucemia promielocítica aguda (LPA) é uma neoplasia hematológica caracterizada em 95% dos casos pela translocação entre os cromossomos 15 e 17, resultando na fusão entre os genes da proteína da leucemia promielocítica (PML) e do receptor ± do ácido retinóico (RARa). O gene PML-RARa é traduzido numa proteína quimérica que previne a diferenciação granulocítica. Hoje em dia, a LPA é tratada com ATRA (ácido trans retinoico total), uma terapia alvo que permite a maturação de promielócitos para granulócitos; no entanto, alguns pacientes recaem ou nunca respondem a este tratamento. Devido a isso, alguns biomarcadores estão sendo estudados para encontrar seu papel na patogênese do LPA e seu impacto no prognóstico e resposta ao tratamento. Neste contexto, o gene TP73 é um marcador prognóstico e preditivo promissor em LPA. Nosso laboratório demonstrou que a expressão de ?Np73, variante de TP73, está relacionada ao mau prognóstico, mas não há estudos sobre o impacto de outras variantes nem sua relevância no tratamento. Aqui nós pretendemos explorar amostras de pacientes de LPA para determinar quais variantes de TP73 são diferencialmente expressas em LPA e, em seguida, desenvolver um modelo animal de LPA para explorar o valor prognóstico e preditivo destas variantes de TP73. Este modelo animal expressará o gene PML-RARa e as variantes de TP73 expressas diferencialmente em amostras de pacientes. O desenvolvimento deste modelo será feito pela infecção de células de medula óssea de camundongos hCG-PML/RAR± com o sistema lentivírus recombinado com a variante TP73 expressa diferencialmente. Nestes ratos será analisada a evolução da doença através do teste de hemograma, imunofenótipo, níveis de transcritos PML-RARa, expressão de variantes de TP73, sobrevida global, sobrevida livre de doença e outros aspectos no modelo animal de APL desenvolvido. Além disso, avaliaremos o sucesso da terapia com ATRA neste modelo animal, utilizando os mesmos testes mencionados anteriormente e também os eventos de recaída. Finalmente, estudaremos a expressão gênica de alguns genes do eixo TP73 para tentar explicar quais das funções de TP73 são relevantes no progresso da doença. Os resultados deste estudo nos permitirão abordar o conhecimento do impacto do gene TP73 no prognóstico e na resposta ao tratamento em APL, e quais as variantes de TP73 relevantes nesse contexto.

A leucemia mieloide aguda (LMA) pode ser definida, na maior parte das vezes, como um conjunto de doenças de caráter esporádico e que representa a falência na maturação de células mieloides, com expansão da forma imatura da linhagem no sangue, medula e outros tecidos. Das diversas alterações genéticas que podem resultar na doença, a mutação no gene FLT3 na forma de duplicações internas em tandem (do inglês, ITD, Internal Tandem Duplicação) aparece em cerca de 30% dos casos e é ligada a um prognóstico pobre, com menores chances de remissão e maiores taxas de recaída. Dentre as novas drogas pesquisadas para o tratamento da LMA com FLT3-ITD, os inibidores de tirosina quinase de destacam. Quisartinib e midostaurin, por exemplo, mostraram ação anti-tumoral substancial com resultados clínicos significativos. Porém, os mesmos também demonstraram que quando usadas como monoterapia, essas drogas são incapazes de manter ou mesmo alcançar a remissão completa. Assim, pesquisas de novas classes de drogas, possivelmente usadas em terapia combinada com quimioterápicos clássicos ou com inibidores de tirosina quinase apresentam alta relevância. Uma dessas novas classes é a dos mitocans, um grupo de drogas capazes de agir na mitocôndria interrompendo a produção de energia pela célula, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio e ativando a cadeia intrínseca de apoptose. Nesse estudo, o mitocan alfa-tocoferol é usado no tratamento de células MV4;11, linhagem modelo para LMA com FLT3-ITD, no intuito de demonstrar sua ação mitocondrial em células leucêmicas, potencializando sua chance de futuro uso no tratamento da doença em questão. Assim os objetivos principais do projeto são: 1)Encontrar a dose efetiva (ED 50) do mitocan alfa-tocoferol na apoptose de células MV4,11. 2)Analisar o potencial de membrana mitocontrial de células MV4,11 tratadas com mitocan alfa-tocoferol para avaliar hipótese de que o efeito pró-apoptótico do alfa-tocoferol em células tumorais da linhagem MV4,11 se dá pela despolarização da membrana mitocondrial. 3) Analisar ativação de caspases 3 e 9 através do método Western Blot em células MV4,11 tratadas com alfa-tocoferol. 4) Analisar fosforilação do receptor tirosina quinase FLT3 em células MV4,11 tratadas com alfa-tocoferol

