Márcio Mateus Beloti.

Curso com o objetivo de integrar alunos de pós-graduação e de iniciação científica em torno de conhecimentos de biologia oral.

O curso visa estabelecer vínculo colaborativo de pesquisa entre pós-graduandos e alunos de IC no contexto de projetos de Biologia Oral.

Curso oferecido a graduandos e recém-formado com o objetivo de apresentar os programas de pós-graduação envolvidos e suas linhas de pesquisa.

A proteína engrailed 1 (EN1) pertence à classe de fatores de transcrição com domínio de ligação ao DNA (homeobox) e alterações em sua expressão levam a anormalidades em termos de desenvolvimento e ossificação do esterno, falanges e ossos do crânio. Considerando que En1 tem participação relevante na osteogênese, estabelecemos a hipótese de que essa proteína atua em mecanismos moleculares e celulares que impactam o crescimento esquelético, a regeneração óssea e a osseointegração de implantes de titânio (Ti). Trata-se de proposta original, uma vez que En1 ainda não foi explorada na regeneração óssea e no estabelecimento da interface osso-implante, especialmente com perda e ganho de função de En1 sintetizada por osteoblastos e osteócitos. Nesse contexto, o objetivo geral desse é estudo é investigar a participação de En1 na diferenciação de células ósseas, crescimento esquelético, regeneração óssea e osseointegração de implantes de Ti. O projeto é composto por quatro subprojetos que, no total, têm onze objetivos específicos, apresentados a seguir. Subprojeto 1: Caracterização da expressão e efeitos de En1 em células-tronco mesenquimais (MSCs) e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos 1. Caracterizar a expressão de En1 em MSCs e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos. 2. Investigar os efeitos do silenciamento e da superexpressão de En1 em MSCs e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos. 3. Investigar os mecanismos celulares, com foco em fator de crescimento de fibroblastos, Wnt, fator de crescimento transformante beta e regulação epigenética, envolvidos nos efeitos de En1 em MSCs e na diferenciação de osteoblastos e osteócitos. Subprojeto 2: Avaliação da participação de En1 expressa por osteoblastos e osteócitos no crescimento esquelético de camundongos 4. Gerar duas linhagens de camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. 5. Avaliar os efeitos da deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos sobre o crescimento esquelético de camundongos. Subprojeto 3: Avaliação da participação de En1 expressa por osteoblastos e osteócitos na regeneração óssea 6. Avaliar a regeneração óssea em defeitos não-críticos de calvárias de camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. 7. Investigar os efeitos de MSCs injetadas em defeitos críticos de calvárias de camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. 8. Investigar os efeitos de MSCs com silenciamento e superexpressão de En1 injetadas em defeitos críticos de calvárias de camundongos. Subprojeto 4: Avaliação da participação de En1 expresso por osteoblastos e osteócitos na osseointegração de implantes de Ti 9. Caracterizar a expressão de En1 na diferenciação de osteoblastos e osteócitos crescidos sobre Ti com nanotopografia. 10. Investigar os efeitos do silenciamento e da superexpressão de En1 na diferenciação de osteoblastos e osteócitos crescidos sobre Ti com nanotopografia. 11. Avaliar a osseointegração de implantes de Ti com nanotopografia em camundongos com deleção de En1 em osteoblastos e osteócitos. Os quatro subprojetos abordarão desde a caracterização da expressão de En1 por células ósseas até sua participação em processos de osteogênese, utilizando ferramentas avançadas de biologia molecular e celular e geração de modelos animais geneticamente modificados. Nesse cenário, vislumbramos contribuir para o entendimento dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos nos efeitos de En1 sobre o tecido ósseo e o estabelecimento de novos tratamentos para promover a regeneração óssea e a osseointegração em sítios desafiadores, com aplicações nas áreas de Cirurgia Buco-Maxilo-Facial, Periodontia, Implantodontia e Ortopedia.

A manutenção da forma e função do tecido ósseo requer a participação de diversas moléculas que regulam o processo de remodelação óssea. O conhecimento de tais moléculas e seu papel nesse processo é essencial para elucidar a patogênese de inúmeras doenças que afetam o tecido ósseo e possibilitar a descoberta de possíveis alvos terapêuticos. Uma dessas moléculas é a proteína de matriz extracelular agrin (AGRN), com participação comprovada no desenvolvimento esquelético, sendo expressa por condrócitos, osteócitos, osteoblastos e células-tronco mesenquimais (MSCs). Resultados recentes do nosso grupo indicam que a deleção de Agrn em osteócitos pode afetar o desenvolvimento do tecido ósseo de camundongos machos, mas não de fêmeas. Sabe-se também que interações entre MSCs e osteócitos são importantes para a manutenção da homeostase óssea e que alterações de funcionamento dos osteócitos contribuem para o aparecimento da osteoporose. Com base nesses achados, os objetivos desse estudo são avaliar os efeitos da deleção condicional de Agrn em osteócitos de camundongos com osteoporose sobre (1) parâmetros morfométricos, mecânicos e químicos do tecido ósseo, (2) reparo ósseo de defeitos criados em calvárias, e (3) potencial osteogênico e expressão de Agrn e seus alvos em MSCs derivadas da medula óssea. Os resultados desse estudo podem ser científica e terapeuticamente relevantes, uma vez que AGRN pode ser alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que favoreçam eventos relacionados à osteogênese, com aplicações no tratamento de defeitos ósseos em sítios desafiadores e da perda óssea induzida por doenças metabólicas como a osteoporose.

