Ana Paula de Melo Loureiro.

Programas Regulares / Auxílios a Pesquisa / Reparo de EquipamentoEquipamento: Sistema completo de concentrador a vácuo MiVac Duo, constituído pelo concentrador, bomba de vácuo isenta de óleo, speed trap, controlador de pressão e rotoresMarca: GenevacModelo: MiVac DuoCaracterísticas relevantes: Permite a secagem rápida de amostras sob vácuo. Serve para secagem de solventes orgânicos e água, sem aquecimento de amostras sensíveis a degradação. A rotação em alta velocidade seguida pelo acionamento automático da bomba de vácuo impede perdas dos conteúdos dos tubos. Tubos de 1,5 mL, 2,0 mL, 15 mL e 50 mL podem ser utilizados, permitindo grande flexibilidade de volume a ser concentrado.Número de patrimônio FCF USP: 009.011945Custo: US$ 16.150,00Fonte de recursos para aquisição: Projeto FAPESP 2012/08616-8Ano de aquisição: 2012

Acordos de Cooperação / UFRO - Universidad de la Frontera / UFRO - Projetode Pesquisa - Regular FAPESP

Projeto Universal CNPq coordenado pela Profa. Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros da UFRN. A parte do projeto sob minha responsabilidade será executada na Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP.

Participa como colaboradora do projeto contemplado pelo CNPq com bolsas de doutorado no âmbito do PPGCF - UNIFAL-MG, bolsas de apoio técnico e auxílio financeiro pela Chamada Pública N 01/2019 - APOIO À FORMAÇÃO DE DOUTORES EM ÁREAS ESTRATÉGICAS (Processo 400865/2019-0).

O presente estudo tem como objetivo avaliar se a suplementação com nicotinamida ribosídeo em células BEAS-2B aumenta os níveis intracelulares de NAD+ e se esse aumento, simultaneamente com a exposição das células a baixas concentrações de B[a]P ao longo de 1 semana, modula as alterações metabólicas e epigenéticas induzidas por B[a]P, de modo a proteger contra a formação de colônias em meio semissólido Soft-Agar, indicando prevenção da tumorigênese.

O diabetes mellitus é considerado um sério problema de saúde global, sendo que suas complicações têm grande impacto no índice de mortalide da população. A nefropatia diabética é uma importante complicação desta doença metabólica, caracterizada basicamente por um declínio progressivo da taxa de filtração glomerular, proteinúria persistente e hipertensão. Diversos mecanismos têm sido propostos como importantes na patogênese e progressão da nefropatia diabética, uma vez que a hiperglicemia está relacionada com estresse oxidativo, aumento de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF-α, fatores de crescimento, como o TGF-β, e formação de produtos avançados de glicação. Considerando o fato de que mesmo após o controle glicêmico ainda há a ocorrência de complicações do diabetes, estudos recentes têm proposto a ocorrência de um fenômeno conhecido como memória metabólica para explicar tal fato. Sob esta perspectiva, neste trabalho será avaliada a modulação de uma série de marcadores relacionados ou possivelmente relacionados à nefropatia diabética em condições de hiperglicemia e de controle glicêmico precoce e tardio pelos hipoglicemiantes orais metformina e glibenclamida. Serão avaliados marcadores relacionados ao estresse oxidativo (lesões 8-oxodGuo, 1,N2-edGuo, 1,N6-edAdo no DNA, expressão das proteínas SIRT-1, AMPK, Bax, TGF-β, MKK 3/6, MKP-1 e p38), inflamação (lesões 8-NO2-dG, 8-Cl-dG no DNA, IL-6, TNF-α e NF-kB) e processo avançado de glicação (hemoglobina glicada e Nε-(carboximetil)lisina) em modelo de ratos diabéticos, assim como a expressão de genes alvos (PPARGC1A, TGF-β, TSP-1, MKP-1 e UNC13B) e sua possível regulação epigenética (metilação de ilhas CpG) na vigência de hiperglicemia controlada ou não. Pretende-se, desta forma, elucidar vias envolvidas no processo de memória metabólica que tenham papel importante no desenvolvimento da nefropatia diabética, a fim de contribuir para o seu controle.