A MO possui microambiente essencial para a manutenção das propriedades de autorrenovação e diferenciação das HSCs e dos progenitores diferenciados. Um dos componentes desse microambiente são as MSCs, estas compõem o estroma medular, se destacando em relevância na hemotopoiese normal e na regulação imunológica. A literatura descreveu três populações distintas de HSCs no cocultivo com as MSCs: as células sobrenadantes (Fração A), as células aderentes à superfície das MSCs (Fração B) e as células que se localizavam abaixo da camada de MSCs (Fração C). Também foi visto que as MSCs realizam transferência de ROS através de gap junctions para as HSCs de indivíduos saudáveis. O ROS nas HSCs está associado ao aumento na sua mobilização e motilidade. A produção de ROS foi associada à taxa de recidiva de doença em pacientes com LMA, sugerindo ser um importante fator prognóstico. Descreveu-se ainda que mutações no gene Ras associadas à ativação constitutiva da proteína aumentam a ativação de NOX2 e, consequentemente, a produção de ROS em células CD34+ contribuindo para o fenótipo leucêmico. Observou-se da mesma forma a produção de PGE2 pela COX2 das MSCs, quando secretada no meio extracelular contíguo ás HSCs, estas reduzem os níveis intracelulares de ROS. Nossa tese, é que as MSC possam favorecer a sobrevivência das células malignas através da diminuição dos danos celulares e/ou indução de quiescência e/ou diminuição da apoptose induzidos por ROS.

A leucemia mieloide aguda (LMA) pode ser definida, na maior parte das vezes, como um conjunto de doenças de caráter esporádico e que representa a falência na maturação de células mieloides, com expansão da forma imatura da linhagem no sangue, medula e outros tecidos. Das diversas alterações genéticas que podem resultar na doença, a mutação no gene FLT3 na forma de duplicações internas em tandem (do inglês, ITD, Internal Tandem Duplicação) aparece em cerca de 30% dos casos e é ligada a um prognóstico pobre, com menores chances de remissão e maiores taxas de recaída. Dentre as novas drogas pesquisadas para o tratamento da LMA com FLT3-ITD, os inibidores de tirosina quinase de destacam. Quisartinib e midostaurin, por exemplo, mostraram ação anti-tumoral substancial com resultados clínicos significativos. Porém, os mesmos também demonstraram que quando usadas como monoterapia, essas drogas são incapazes de manter ou mesmo alcançar a remissão completa. Assim, pesquisas de novas classes de drogas, possivelmente usadas em terapia combinada com quimioterápicos clássicos ou com inibidores de tirosina quinase apresentam alta relevância. Uma dessas novas classes é a dos mitocans, um grupo de drogas capazes de agir na mitocôndria interrompendo a produção de energia pela célula, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio e ativando a cadeia intrínseca de apoptose. Nesse estudo, o mitocan alfa-tocoferol é usado no tratamento de células MV4;11, linhagem modelo para LMA com FLT3-ITD, no intuito de demonstrar sua ação mitocondrial em células leucêmicas, potencializando sua chance de futuro uso no tratamento da doença em questão. Assim os objetivos principais do projeto são: 1)Encontrar a dose efetiva (ED 50) do mitocan alfa-tocoferol na apoptose de células MV4,11. 2)Analisar o potencial de membrana mitocontrial de células MV4,11 tratadas com mitocan alfa-tocoferol para avaliar hipótese de que o efeito pró-apoptótico do alfa-tocoferol em células tumorais da linhagem MV4,11 se dá pela despolarização da membrana mitocondrial. 3) Analisar ativação de caspases 3 e 9 através do método Western Blot em células MV4,11 tratadas com alfa-tocoferol. 4) Analisar fosforilação do receptor tirosina quinase FLT3 em células MV4,11 tratadas com alfa-tocoferol.

A MO possui microambiente essencial para a manutenção das propriedades de autorrenovação e diferenciação das HSCs e dos progenitores diferenciados. Um dos componentes desse microambiente são as MSCs, estas compõem o estroma medular, se destacando em relevância na hemotopoiese normal e na regulação imunológica. A literatura descreveu três populações distintas de HSCs no cocultivo com as MSCs: as células sobrenadantes (Fração A), as células aderentes à superfície das MSCs (Fração B) e as células que se localizavam abaixo da camada de MSCs (Fração C). Também foi visto que as MSCs realizam transferência de ROS através de gap junctions para as HSCs de indivíduos saudáveis. O ROS nas HSCs está associado ao aumento na sua mobilização e motilidade. A produção de ROS foi associada à taxa de recidiva de doença em pacientes com LMA, sugerindo ser um importante fator prognóstico. Descreveu-se ainda que mutações no gene Ras associadas à ativação constitutiva da proteína aumentam a ativação de NOX2 e, consequentemente, a produção de ROS em células CD34+ contribuindo para o fenótipo leucêmico. Observou-se da mesma forma a produção de PGE2 pela COX2 das MSCs, quando secretada no meio extracelular contíguo ás HSCs, estas reduzem os níveis intracelulares de ROS. Nossa tese, é que as MSC possam favorecer a sobrevivência das células malignas através da diminuição dos danos celulares e/ou indução de quiescência e/ou diminuição da apoptose induzidos por ROS.