A depressão é uma desordem mental crônica que afeta mais de 300 milhões de pessoas no mundo. Durante episódios de depressão, o indivíduo tem sentimentos de tristeza, irritabilidade e vazio, e perda de interesse em executar suas atividades. Também tem sido relacionada à depressão a redução da densidade mineral óssea, com aumento do risco de fraturas. Assim, os efeitos da depressão sobre osteoblastos, osteoclastos e principalmente sobre a interação entre essas células são relevantes, uma vez que podem prejudicar os resultados de tratamentos para reparar defeitos ósseos. Com base nisso, estabelecemos a hipótese de que o isolamento social, um modelo de depressão em ratos, impacta negativamente osteoblastos, osteoclastos, sua interação e reparo ósseo induzido por terapia celular. Para testar essa hipótese, os efeitos do isolamento social sobre diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (MSCs), diferenciação osteoclástica de monócitos, interação osteoblasto-osteoclasto e reparo ósseo induzido por MSCs serão avaliados. Como não há estudos comparando os efeitos do isolamento social no tecido ósseo de ratos e ratas, esta avaliação será realizada e o gênero que apresentar maiores alterações do tecido ósseo será selecionado para a continuidade do desenvolvimento do projeto. O isolamento social será realizado mantendo 1 animal por caixa e animais controles serão mantidos 3 por caixa, por 10 semanas. Ao final de 10 semanas, os animais serão submetidos ao teste do nado forçado e amostras de sangue serão coletadas para a quantificação de cortisol por ELISA, parâmetros indicados para confirmar a eficácia desse modelo de depressão. Em seguida, o tecido ósseo de fêmures, vértebras e calvárias será submetido às análises microtomográfica e histológica. As etapas seguintes do projeto serão realizadas com animais do gênero no qual o tecido ósseo apresentar maiores alterações em função do isolamento social. MSCs e monócitos derivados da medula óssea desses animais serão cultivados em meio osteogênico e osteoclastogênico, respectivamente, e marcadores genotípicos e fenotípicos de osteoblastos e osteoclastos serão avaliados. A interação entre osteoblastos e osteoclastos será investigada em modelo de cocultura indireta. MSCs serão injetadas em defeitos criados em calvárias de ratos controles ou submetidos ao isolamento social e o tecido ósseo formado será avaliado por análises microtomográfica e histológica. Nossos resultados poderão contribuir para o desenvolvimento de novas terapias para tratar defeitos ósseos de pacientes acometidos por desordens mentais, com aplicações na cirurgia buco-maxilo-facial, implantodontia, periodontia e ortopedia, o que geraria melhora na qualidade de vida de uma parcela importante da população.

A terapia celular utilizando células-tronco derivadas de diversos tecidos do organismo tem sido alvo de investigações científicas como alternativa promissora para o tratamento de defeitos ósseos. As células-tronco embrionárias têm alta plasticidade e grande potencial de autorrenovação, o que aumenta sua capacidade de se diferenciar em células de todos os tecidos do organismo, exceto os anexos embrionários. Para minimizar aspectos imunológicos e questões éticas e religiosas relacionadas ao uso de células embrionárias, células pluripotentes induzidas (iPSs), obtidas a partir da reprogramação genética de células somáticas, têm potencial para serem empregadas terapeuticamente com o objetivo de reparar diversos tecidos, incluindo o osso. O processo de formação óssea é regulado por inúmeras moléculas e vias de sinalização, incluindo a proteína engrailed-1 (EN1), um fator de transcrição que participa da regulação do desenvolvimento craniofacial, que é ainda pouco estudada no contexto do tecido ósseo, especialmente no reparo ósseo. Sendo assim, elaboramos a seguinte hipótese: EN1 participa da diferenciação osteoblástica de iPSs e do reparo do tecido ósseo induzido por essas células. Para testar essa hipótese, este projeto têm os seguintes objetivos: 1) caracterizar a expressão de En1 em iPSs durante a diferenciação osteoblástica, 2) avaliar in vitro o efeito da superexpressão e do silenciamento de En1 mediados por CRISPR/Cas9 sobre a diferenciação osteoblástica de iPSs e 3) avaliar in vivo o efeito de iPSs com superexpressão e silenciamento de En1 mediados por CRISPR/Cas9 no reparo do tecido ósseo em defeitos criados em calvárias de camundongos. Os resultados obtidos com a execução desse projeto serão científica e terapeuticamente relevantes, uma vez que EN1 pode ser uma proteína alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que favoreçam a regeneração óssea, regulando eventos relacionados à osteogênese.

A terapia celular é uma das estratégias da medicina regenerativa que se mostra promissora para o tratamento de defeitos ósseos extensos utilizando, principalmente, células-tronco mesenquimais (MSCs, abreviação do Inglês, mesenchymal stem cells) e o estudo de moléculas que atuam nessas células para favorecer a regeneração óssea é relevante nesse contexto. Dentre essas moléculas, a proteína de matriz extracelular agrin, envolvida em vários processos biológicos, foi detectada em condrócitos e demonstrada sua participação no desenvolvimento do sistema esquelético. No entanto, até o momento, há pouca informação na literatura acerca dos efeitos de agrin na diferenciação osteoblástica de MSCs e na formação óssea por elas induzida, assim como das vias de sinalização celular envolvidas nesses efeitos. Portanto, os objetivos desse estudo são investigar: (1) in vitro o efeito da sobre-expressão e do silenciamento de agrin por CRISPR/Cas9 sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs, (2) in vitro a participação das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz no efeito de agrin sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs e (3) in vivo o efeito de MSCs com sobre-expressão e silenciamento de agrin por CRISPR/Cas9 sobre a regeneração do tecido ósseo em defeitos criados em calvárias de camundongos. Os resultados desse estudo poderão gerar dados importantes acerca da função de agrin no tecido ósseo e, possivelmente, para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas em situações clínicas que envolvem a regeneração óssea.