O processo de transformação maligna de células epiteliais bronquiais é estudado utilizando-se como modelo uma linhagem de células humanas normais (BEAS-2B) expostas a benzo[a]pireno. Nesse modelo são estudadas alterações metabólicas (glicólise, ciclo de Krebs), alterações da expressão de genes e proteínas relacionados ao metabolismo (HIF, PI3K/AKT/mTOR), alterações da atividade de dioxigenases dependentes de α-cetoglutarato (PHD, TET), alterações do padrão de metilação do DNA, e formação de adutos de DNA. Pretende-se verificar se alterações do metabolismo da célula no processo de transformação maligna por um agente conhecidamente carcinogênico estão envolvidas em alterações do padrão de metilação do DNA que contribuam para o fenótipo maligno.

O diabetes mellitus tem sido considerado um dos problemas de saúde globalmente mais desafiadores do século 21, sendo as complicações crônicas da doença as responsáveis por esse quadro. Sabe-se que o diabetes promove estresse oxidativo, inflamação e a formação de produtos avançados de glicação não enzimática (AGEs), resultando em danos em diversas biomoléculas. Existe um contínuo interesse no desenvolvimento de métodos mais sensíveis para a quantificação de AGEs, de lesões devidas a estresse oxidativo e inflamação na vigência do diabetes, buscando novos biomarcadores para melhor compreensão dos riscos relacionados ao diabetes e monitoramento de estratégias terapêuticas. Para melhor compreensão do perfil de lesões em DNA que podem ocorrer em indivíduos diabéticos, neste trabalho analisaremos a formação de adutos de DNA em situação patológica de diabetes. Para tanto, serão quantificados em tecidos de ratos diabéticos, ratos diabéticos tratados com insulina e ratos não diabéticos, para comparação, os adutos N2-carboxietil-2?-desoxiguanosina (CEdG), 1,N2-eteno-2?-desoxiguanosina (1,N2-ɛdGuo), 1,N6-eteno-2?-desoxiadenosina (1,N6-ɛdAdo), 8-oxo-2?-desoxiguanosina (8-oxodG), 8-nitro-2?-desoxiguanosina (8-NO2-dG), e 8-cloro-2?-desoxiguanosina (8-Cl-dG), relacionados aos processos de estresse oxidativo, inflamação e AGEs. O estudo permitirá a visualização mais ampla de lesões relacionadas ao diabetes no organismo, comparando-se à situação não patológica ou à de diabetes tratado, possibilitando também estratégias para o teste de drogas anti-AGE.

O Bisfenol A (BPA) é um difenilalcano com reconhecida atividade estrogênica. Grande parte de sua produção é direcionada para a indústria produtora de plásticos, constituindo-se no principal insumo para produção do plástico policarbonato, que possui diversas aplicações. Além da sua presença nos produtos plásticos, o BPA é utilizado para a produção da resina epóxi, largamente utilizada na produção de tintas, adesivos e revestimentos de latas de alumínio utilizadas para acondicionar bebidas e alimentos. Há exposição humana a BPA ocupacionalmente, através do consumo de alimentos contaminados, ou ainda por via ambiental. Embora a literatura apresente muitos efeitos do BPA sobre o sistema endócrino, ainda conhece-se muito pouco a respeito da toxicidade deste xenoestrógeno sobre os demais sistemas do organismo.
Atualmente o BPA tem sido estudado com relação à sua atividade mutagênica em sistemas in vivo e in vitro. Tal atividade tem sido relacionada à formação de produtos de biotransformação reativos, capazes de levar à formação de adutos de DNA. Neste projeto será avaliada a possibilidade de biotransformação do BPA por mieloperoxidase, levando à formação de produtos reativos. Uma vez que trabalhos mostram que BPA leva a um processo inflamatório em organismos expostos, sua ativação por mieloperoxidase pode ter implicações para o desenvolvimento de câncer relacionado à exposição. Tal via de biotransformação do BPA ainda não foi investigada na literatura. Além disso, serão obtidos padrões de adutos de DNA induzidos por BPA, tanto os já publicados na literatura quanto novas lesões sintetizadas a partir das reações in vitro envolvendo fração S9, MPO ou nitrito. Tais lesões, juntamente com lesões devidas a estresse oxidativo, serão quantificadas em DNA de células expostas a BPA (MCF-7 e HL-60). Alterações epigenéticas serão avaliadas pela quantificação da metilação global do DNA das células. Essa abordagem integrada de diferentes mecanismos que podem contribuir para o desenvol