Dentre os diversos projetos de pesquisa vinculados ao Projeto "Centro de Terapia Celular (CTC) ", que tem como objetivo geral estudar aspectos moleculares, celulares e biológicos de células-tronco, encontram-se em andamento estudos básicos e pré-clínicos de doenças, como a Leucemia Promielocítica, a Disceratose Congênita, a Hemofilia A e a Anemia de Falconi, que utilizam modelos animais transgênicos e diversas outras linhagens de camundongos, sendo que dentre as linhagens utilizadas estão: Tg (CTSG-PML/RARA)6179Ppp; CEBPalfa KO; Pep Boy; Dkc1tm1Ppp; knockin JAK2; CEBPg Kiko condicional; vav-cre, NOD.Cg-PRKDCscid; KO-F8; KO-F9; Tph2 KO; TPH1 KO; C57BL/6N; FVB/N; Tg CALM/AF10. Tais linhagens são mantidas no Laboratório de Estudos Experimentais em Animais (Biotério), localizado na Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto. Visto a necessidade de uma manutenção adequada destas colônias, para a realização dos estudos científicos, que conjugue técnicas de produção e cuidados adequados, o objetivo principal do projeto "Modelos animais transgênicos gerados e usados para estudos básicos e pré-clínicos" é preparar profissionais que sejam aptos para atuar tanto na área da Ciência em Animais de Laboratório quanto na área de Bioterismo. Deste modo, buscaremos preparar os profissionais para: desenvolver atividades relacionadas ao manejo das colônias de camundongos, que vão desde a realização dos processos de dimensionamento da colônia, higienização e esterilização de materiais, até a genotipagem de animais transgênicos; promover o desenvolvimento de atividades relacionadas ao acompanhamento de protocolos experimentais; desenvolver atividades relacionadas à conscientização sobre ética e normativas e desenvolver atividades relacionadas à gestão de um Biotério. Proporcionaremos, desta maneira, a difusão do conhecimento e o treinamento, mostrando as diretivas do manejo adequado de animas utilizados em experimentação científica.

O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é um regulador importante da proliferação e diferenciação celular. Alterações na expressão de EGFR estão associadas ao crescimento tumoral e metástase em tumores sólidos. Por outro lado, há escassa informação na literatura sobre a participação da via do EGFR em malignidades hematológicas, incluindo a Leucemia Mielóide Aguda (LMA). Um estudo prévio realizado em nosso laboratório revelou que o EGF (fator do crescimento epidérmico), ligante do EGFR, apresentou valor prognóstico em pacientes com Leucemia Promielocítica Aguda (LPA), subtipo M3 da LMA, tratados segundo o protocolo do Consórcio Internacional em LPA (CI-LPA). Interessantemente, pacientes portadores de carcinoma de pulmão do tipo não-pequenas células (CPNPC) e LMA sincrônicos tratados com erlotinib, inibidor de EGFR utilizado no tratamento do CPNPC, apresentaram regressão de ambas as neoplasias. Contudo, é importante salientar que os mieloblastos destes pacientes não expressavam EGFR. De acordo, outro estudo demonstrou que gefitinib, também inibidor de EGFR, atuou de forma sinérgica quando associado ao ácido all-trans retinóico (ATRA) e trióxido de arsênico (ATO) na diferenciação mielóide de linhagens celulares da LPA negativas para EGFR. Até o momento, o mecanismo pelo qual erlotinib e gefitinib interagem com os progenitores hematopoiéticos não são bem conhecidos. Ademais, é necessário determinar se estas drogas induzem diferenciação das células derivadas da LPA in vivo. Portanto, no presente trabalho, pretendemos avaliar os efeitos de erlotinib e gefitinib isolados ou em associação a ATRA ou ATO em células de linhagem, blastos primários e modelo experimental murino da LPA, bem como elucidar os alvos moleculares destas drogas.