Osteócitos são as células mais abundantes do tecido ósseo e essenciais para o funcionamento do esqueleto. Derivados da linhagem osteoprogenitora e com morfologia dendrítica, os osteócitos são envolvidos pela matriz mineralizada durante o processo de formação óssea. Uma de suas funções é regular a atividade de osteoblastos e osteoclastos através da secreção de fatores que modulam várias vias de sinalização, contribuindo assim para a homeostase óssea e também para a osseointegração de implantes de titânio (Ti). Dessa forma, o estudo de moléculas que possam favorecer estes processos se torna fundamental no contexto da biologia óssea. Nosso grupo de pesquisa mostrou que a proteína de matriz extracelular Agrin participa da diferenciação osteoblástica e que a superfície de Ti com nanotopografia possui efeito osteoindutivo. No entanto, a expressão de Agrin por osteócitos e sua participação na formação óssea e osseointegração de implantes de Ti com nanotopografia não foram ainda investigadas. Portanto, o objetivo desse estudo é investigar a expressão de Agrin por osteócitos e seus efeitos na diferenciação dessas células, na formação de tecido ósseo durante o desenvolvimento esquelético e na osseointegração de implantes de Ti com nanotopografia. Para isso, serão avaliados: 1) in vitro a participação do Agrin na diferenciação de osteócitos, utilizando células da linhagem osteocítica Ocy454, e o envolvimento das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz; 2) in vivo a participação do Agrin expresso por osteócitos na formação óssea durante o desenvolvimento esquelético, utilizando camundongos geneticamente modificados com deleção condicional da expressão de Agrin em osteócitos; 3) in vitro a participação do Agrin na interação entre células da linhagem osteocítica Ocy454 e Ti com nanotopografia, comparado ao Ti controle, e o envolvimento das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz.; e 4) in vivo a participação do Agrin expresso por osteócitos na osseointegração de implante de Ti com nanotopografia, comparado ao implante de Ti controle, utilizando implantes instalados na cavidade bucal de camundongos geneticamente modificados com deleção condicional da expressão de Agrin em osteócitos. Como o papel do Agrin na atividade de osteócitos e os mecanismos envolvidos ainda são desconhecidos, os resultados obtidos com a execução desse projeto serão cientíica e terapeuticamente importantes, pois a Agrin pode ser uma proteína alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que envolvem a remodelação óssea mediada por osteócitos e que favoreçam os eventos relacionados ao processo de osseointegração.

A terapia celular utilizando células-tronco mesenquimais (MSCs) é uma estratégia promissora para o tratamento de defeitos ósseos extensos e o estudo de moléculas que atuam nessas células para favorecer a regeneração óssea é relevante nesse contexto. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a proteína da matriz extracelular agrin participa da diferenciação osteoblástica, com possível modulação das vias de BMPs e Wnt, indicando que ela pode também atuar em outras vias envolvidas nesse processo. No entanto, até o momento, não há na literatura informação acerca dos efeitos de agrin na formação óssea induzida por MSCs derivadas de tecido adiposo, células com potencial para diferenciação osteoblástica e adipocítica. Assim, nós estabelecemos as seguintes hipóteses: 1) a sobre-expressão de agrin aumenta o potencial osteogênico e reduz o potencial adipogênico de MSCs derivadas de tecido adiposo por modular as vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz e 2) MSCs derivadas de tecido adiposo sobre-expressando agrin favorecem a regeneração do tecido ósseo. Para testar essas hipóteses, serão avaliados: 1) a expressão de agrin durante a diferenciação osteoblástica e adipocítica de MSCs, 2) o efeito da sobre-expressão de agrin na diferenciação osteoblástica e adipocítica de MSCs, 3) a participação das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz no efeito de agrin sobre a diferenciação osteoblástica e adipocítica de MSCs e 4) o efeito de MSCs com sobre-expressão de agrin na regeneração do tecido ósseo em defeitos criados em calvárias de camundongos. Os dados gerados por este estudo poderão contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a regeneração óssea.

A terapia celular utilizando células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas de medula óssea tem sido alvo de investigações científicas nos campos da Odontologia e Medicina por ser uma alternativa promissora para tratamento de defeitos ósseos. As proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) são citocinas pertencentes à família do fator de crescimento transformante beta (TGF-beta) e estão envolvidas em diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação osteoblástica e a osteogênese. Dentre as diversas BMPs identificadas, a BMP-9 é considerada uma das mais osteogênicas. Dados preliminares do nosso grupo de pesquisa mostram que CTMs de medula óssea de camundongos, geneticamente editadas para superexpressar BMP-9 (CTMsBMP-9), injetadas em defeitos de calvária de ratos aumentam a formação óssea comparadas a CTMs não modificadas. Esses resultados podem ser explicados, ao menos em parte, pelo fato de que as CTMsBMP-9 secretam moléculas bioativas que estimulam as células presentes na região de interesse e que são secretadas para o meio de cultura quando essas células são cultivadas. Nesse contexto, os objetivos do presente projeto são: (1) caracterizar os meios condicionado por CTMsBMP-9 quanto à presença de citocinas, fatores de crescimento e proteases, (2) avaliar o efeito do meio condicionado por CTMsBMP-9 sobre a migração e proliferação celulares, e a diferenciação osteoblástica de CTMs derivadas de medula óssea de camundongos e (3) avaliar o efeito do meio condicionado por CTMsBMP-9 sobre a regeneração óssea em defeitos criados em calvária de camundongos. Os dados quantitativos serão submetidos ao teste de aderência à curva normal para determinar o teste estatístico adequado a ser aplicado e o nível de significância será de 5.