A translocação t(15;17)(q24;q21) dá origem ao gene híbrido PML/RARa, que é a principal característica genética da Leucemia Promielocítica Aguda (LPA), caracterizada pela presença de infiltrado de células leucêmicas na medula óssea (MO) e sangue periférico, semelhantes à promielócitos. A associação da patogênese dessa leucemia com o gene PML/RARa foi demonstrada em modelos murinos transgênicos, uma vez que os animais apresentam uma doença com características clínicas e morfológicas semelhantes à LPA em humanos. No entanto, a latência prolongada e a baixa penetrância da doença sugere que a presença do gene PML/RARa não é suficiente para desencadear a transformação maligna completa e que fatores genéticos adicionais são necessários para a progressão da doença. A LPA é o primeiro exemplo de terapia de indução da diferenciação em casos de câncer e é considerada a leucemia com maiores chances de cura. Entretanto, aproximadamente 20-30% dos pacientes tratados evoluem para a recaída da doença. A presença de mutações em genes como o FLT3 e a desregulação na via de sinalização do CEBP/A têm sido descritos como fatores adicionais na leucemogênese induzida pelo rearranjo PML/RARa. Diferentes estudos correlacionaram padrões de mutações que se repetem com elevada frequência com a ocorrência de diversos tipos de câncer, sendo denominadas driver mutations. Além das mutações genéticas, alterações epigenéticas como os padrões aberrantes de metilação de DNA foram associadas a oncogênese. Padrões específicos de metilação do DNA foram identificados e associados a fatores de transcrição mutados como o PML/RARa em pacientes com LMA. Sendo assim, a questão é determinar se a transformação maligna do câncer está diretamente associada a um padrão aberrante de metilação de DNA ou se a metilação anômala do DNA ocorre em um estágio mais tardio da doença, como contribuição secundária. Estudos mais recentes buscam a identificação não apenas das driver mutations, mas também das vias e mecanismos de progressão da doença, os quais elas estejam envolvidas. A tecnologia de next generation sequencing (NGS) é uma ferramenta útil na identificação de alterações genéticas e padrões oncogênicos em alta resolução. Desta forma, este trabalho visa a análise comparativa do transcriptoma, do genoma completo e dos padrões de metilação ao longo do DNA de pacientes com LPA no momento do diagnóstico, em remissão completa e na recidiva da doença pela metodologia de NGS, de forma a contribuir para o esclarecimento sobre o papel das mutações adicionais e das alterações epigenéticas associadas à progressão desta leucemia

Comparison of Genome-wide DNA methylation mapping between CD34+CD38-ALDHhigh and CD34+CD38-ALDHint cell subsets isolated from acute myeloid leukemia patients

Macrófagos associados ao tumor (do inglês: Tumor associated macrophages - TAM) são macrófagos classificados como subtipo M2 e encontrados habitualmente em tumores sólidos. Os estudos científicos demonstraram que a presença dos TAM´s auxiliam os diferentes tipos de tumores, possibilitando sua proliferação, migração e escape do sistema imunológico. Até o momento os trabalhos avaliando o papel dos TAM´s eram limitados apenas aos tumores sólidos e pouco se sabe até então sobre o papel do sistema imune na fisiopatologia da leucemia mieloide aguda (LMA). Em nosso estudo nós escolhemos investigar a presença e função dos TAM´s na leucemia promielocitica aguda (LPA), que é caracterizada como um subtipo de LMA com prognóstico favorável. Recentemente, nós conseguimos identificar e caracterizar os TAM´s na medula óssea dos pacientes com LPA e observamos através de experimentos funcionais (in vitro) que a presença dos blastos da LPA é capaz de induzir a polarização de monócitos provenientes do sangue periférico (obtidos de um doador saudável) para o subtipo M2, bem como, os mesmos achados foram encontrados em macrófagos murinos provenientes da medula óssea de camundongos wild-type para a mutação do PML-RARA. Baseado nos nossos resultados in vitro, nós queremos estudar a função e o impacto dos TAM´s no desenvolvimento da LPA in vivo. Contudo, até o momento, os estudos de xenotransplante com células primárias de LPA mostraram resultados insatisfatórios devido a falha de enxertia deste subtipo leucêmico (de bom prognóstico). Deste modo, utilizaremos a estratégia de modelo murino humanizado (do inglês - humanized xenograft mouse model - disponível na Universidade de Groningen), que reproduz o microambiente medular humano, aumentando a probabilidade de enxertia da LPA. Deste modo, nosso primeiro objetivo é avaliar a enxertia de células primárias de LPA utilizando o modelo proposto. Subjacente a isto, nos planejamos transplantar células primarias de LPA juntamente com os diferentes subtipos de macrófagos (M0, M1 e M2) para avaliar o impacto destes diferentes subtipos na capacidade de enxertia e desenvolvimento da LPA. Ademais, utilizando uma estratégia de larga escala, analisaremos as diferenças transcricionais e funcionais dos macrófagos sorteados para CD163+/CD206+ dos pacientes com LPA comparados com os doadores saudáveis. Por fim, investigaremos o efeito do tratamento com ATRA na modulação do perfil de macrófagos nos pacientes com LPA, bem como, no modelo murino utilizado.

A "Escola São Paulo de Ciências Avançadas em Oncogênese e Medicina Translacional para o Tratamento do Câncer" tem por objetivo oferecer treinamento a estudantes de pós-graduação na área de bioinformática aplicada à pesquisa do câncer através de um curso teórico-prático ministrado por pesquisadores brasileiros e americanos com expressiva produção científica na área. Além deste treinamento, o evento contará com palestras sobre epidemiologia, biologia celular e molecular da oncogênese, interação do microambiente com as células tumorais, poluição e câncer, e mesas redondas sobre novas estratégias terapêuticas. A presente proposta foi organizada de maneira a permitir a interação entre os alunos e pesquisadores de diferentes áreas, reforçando o aspecto multidisciplinar da medicina translacional para o tratamento do câncer. 
O desenvolvimento de novas tecnologias baseadas na obtenção e análise em larga escala de dados gênomicos e protêomicos exige ferramentas de informática sofisticadas e que não são rotineiramente ensinadas nos cursos de pós-graduação do país. Há uma carência de profissionais especializados na área e ao mesmo tempo há a necessidade da incorporação destas tecnologias às pesquisas conduzidas no país de maneira a torná-las mais competitivas internacionalmente. 
Além disto, o caráter multidisciplinar da pesquisa do câncer exige a interação de pesquisadores com diferentes expertises. A resolução de problemas científicos e clínicos passa pela convergência de tecnologias, e este evento permitirá que projetos em desenvolvimento pelos alunos sejam discutidos sob a ótica de pesquisadores de diferentes áreas e espera-se que resulte no expansão da malha de interações dentro do estado de São Paulo, bem como entre pesquisadores paulistas e estrangeiros.

A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) é uma neoplasia que se caracteriza pela proliferação de células progenitoras hematopoéticas que apresentam bloqueio da diferenciação mielóide, resistência à apoptose e desregulação do ciclo celular e senescência. Dentre as alterações genéticas descritas na LMA, algumas são translocações cromossômicas que resultam na formação de genes de fusão que tem relevância na fisiopatogênese e como marcadores prognósticos. No entanto, cerca de 40% a 50% das LMAs apresentam cariótipo normal. Estudos recentes identificaram mutações em aproximadamente 60% destes casos. Além das alterações genéticas na célula leucêmica, a contribuição do microambiente da medula óssea na leucemogênese foi postulada, porém ainda é controversa. Sabe-se por exemplo que as células mesenquimais (MSCs) tem um importante papel na progressão tumoral por meio da secreção de fatores de crescimento que atuam sobre receptores que sinalizam vias de proliferação e sobrevivência celular, especialmente de PI3K/Akt e RAF/MEK/ERK. Um dos sistemas hormonais que atua nas vias acima citadas é o IGF, cujo alguns componentes são sabidamente secretados por MSCs. Há algumas evidências de alteração de IGF em LMA. A perda de imprinting genômico de IGF2 foi descrita em pacientes com a doença e associou-se ao aumento da expressão gênica e da secreção autócrina de IGF2. Do ponto de vista clínico, o aumento de expressão gênica e de níveis plasmáticos de IGFBP-2 foi relacionado com resistência à quimioterapia convencional de pacientes com LMA. Corroborando estes resultados, Kühnla e cols. (2011) reportaram que o aumento de expressão de IGFBP-2 foi relacionado a pior prognóstico em LMA. Chapuis e cols. (2010) sugeriram que há uma ativação contínua da via PI3K/Akt por uma regulação autócrina por IGF-1 em células leucêmicas isoladas de medula óssea de pacientes recém-diagnosticados para LMA. No entanto, não foi realmente comprovado que as células leucêmicas secretam IGF-1. Desse modo, acreditamos que, além de uma atividade autócrina da célula leucêmica, há também a participação da secreção parácrina de IGF pelas células mesenquimais presentes na medula óssea.