Vesículas extracelulares (VEs) têm sido relacionadas a uma ampla gama de funções em desenvolvimento na imunologia, angiogênese e biologia de células-tronco, bem como à diversas patologias. As VEs são organelas bioativas que podem transportar informações genéticas, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos entre as células, influenciando assim sobre diversas funções moleculares, como na sinalização e regulação da expressão gênica das células-alvo. Uma classe especial de VEs chamadas Vesículas da Matriz (MVs) são protagonistas em uma das teorias mais aceitas para a formação dos primeiros cristais de hidroxiapatita e propagação mineral para a formação óssea em vertebrados. Porém, ainda existem impotantes lacunas nesta teoria que necessitam ser investigadas, como: Qual o papel efetivo das vesículas no processo? Qual o papel das proteínas/enzimas que as compõem? Como as interações entre o colágeno e as proteínas/enzimas presentes nas vesículas podem ser responsáveis pela nucleação e consequente propagação da mineralização? Como estas interações regulam o processo de mineralização mediado por MVs? Como o pH e fosfo-substratos influenciam na formação e propagação dos cristais de hidroxiapatita mediados por MVs? Mediante tais questionamentos, o presente projeto visa isolar VEs com qualidade e quantidade suficiente para entender a natureza das interações entre vesículas nativas e proteínas osteogênicas. Modelos de membrana como proteolipossomos e monocamadas de Langmuir enriquecidos com proteínas importantes no processo de mineralização servirão para determinar em detalhes os mecanismos de formação de apatita e a função dessas proteínas durante o processo. O projeto é inovador e interdisciplinar, tendo como proponente e colaboradores pesquisadores das áreas de bioquímica, físico-química, farmácia e odontologia. Desta forma, será abrangido desde o estado da arte biofísica (reologia, fluidez), metodologias de instrumentos (Microscopia de força atômica acoplada a espectroscopia Raman aumentada por ponta (AFM-Tip Enhanced Raman Spectroscopy), microscopia TEM, BAM, microanálises de raios-X por energia dispersiva, RAMAN e SPR), metodologias bioquímicas (isolamento e caracterização de VEs nativas, produção de proteínas recombinantes), biologia celular (condrócitos primários, osteoblastos e osteoclastos), até funções e aplicações das VEs in vitro e in vivo utilizando sistemas miméticos de proteolipossomos na área de regeneração óssea. Detalhes altamente resolvidos sobre a natureza das interações entre VEs nativas ou proteolipossomos com proteínas importantes no processo de biomineralização poderão ser obtidos. A proposta de pesquisa fornecerá informações detalhadas de capacidade de mineralização das VEs, detalhando sua capacidade de nucleação, propagação, regeneração e ainda degradação (reabsorção). Outro ponto muito forte da proposta de pesquisa é o desenvolvimento de abordagens metodológicas que podem ser generalizadas para investigações de VEs. Poucos laboratórios no mundo focam suas pesquisas no descobrimento das funções dessas vesículas, tornando a proposta de pesquisa muito original. Vesículas modelo e nativas apresentam um grande potencial biotecnológico e poderão ser utilizadas para selecionar inibidores com o intuito de prevenir a calcificação patológica, bem como propiciar a regeneração/reabsorção óssea.

A manutenção da osseointegração de implantes de titânio (Ti) baseia-se na remodelação óssea, que compreende um equilíbrio entre a formação de tecido ósseo por osteoblastos e a atividade de reabsorção desse tecido por osteoclastos. Nosso grupo mostrou que a superfície de Ti com nanotopografia obtida através de condicionamento químico com solução de H2SO4/H2O2 é capaz de induzir a diferenciação osteoblástica tanto em condições osteogênicas como não-osteogênicas. No entanto, o efeito dessa superfície sobre a diferenciação e atividade de osteoclastos, e sobre a interação dos mesmos com células osteoblásticas ainda não foram investigados. Nesse contexto, nós elaboramos a hipótese de que a nanotopografia, além de favorecer a diferenciação osteoblástica, modula a interação osteoblasto/osteoclasto, inibindo a diferenciação osteoclástica. Portanto, o objetivo desse estudo é determinar a influência da superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti usinada (controle), sobre a interação entre células osteoblásticas e osteoclásticas. Para isso, avaliaremos: (1) o efeito da superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a diferenciação osteoblástica e sobre a formação e a atividade osteoclástica em culturas isoladas de células da linhagem MC3T3-E1 e RAW 264.7, respectivamente, crescidas sobre essas superfícies; (2) o efeito de células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 sobre a formação e atividade osteoclástica de células da linhagem RAW 264.7 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, em modelos de co-cultura indireta; (3) o efeito de células osteoclásticas da linhagem RAW 264.7 sobre a diferenciação osteoblástica de células da linhagem MC3T3-E1 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, em modelos de co-cultura indireta; (4) o efeito do meio condicionado por células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a formação e atividade osteoclástica de células da linhagem RAW 264.7, e (5) o efeito do meio condicionado por células osteoclásticas da linhagem RAW 264.7 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a diferenciação osteoblástica de células da linhagem MC3T3-E1.

A terapia celular tem sido proposta como uma estratégia para o tratamento de defeitos ósseos, constituindo uma abordagem de interesse para a Odontologia e a Medicina. Dentre os diferentes tipos celulares que podem ser empregados, as células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (CTM-TA) surgem como uma alternativa pela sua facilidade de obtenção associada à menor morbidade, comparadas às células derivadas da medula óssea (CTM-MO). Contudo, às CTM-TA têm sido atribuído menor potencial osteogênico. Resultados prévios evidenciaram a diminuição da diferenciação osteoblástica induzida pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF-) liberado por adipócitos. Assim, nossa hipótese é que o TNF- produzido e liberado pelas CTM-TA tenha efeito inibitório na diferenciação osteoblástica destas células. Nesse contexto, o objetivo do presente projeto é investigar o papel do TNF- endógeno no potencial osteogênico das CTM-TA. Ratos Wistar serão utilizados para obtenção de CTM-TA, que serão avaliadas quanto a expressão temporal gênica e proteica de TNF- e seus receptores TNFR1A e TNFR1B. Em seguida, as CTM-TA serão transfectadas com clones de shRNA para os receptores isoladamente ou associados e avaliadas com relação à diferenciação osteoblástica por: 1) expressão dos genes fosfatase alcalina (ALP), RUNX2, osteopontina (OPN) e osteocalcina (OC); 2) atividade de ALP e 3) produção de matriz extracelular mineralizada. Como parâmetro para a diferenciação osteoblástica, serão utilizadas CTMs-MO obtidas dos mesmos animais. Para avaliar o efeito do silenciamento de TNF- no reparo ósseo, as CTM-TA silenciadas que apresentarem resultados mais evidentes em termos de diferenciação osteoblástica, serão injetadas em defeitos ósseos criados em calvárias de ratos e o reparo avaliado após 4 semanas por meio de microtomografia computadorizada e análise histológica. Os resultados desse estudo podem contribuir para o entendimento dos mecanismos intracelulares envolvidos na diferenciação e atividade de células osteoblásticas derivadas de CTM-TA, e contribuir na aplicação e o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento envolvendo terapia celular na regeneração óssea.