O projeto do Centro de Terapia Celular (CTC) tem como foco a realização de pesquisas avançadas, básicas e aplicada s.com células-tronco (CT). O CTC congrega 9 pesquisadores principais (Pls) com reconhecida liderança nesta área no Bra sil. equipe se complementa com a participação de 20 pesquisadores associados e 10 colaboradores estrangeiros. A atual proposta continua e expande a experiência adquirida pelo grupo no projeto CEPID em vigor, tanto no aspecto cientifico: como nos aspectos de disseminação do conhecimento e de transferência tecnológica para a sociedade, como pode ser verificado no sítio: http://ctc.fmrp.usp.br . O projeto científico compreende um ambicioso programa de pesquisa multidisciplinar * que objetiva estudar aspectos moleculares, celulares e biológicos das CT normais e patológicas e avaliar, criticamente e. o seu papel terapêutico. Os estudos serão conduzidos com CT pluripotentes (CT Embrionária e CT de pluripotência induzida) e C i somáticas (CT Hematopoética, CT Mesenquimal e CP Endoteliai). No território das CTE pretendemos a geração de linhagens : brasileiras que possam ser expandidas e usadas em protocolos pré-clínicos e clínicos, bem como contribuir par a o , entendimento dos mecanismos da pluripotência. Serão geradas iPSCs derivadas de doentes com Disceratose Congênita: Anemia de Fanconi, Hemofilia A e Doença de Parkinson com o objetivo de entender mecanismos envolvidos na patologia. na 1 manutenção da pluripotência e no processo de diferenciação celular. CT Hematopoéticas serão derivadas de CTEs e de iPSCs i e estabelecidas linhagens celulares tanto de CT normais como leucêmicas para os estudos dos mecanismos envolvidos no i controle da hematopoese normal e neoplásica. Modelos animais transgênicos de leucemia promielocítica aguda serão gerados e usados para estudos básicos e pré-clínicos. CT do Câncer serão estudadas tendo como foco os mecanismos de trans1 cá o Epitélio-Mesenquimal e Endotélio-Mesenquimal (EMT e EndMT) . Estes mecanismos também serão estudados no contex to d2. . reprogramação celular e na geração de CT.Na arena clínica serão realizados ensaios clínicos usando CT mesenquimais no tratamento do diabetes insulino-dependente dos tipos 1 e 2, da Anemia Aplástica grave adquirida refratária, na prevenção da Doença do Enxerto contra o Hospedeiro (DECH) aguda e crônica e da falha de enxertia no transplante alogênico haploident ico Por fim serão desenvolvidos processos de produção de CT em grande escala em condições GMP para permitir o seu uso.

O reconhecimento de que pacientes desenvolvem imunossupressão no pós-sepse tem elevado o interesse acerca desse fenômeno. Recentemente, foi demonstrado o papel crucial de linfócitos T reguladores (Tregs), assim como de citocinas antiinflamatórias e ativação alternativa de macrófagos. Nessa fase pode ocorrer expansão de tumores, possivelmente piorando o desfecho de pacientes com câncer que desenvolvem sepse. Macrófagos associados ao tumor (TAM) são peças-chave na orquestração de escapes imunológicos e promoção de crescimento tumoral, sendo preditor de mau prognóstico em muitos tipos de câncer. Nossa hipótese é de que pode haver expansão tumoral no pós-sepse por mecanismo dependente de maior infiltração por TAM. Para testar essa hipótese, induziremos sepse através de modelo de ligadura e punção cecal em camundongos C57. No 15º dia após o procedimento, animais sobreviventes ou naïve serão inoculados por via subcutânea com inóculos de melanoma B16- F10-luc. O crescimento tumoral será avaliado por medição do volume tumoral e bioluminescência. No D21 após a inoculação em animais pós-sepse ou naïve, macrófagos tumorais serão isolados para extração de RNA e análise de expressão gênica por microarranjo. Genes representativos diferencialmente expressos serão confirmados por RT-PCR. Adicionalmente, realizaremos co-inoculação de macrófagos indiferenciados derivados de medula óssea de animais pós-sepse ou naïve com células tumorais para avaliar a participação de macrófagos do pós-sepse na possível expansão tumoral.

A leucemia promielocítica aguda (LPA) é um subtipo de leucemia mielóide aguda (LMA), caracterizada pela presença de infiltrado de células leucêmicas na medula óssea (MO) e sangue periférico, semelhantes à promielócitos. Em mais de 98% dos casos a LPA está associada à translocação t(15;17)(q22;q21), envolvendo o gene receptor α do acido retinóico (RARA) no cromossomo 17, translocado e fundido com o gene da leucemia promielocítica (PML) no cromossomo 15. A associação da patogênese dessa leucemia com o gene PML/RARa foi demonstrada em modelos murinos, uma vez que 10% dos animais que expressam a proteína de fusão desenvolvem doença semelhante à LPA em humanos. No entanto, a latência prolongada da doença sugere que a presença do gene PML/RARa não é suficiente para desencadear a transformação maligna completa e que fatores genéticos adicionais são necessários para a progressão da doença. O principal avanço no tratamento da LPA foi a demonstração de que o ATRA promove a diferenciação celular, sendo este o primeiro exemplo de terapia de indução da diferenciação em casos de câncer, com elevada taxa de cura. Entretanto, aproximadamente 20-30% dos pacientes tratados evoluem para a recaída da doença. A presença de mutações em genes como o FLT3 e a desregulação na via de sinalização do CEBP/A têm sido descritos como fatores adicionais na leucemogênese induzida pelo rearranjo PML/RARa. Diferentes estudos correlacionaram padrões de mutações que se repetem com elevada frequência com a ocorrência de diversos tipos de câncer, sendo denominadas driver mutations. Além das mutações genéticas, alterações epigenéticas como os padrões aberrantes de metilação de DNA foram associadas a oncogênese. Padrões específicos de metilação do DNA foram identificados e associados a fatores de transcrição mutados como o PML/RARa em pacientes com LMA. Sendo assim, a questão é determinar se a transformação maligna do câncer está diretamente associada a um padrão aberrante de metilação de DNA ou se a metilação anômala do DNA ocorre em um estágio mais tardio da doença, como contribuição secundária. Estudos mais recentes buscam a identificação não apenas das driver mutations, mas também das vias e mecanismos de progressão da doença, os quais elas estejam envolvidas. A tecnologia de next generation sequencing (NGS) ou sequenciamento de alto desempenho tem contribuído de forma expressiva para a identificação de padrões oncogênicos. Desta forma, este trabalho visa a análise comparativa do transcriptoma, do exoma completo e dos padrões de metilação ao longo do DNA de pacientes com LPA no momento do diagnóstico, em remissão completa e na recidiva da doença pela metodologia de NGS, de forma a contribuir para o esclarecimento sobre o papel das mutações adicionais e das alterações epigenéticas associadas à progressão desta leucemia.

O reconhecimento de que pacientes desenvolvem imunossupressão no pós-sepse tem elevado o interesse acerca desse fenômeno. Recentemente, foi demonstrado o papel crucial de linfócitos T reguladores (Tregs), assim como de citocinas antiinflamatórias e ativação alternativa de macrófagos. Nessa fase pode ocorrer expansão de tumores, possivelmente piorando o desfecho de pacientes com câncer que desenvolvem sepse. Macrófagos associados ao tumor (TAM) são peças-chave na orquestração de escapes imunológicos e promoção de crescimento tumoral, sendo preditor de mau prognóstico em muitos tipos de câncer. Nossa hipótese é de que pode haver expansão tumoral no pós-sepse por mecanismo dependente de maior infiltração por TAM. Para testar essa hipótese, induziremos sepse através de modelo de ligadura e punção cecal em camundongos C57. No 15º dia após o procedimento, animais sobreviventes ou naïve serão inoculados por via subcutânea com inóculos de melanoma B16- F10-luc. O crescimento tumoral será avaliado por medição do volume tumoral e bioluminescência. No D21 após a inoculação em animais pós-sepse ou naïve, macrófagos tumorais serão isolados para extração de RNA e análise de expressão gênica por microarranjo. Genes representativos diferencialmente expressos serão confirmados por RT-PCR. Adicionalmente, realizaremos co-inoculação de macrófagos indiferenciados derivados de medula óssea de animais pós-sepse ou naïve com células tumorais para avaliar a participação de macrófagos do pós-sepse na possível expansão tumoral. Os dados serão analisados no programa GraphPad Prism 3.0. Serão consideradas estatisticamente significantes diferenças de P<0,05