A osteogênese é um evento biológico caracterizado por etapas altamente dependentes de vias de sinalização celular, incluindo as vias Hedgehog e Notch que atuam na diferenciação osteoblástica. Dessa forma, a modulação dessas vias de sinalização através do uso de drogas agonistas e antagonistas pode gerar dados relevantes para terapias relacionadas ao tecido ósseo na odontologia, como o uso de implantes de titânio (Ti) osseointegráveis. Sabe-se que superfícies de Ti com nanotopografia favorecem a diferenciação osteoblástica e a mineralização da matriz extracelular; no entanto, os mecanismos celulares envolvidos nesses efeitos não são completamente entendidos. Nesse contexto, nós elaboramos a hipótese de que as vias Hedgehog e Notch estão envolvidas com o potencial osteogênico de superfícies de Ti nanoestruturadas. Assim, o objetivo deste projeto é investigar a participação das vias de sinalização Hedgehog e Notch na diferenciação osteoblástica induzida por superfície de Ti com nanotopografia (Ti-Nano), comparada à superfície de Ti-Usinada. Células osteoblásticas derivadas da calvária de ratos serão cultivadas sobre poliestireno na presença de três concentrações de fármacos agonistas e antagonistas das vias Hedgehog e Notch, purmorfamina e ciclopamina, bexaroteno e DAPT, respetivamente, e do veículo. As concentrações de cada fármaco com efeito mais pronunciado sobre as células serão selecionadas com base nas seguintes avaliações: (1) expressão gênica de marcadores ósseos, por PCR em tempo real, (2) atividade de fosfatase alcalina (ALP) e (3) formação de matriz extracelular mineralizada. Em seguida, células osteoblásticas serão cultivadas sobre discos de Ti-Nano e Ti-Usinado e serão avaliadas: (1) expressão gênica de marcadores ósseos e componentes envolvidos nas vias Hedgehog e Notch, por PCR em tempo real, (2) expressão de proteínas envolvidas nas vias de sinalização Hedgehog e Notch, e marcadores ósseos por Western blot, (3) atividade ALP e (4) formação de matriz extracelular mineralizada. Por fim, células osteoblásticas serão cultivadas sobre as duas superfícies de Ti na presença dos agonistas e antagonistas, nas concentrações previamente selecionadas, para investigarmos o efeito da ativação e inibição das vias de sinalização Hedgehog e Notch no potencial osteogênico do Ti-Nano comparado ao Ti-Usinado, avaliando os mesmos parâmetros celulares mencionados acima. Os resultados desse estudo poderão contribuir para o entendimento dos mecanismos celulares envolvidos na interação entre tecido ósseo e implantes de Ti nanoestruturados e consequentemente para o desenvolvimento de novas estratégias combinando vias de sinalização e topografias de superfície que favoreçam os eventos relacionados ao processo de osseointegração.

O osso é um tecido com grande capacidade de regeneração, mas em algumas situações a extensão da injúria impede o reparo do tecido. Nesse cenário, a terapia celular utilizando células-tronco mesenquimais (do Inglês, mesenchymal stem cells - MSCs) tem atraído a atenção de diversos grupos de pesquisa por ser uma alternativa promissora em relação aos tratamentos existentes. No entanto, diversos aspectos moleculares, celulares e teciduais, ainda não abordados na literatura, necessitam ser investigados para tornar essa terapia um tratamento efetivo para a regeneração de defeitos ósseos em pacientes saudáveis ou acometidos por doenças sistêmicas que afetam o processo de reparo ósseo, como a osteoporose, a diabetes mellitus e a hipertensão. Nesse contexto, o presente projeto é composto por três subprojetos, cujos objetivos são: (1) investigar o potencial de MSCs derivadas de medula óssea (do Inglês, bone marrow - BM-MSCs) e de tecido adiposo (do Inglês, adipose tissue - AT-MSCs), tratadas com fator de crescimento do endotélio vascular A (do Inglês, vascular endothelial growth fator A - VEGF-A) e/ou proteína óssea morfogenética 9 (do Inglês, bone morphogenetic protein 9 - BMP-9) para regenerar o tecido ósseo; (2) investigar o potencial dessas MSCs modificadas geneticamente para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9 para regenerar o tecido ósseo e (3) avaliar a influência de BM-MSCs obtidas de ratos saudáveis sobre a diferenciação osteoblástica de BM-MSCs obtidas de ratos osteoporóticos, diabéticos e hipertensos. Para o desenvolvimento dos subprojetos 1 e 2, BM-MSCs e AT-MSCs serão tratadas com VEGF-A e/ou BMP-9 ou modificadas geneticamente utilizando agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente interespaçadas (CRISPR-Cas9) para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9. Essas células serão caracterizadas in vitro quanto ao potencial angiogênico e osteogênico e à expressão gênica e proteica em larga escala. Para a regeneração do tecido ósseo, as BM-MSCs e AT-MSCs associadas ao VEGF-A e/ou BMP-9 ou modificadas para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9 serão injetadas diretamente em defeitos criados em calvárias de ratos. Inicialmente, o tempo de permanência das células nos defeitos ósseos será avaliado por luminescência, utilizando a injeção de células transfectadas com luciferase. Por até 4 semanas após a injeção de células, a progressão da formação de vasos sanguíneos e de tecido ósseo será avaliada por microtomografia computadorizada (micro-CT) in vivo. Ao final de 4 semanas, os animais serão eutanasiados e as amostras serão avaliadas por análise histológica. No subprojeto 3, será avaliada a influência de BM-MSCs obtidas de ratos saudáveis sobre a diferenciação osteoblástica de BM-MSCs obtidas de ratos osteoporóticos, diabéticos e hipertensos utilizando um modelo de co-cultura indireta. Trata-se de estudo in vitro, cujos resultados, poderão gerar desdobramentos durante o desenvolvimento do presente projeto, com vistas à aplicação das terapias abordadas nos subprojetos 1 e 2 para a investigação da regeneração óssea nos modelos de patologias abordados no subprojeto 3.

As proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) são citocinas pertencentes à família do fator de crescimento transformante beta (TGF-β) e estão envolvidas em diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação osteoblástica e a formação óssea, eventos diretamente relacionados ao processo de osseointegração de implantes de titânio (Ti). Sabe-se que superfícies de Ti com nanotopografia favorecem a mineralização da matriz extracelular; no entanto, os mecanismos celulares envolvidos não são completamente entendidos. Neste contexto, nós elaboramos a hipótese de que as BMPs endógenas, especificamente as BMP-2/4, sabidamente osteogênicas, exercem função importante nas respostas de osteoblastos a superfícies de Ti nanoestruturadas. Previamente ao teste da hipótese, células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 serão cultivadas para avaliar: (1) a expressão gênica e proteica das BMP-2/4 em culturas crescidas sobre poliestireno, por Real-time PCR e ELISA; (2) a eficácia dos silenciadores (shRNA) para BMPR1A, Smad-4, Smad-6, Smurf-1 e Smurf 2 em silenciar a expressão das respectivas proteínas, todas envolvidas nas vias de sinalização das BMP-2/4, em culturas crescidas sobre poliestireno, por Western blot; e (3) o efeito dos silenciadores sobre as vias de sinalização das BMP-2/4 e sobre a expressão do fenótipo osteoblástico em culturas crescidas sobre poliestireno, por PCR-array e Western blot. Em seguida a hipótese será testada por avaliar: (1) o efeito da nanotopografia de superfície de Ti, comparada à superfície de Ti com microtopografia (controle), sobre a síntese de BMP-2/4 em culturas crescidas sobre essas superfícies, por Real-time PCR e ELISA; e (2) o efeito dos silenciadores sobre as vias de sinalização das BMP-2/4 e sobre a expressão do fenótipo osteoblástico em culturas crescidas sobre superfície de Ti com nanotopografia comparada à superfície de Ti controle, por PCR-array e Western blot. Os resultados desse estudo podem contribuir para o entendimento dos mecanismos intracelulares envolvidos nas respostas de osteoblastos a superfícies de Ti e, consequentemente, para o desenvolvimento de novas estratégias envolvendo BMPs e nanotopografia de superfície que favoreçam os eventos relacionados ao processo de osseointegração.

MicroRNAs (miRs) são pequenos RNAs funcionais, com aproximadamente 22 nucleotídeos, que não codificam proteínas e estão envolvidos em diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação osteoblástica in vitro e a formação óssea in vivo, eventos diretamente relacionados ao processo de osseointegração de implantes de titânio (Ti). Sabe-se que superfícies de Ti com nanotopografia favorecem a mineralização da matriz extracelular; no entanto, os mecanismos celulares envolvidos não são completamente entendidos. Nesse sentido, é possível especular que miRs fazem parte da maquinaria celular que regula a interação entre osteoblastos e superfícies de Ti. O objetivo do presente projeto é analisar a expressão em larga escala de miRs em células osteoblásticas crescidas sobre superfícies de Ti com nanotopografia. Células osteoblásticas diferenciadas a partir de células mesenquimais derivadas de medula óssea de humanos serão cultivadas sobre discos de Ti com e sem nanotopografia e serão avaliados os seguintes parâmetros: proliferação e viabilidade celulares; expressão gênica (RNA mensageiro – RNAm), por Real-time PCR, e proteica, por Western blot, de Runx2, fator de transcrição essencial para o estabelecimento do fenótipo osteoblástico; formação de matriz mineralizada e expressão de miRs por Microarray. Por fim, miRs que apresentarem alterações significativas de expressão na análise por Microarray, redução ou aumento de cinco vezes, quando comparadas as superfícies de Ti com e sem nanotopografia, serão submetidos à análise por Real-time PCR para a validação dos dados.