A leucemia promielocítica aguda (LPA) é um subtipo de leucemia mielóide aguda (LMA), caracterizada pela presença de infiltrado de células leucêmicas na medula óssea (MO) e sangue periférico, semelhantes à promielócitos. Em mais de 98% dos casos a LPA está associada à translocação t(15;17)(q22;q21), envolvendo o gene receptor ± do acido retinóico (RARA) no cromossomo 17, translocado e fundido com o gene da leucemia promielocítica (PML) no cromossomo 15. A associação da patogênese dessa leucemia com o gene PML/RARa foi demonstrada em modelos murinos, uma vez que 10% dos animais que expressam a proteína de fusão desenvolvem doença semelhante à LPA em humanos. No entanto, a latência prolongada da doença sugere que a presença do gene PML/RARa não é suficiente para desencadear a transformação maligna completa e que fatores genéticos adicionais são necessários para a progressão da doença. O principal avanço no tratamento da LPA foi a demonstração de que o ATRA promove a diferenciação celular, sendo este o primeiro exemplo de terapia de indução da diferenciação em casos de câncer, com elevada taxa de cura. Entretanto, aproximadamente 20-30% dos pacientes tratados evoluem para a recaída da doença. A presença de mutações em genes como o FLT3 e a desregulação na via de sinalização do CEBP/A têm sido descritos como fatores adicionais na leucemogênese induzida pelo rearranjo PML/RARa. Diferentes estudos correlacionaram padrões de mutações que se repetem com elevada frequência com a ocorrência de diversos tipos de câncer, sendo denominadas driver mutations. Além das mutações genéticas, alterações epigenéticas como os padrões aberrantes de metilação de DNA foram associadas a oncogênese. Padrões específicos de metilação do DNA foram identificados e associados a fatores de transcrição mutados como o PML/RARa em pacientes com LMA. Sendo assim, a questão é determinar se a transformação maligna do câncer está diretamente associada a um padrão aberrante de metilação de DNA ou se a metilação anômala do DNA ocorre em um estágio mais tardio da doença, como contribuição secundária. Estudos mais recentes buscam a identificação não apenas das driver mutations, mas também das vias e mecanismos de progressão da doença, os quais elas estejam envolvidas. A tecnologia de next generation sequencing (NGS) ou sequenciamento de alto desempenho tem contribuído de forma expressiva para a identificação de padrões oncogênicos. Desta forma, este trabalho visa a análise comparativa do transcriptoma, do exoma completo e dos padrões de metilação ao longo do DNA de pacientes com LPA no momento do diagnóstico, em remissão completa e na recidiva da doença pela metodologia de NGS, de forma a contribuir para o esclarecimento sobre o papel das mutações adicionais e das alterações epigenéticas associadas à progressão desta leucemia.

A disceratose congênita (DC) é uma síndrome hereditária rara, caracterizada por manifestações mucocutâneas, insuficiência medular e uma maior predisposição a tumores. A DC ligada ao X (DC-X) é a principal forma de apresentação desta síndrome e encontra-se invariavelmente associada com mutações pontuais no gene DKC1, o qual codifica para discerina; esta pode atuar como uma pseudouridina sintetase, responsável por modificações pós-transcricionais dos RNA ribossômicos (rRNA), por meio da conversão catalítica de uridina (U) em pseudouridina (¨). Estudos recentes mostraram que defeitos na pseudouridilação de RNA ribossomais podem comprometer a tradução IRES dependente de RNAm específicos, levando a uma expressão desbalanceada de proteínas responsáveis por processos celulares distintos como apoptose, quiescência e diferenciação celular. Ruggero et al. demonstraram que camundongos hipomórficos para o gene Dkc1 desenvolvem pancitopenia associada com uma hipoceluridade da medula óssea e predisposição ao câncer. Contudo, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na falha na hematopoiese ainda não estão totalmente esclarecidos. Por meio de análise proteômica quantitativa in vivo utilizando marcação isotópica de aminoácidos específicos (SILAC) e ensaios competitivos de transplante de progenitores hematopoiéticos, o presente trabalho tem como objetivo identificar proteínas envolvidas no processo de falência medular e cuja expressão/função estejam alteradas em consequência da hipoexpressão da discerina.

Glioblastoma é o mais comum e agressivo dos tumores encefálicos primários. Apesar dos avanços tecnológicos no procedimento cirúrgico, seguidos por tratamentos de radio e quimioterapia a média de sobrevida dos pacientes é de 12 a 15 meses. Este tipo de tumor exibe elevada heterogeneidade celular, com alterações genéticas complexas que refletem em alta instabilidade genômica e apresentam implacável progressão maligna, caracterizada por difusão e invasão através do cérebro, resistência aos tradicionais e aos novos alvos terapêuticos e destruição do tecido encefálico normal. Um fator importante para a progressão tumoral é a acidificação do ambiente que é promovida pelas anidrases carbônicas (CAs) 9 e 12, que direcionam para a aquisição de fenótipo metastático e de quimioresistência a drogas anticâncer. Esses processos podem ser revertidos por inibidores específicos de CAs. E7070, uma sulfonamida impermeável à membrana, é uma nova droga para o tratamento de câncer, com potente inibição destas enzimas. Exibe atividade in vitro e in vivo e impede a progressão do ciclo celular em células tumorais. Um melhor entendimento dos complexos mecanismos, moleculares e celulares, que direcionam para a progressão tumoral é importante pré-requisito para a identificação de novas e mais efetivas estratégias terapêuticas, com intuito de melhorar a sobrevida dos pacientes. Desse modo, no presente projeto propomos estudar a expressão e os efeitos in vitro da inibição da via das CAs 9/12 pelo E7070 (isoladamente ou em combinação com os tratamentos atualmente utilizados) na quimioresistência, invasão, proliferação e apoptose de linhagens celulares e células tronco SSEA-1+ submetidas à hipóxia.