O estabelecimento dos princípios biológicos da engenharia de tecidos tem contribuído para o desenvolvimento de membranas a serem aplicadas neste tipo de terapia que, em odontologia, tem sido empregada em situações clínicas diversas como tratamentos com implantes dentários, aumento de rebordo alveolar e reparo de defeitos ósseos de origem traumática e patológica. Nosso grupo de pesquisa realizou experimentos in vitro comparando a membrana obtida pela associação do polímero de poli(vinilideno-trifluoretileno) e da cerâmica de titanato de bário (P(VDF-TrFE)/BT) à membrana de politetrafluoretileno (PTFE). Os resultados mostraram que a maioria dos parâmetros avaliados, todos envolvidos em regeneração tecidual, exibe valores favoráveis à membrana de P(VDF-TrFE)/BT para as diferentes linhagens celulares estudadas (osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos). Neste contexto, o objetivo do presente projeto é avaliar in vivo a resposta do tecido ósseo à membrana de P(VDF-TrFE)/BT e compará-la à membrana de PTFE (controle). Para isso, serão criados defeitos ósseos (5 mm de diâmetro) em calvária de ratos Wistar machos (peso 200-250 g), distribuídos em três grupos com relação à utilização ou não de membranas nos defeitos ósseos: (1) membrana de P(VDF-TrFE)/BT; (2) membrana de PTFE; (3) nenhum tipo de membrana. Ao final de 4 e 8 semanas os animais serão sacrificados e serão realizados os seguintes ensaios: (1) análise tomográfica (micro-CT) dos defeitos previamente criados; (2) análise histológica e histomorfometria com base em cortes histológicos não-descalcificados; (3) PCR em tempo real para detecção de RNAm para os marcadores ósseos, runt-related transcription fator 2 (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG), receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) e receptor activator of nuclear factor-kappa B (RANK). Estes marcadores ósseos serão também detectados em amostras de tecido ósseo retiradas da cal

A regeneração de defeitos ósseos resultantes de traumas ou processos patológicos ainda constitui um grande desafio nas áreas da Odontologia e Medicina. A utilização de células tem sido considerada bastante promissora para a regeneração do tecido ósseo e dentre os diversos tipos celulares que podem ser utilizados, as células-tronco mesenquimais, também chamadas de multipotentes estromais, têm sido as mais estudadas. Resultados bastante promissores foram relatados para o tratamento de não união crônica de fraturas e de doenças ósseas metabólicas, tais como, osteogênese imperfeita e hipofosfatasia. Várias observações têm sugerido que essas células atuariam por serem capazes de se diferenciar em diversos tipos celulares e também como um sistema de liberação de fatores de crescimento nos sítios de injúria. A partir disso, formulamos a hipótese de que a terapia celular que fizesse uso de uma associação de células indiferenciadas, como fonte de fatores de crescimento, e de osteoblastos, como formadores da matriz mineralizada, poderia ser mais eficaz para o reparo do tecido ósseo do que essas células isoladamente. Para tanto, estamos propondo avaliar: 1) in vitro os efeitos das células-tronco mesenquimais da medula óssea sobre osteoblastos diferenciados a partir dessas mesmas células; e 2) in vivo o efeito da terapia celular pela associação de células-tronco mesenquimais e osteoblastos sobre o reparo de defeitos ósseos.

Os eventos celulares e extracelulares que ocorrem durante o processo de osseointegração são bastante influenciados pelas propriedades de superfície do titânio (Ti), como morfologia, topografia e composição química. O estudo das modificações de superfície de implantes de Ti tem atraído a atenção dos pesquisadores por existir grande interesse em tratamentos que possam acelerar e/ou incrementar o processo fisiológico de reparo do tecido ósseo em contato com o Ti. Estudos recentes têm mostrado que superfícies porosas permitem o crescimento do tecido ósseo, favorecendo a integração e a estabilidade de implantes de Ti. O objetivo do presente projeto é investigar o efeito de diferentes diâmetros médios de poros de superfícies de Ti, obtidas por um novo método empregando metalurgia do pó, sobre a osteogênese in vitro. Para isso, células da linhagem osteoblástica derivadas de fragmentos ósseos de processos alveolares humanos serão cultivadas sobre discos de Ti denso usinado (controle) e de Ti com três diferentes diâmetros médios (336, 376 e 556 µm) de poros e serão avaliados os seguintes parâmetros: morfologia e crescimento celulares, conteúdo de proteína total, atividade de fosfatase alcalina (ALP), mineralização da matriz extracelular e expressão quantitativa dos genes core binding factor alpha 1 (Cbfa1), colágeno do tipo I (COL), ALP, sialoproteína óssea (BSP), proteína óssea morfogenética–7 (BMP–7), osteocalcina (OC) e osteopontina (OPN).

A investigação de novas moléculas capazes de estimular a 
 formação óssea poderá levar a descoberta de novos agentes terapêuticos 
 para o tratamento da osteoporose e de traumatismos ósseos, bem como, de 
 terapia complementar na reabilitação de pacientes edêntulos. Além disso, 
 pode auxiliar na elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos no 
 processo de formação e reabsorção óssea. Existem evidências de que a 
 purmorfamina estimula a osteogênese em linhagens celulares modulando as 
 vias de sinalização Hedgehog (Hh) e Wingless (Wnt). Entretanto, até o 
 presente momento, nenhum estudo foi realizado para avaliar se o efeito da 
 purmorfamina se dá na indução da diferenciação de pré-osteoblastos, na 
 estimulação da atividade celular de osteoblastos diferenciados ou em 
 ambas. Portanto, o objetivo desse estudo será investigar o efeito da 
 purmorfamina sobre a osteogênese pela avaliação do perfil de expressão 
 gênica de células mesenquimais da medula óssea humana em diferentes 
 estágios da diferenciação osteoblástica. Além disso, será estudada a 
 participação das vias de sinalização Hh e Wnt na expressão gênica induzida 
 pela purmorfamina. Células mesenquimais serão caracterizadas em culturas 
 celulares menos diferenciadas (pré-osteoblastos) e mais diferenciadas 
 (osteoblastos) e avaliado o efeito da purmorfamina em cada uma dessas 
 culturas por meio de citometria de fluxo e Real-time PCR. A participação 
 das vias Hh e Wnt será verificada por Real-time PCR e por drogas 
 antagonistas dessas vias. Os experimentos serão realizados utilizando 
 separadamente células de pelo menos três doadores diferentes e os dados 
 serão submetidos à análise de variância (ANOVA) seguida do teste de 
 Bonferroni ou ao teste t, quando apropriado.

Os eventos celulares e extracelulares que ocorrem durante o processo de osseointegração são bastante influenciados pelas propriedades de superfície do titânio (Ti), como morfologia, topografia e composição química. O estudo das modificações de superfície de implantes de Ti tem atraído a atenção dos pesquisadores por existir grande interesse em tratamentos que possam acelerar o processo fisiológico de reparo do tecido ósseo em contato com o Ti. Estudos recentes têm mostrado que superfícies macroporosas permitem o crescimento ósseo para o interior dos poros, favorecendo a integração e a estabilidade do implante. O objetivo do presente projeto é avaliar a osteogênese in vitro sobre Ti macroporoso obtido por um novo método empregando metalurgia do pó. Para isso, serão utilizadas culturas de células da linhagem osteoblástica derivadas de fragmentos ósseos de processos alveolares humanos e serão avaliados os seguintes parâmetros: morfologia, adesão, proliferação e viabilidade celulares, conteúdo de proteína total, conteúdo de colágeno do tipo I, atividade de fosfatase alcalina (ALP), mineralização da matriz extracelular e expressão quantitativa dos genes colágeno do tipo I, ALP, sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteopontina (OPN) e Cbfa1/Runx2.

Os eventos celulares e extracelulares que ocorrem durante o 
 processo de osseointegração são bastante influenciados pelas propriedades 
 de superfície do titânio (Ti), como morfologia, topografia e composição 
 química. O estudo das modificações de superfície de implantes de Ti tem 
 atraído a atenção dos pesquisadores por existir grande interesse em 
 tratamentos que possam acelerar o processo fisiológico de reparo do tecido 
 ósseo em contato com o Ti. Três possíveis abordagens são descritas na 
 literatura para a modificação de superfície de Ti, sendo: (1) métodos 
 morfológicos, (2) métodos físico-químicos e (3) métodos bioquímicos. Essas 
 modificações podem representar boas alternativas para melhorar a 
 osseointegração de implantes. No entanto, até o momento, existem poucas 
 informações acerca dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos nas 
 possíveis diferenças na formação óssea adjacente à superfície dos 
 implantes. Portanto, nossos objetivos são avaliar a expressão de genes no 
 tecido ósseo formado adjacente a implantes osseointegrados de Ti com 
 diferentes tratamentos de superfície e a atividade funcional de células 
 osteoblásticas obtidas de fragmentos ósseos em contato com esses 
 implantes. Para tanto, implantes de Ti com as superfícies modificadas 
 pelos seguintes métodos: morfológico (macroporosidade), físico-químico 
 (anodização e deposição de Ca e P, chamado ASD-AK), e bioquímico 
 (deposição de colágeno do tipo I), serão implantados em mandíbulas de cães 
 e após 3 semanas serão removidos com auxílio de trefinas que garantam a 
 remoção do osso adjacente. Fragmentos desse osso serão processados para 
 análise da expressão gênica por PCR em tempo real e para obtenção dos 
 osteoblastos que serão cultivados in vitro para avaliar sua atividade 
 funcional determinando a sua capacidade de:

A regeneração tecidual guiada (RTG) tem sido utilizada em diversas situações clínicas para facilitar o reparo de defeitos ósseos e periodontais, sendo as membranas de politetrafluoretileno expandido (e-PTFE) as mais utilizadas. No entanto, várias membranas têm sido testadas para serem empregadas em RTG. O objetivo desse projeto será avaliar a biocompatibilidade in vitro de uma nova membrana do compósito de Poli(vinilideno-trifluoretileno)/Titanato de bário (P(VDF-TrFE)/BT). Para isso, osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos, células com as quais a membrana entrará em contato durante o processo de RTG, serão cultivados sobre discos de membranas de P(VDF-TrFE)/BT e e-PTFE (controle). Os seguintes parâmetros serão avaliados: adesão, proliferação e viabilidade celular, apoptose, conteúdo de proteína total, conteúdo de colágeno, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e formação de matriz mineralizada para as culturas de osteoblastos e fibroblastos; adesão, proliferação e viabilidade celular e apoptose para a cultura de queratinócitos.

O TAK-778 é um composto capaz de estimular a osteogênese in 
 vitro e in vivo. Células da linhagem osteoblástica sintetizam e secretam 
 citocinas que agem por meio de mecanismos parácrinos no controle da 
 osteoclastogênese. Entretanto, até o presente momento, nenhum estudo foi 
 realizado para avaliar o efeito do TAK-778 na formação e ativação de 
 osteoclastos. Portanto, o objetivo do presente estudo será investigar o 
 efeito do TAK-778 em osteoclastos e na interação entre osteoblastos e 
 osteoclastos. Células precursoras de osteoclastos, obtidas de medula óssea 
 humana, serão cultivadas em presença de veículo (controle) e TAK-778 
 (10-5M). Para avaliar o efeito do TAK-778 na interação 
 osteoblasto/osteoclasto, osteoclastos serão cultivados em meio de cultura 
 condicionado por osteoblastos, cultivados em presença de veículo 
 (controle) e TAK-778(10-5M). Ao final de 7 dias em cultura, serão 
 avaliados os seguintes parâmetros: 1) Expressão dos genes RANKL, OPG, 
 IL-1, IL-6, IL-11 e TNF-α, em osteoblastos humanos, por meio da técnica de 
 real time PCR; 2) Conteúdo das citocinas RANKL, OPG, IL-1, IL-6, IL-11 e 
 TNF-α e de prostaglandina PGE2, em osteoblastos humanos, por meio da 
 técnica de ELISA; 3) Formação e ativação osteoclástica, por meio de 
 coloração para fosfatase ácida (TRAP) e ensaio de reabsorção óssea. Os 
 experimentos serão realizados em triplicata e os dados serão submetidos à 
 análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Bonferroni ou ao teste t, 
 quando apropriado.