A queima pré-colheita de cana-de-açúcar é prática constante nos canaviais brasileiros e libera grande quantidade de poluentes, como material particulado de diâmetro menor que 10 e 2,5 µm (PM10 e PM2,5, respectivamente), monóxido de carbono, dióxido de carbono, óxidos de enxofre, óxidos de nitrogênio, amônia, ácidos orgânicos, ozônio, hidrocarbonetos voláteis e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). Esses poluentes causam desequilíbrio no meio ambiente e, além disso, agravam a saúde da população residente e próxima aos canaviais. Alguns compostos gerados pela queima são indutores de inflamação, estresse oxidativo e, portanto, são potencialmente indutores de lesões em DNA, tais como 8-oxo-7,8-dihidro-2´-desoxiguanosina (8-oxodGuo), gerada por ataque de radical hidroxila (HO?) ou oxigênio singlete (1O2) à base guanina no DNA, etenoadutos resultantes da reação de aldeídos com bases do DNA, e adutos devidos à reação de nitrosaminas geradas endogenamente com bases do DNA. Este projeto tem como objetivo avaliar os efeitos da queima pré-colheita da cana sobre os níveis de algumas lesões de DNA em leucócitos de trabalhadores de canaviais. Uma vez que a cultura da cana tem um importante papel na economia do país, torna-se importante quantificar impactos sobre a saúde da população exposta aos poluentes gerados no processo de queima pré-colheita. A base de dados gerada poderá direcionar a criação de políticas públicas para a proteção da saúde da população que reside e trabalha em áreas de cultivo de cana. Esses dados serão úteis para o cálculo de custos dos novos combustíveis (ex., etanol), considerando sustentabilidade e riscos para a saúde e meio ambiente.

Marcadores de dano biológico servem para avaliação do risco de desenvolvimento de doenças em situações de exposição ambiental e/ou ocupacional de seres humanos a xenobióticos. Dentre os possíveis marcadores, adutos de DNA servem para identificação da atividade genotóxica de substâncias e para o monitoramento da exposição humana aos agentes genotóxicos. Adutos de RNA estão começando a ser apontados como marcadores mais sensíveis que os adutos de DNA, além de poderem desencadear importantes efeitos biológicos. O nosso grupo vem estudando alguns mecanismos pelos quais o tetraidrofurano (THF) exerce seus efeitos tóxicos. O THF é um solvente muito utilizado industrialmente. Um estudo recente mostrou sua ação carcinogênica em animais experimentais, mas há poucos dados sobre sua toxicidade celular, danos a biomoléculas e genotoxicidade. Em trabalho anterior mostramos que adutos de DNA são formados a partir da reação de THF oxidado com 2?-desoxiguanosina (dGuo), 2?-desoxiadenosina (dAdo) e 2?-desoxicitidina (dCyd) in vitro. A possível ocorrência dessas lesões em sistemas biológicos expostos a THF aponta para uma via de ação genotóxica desse solvente, até o momento não considerada nos estudos de carcinogênese e toxicidade. Além disso, temos verificado que vapor de THF induz dano oxidativo em órgãos de camundongos expostos por inalação. Neste trabalho investigaremos a formação dos adutos dGuo-THF, dAdo-THF, dCyd-THF e de um marcador de dano oxidativo (8-oxodGuo) em DNA de células humanas em cultura (linhagem HepG2) expostas a diferentes concentrações de THF, quantificando essas lesões. Iniciaremos também um estudo visando a quantificação de adutos de RNA induzidos por THF e comparação com os níveis dos adutos de DNA gerados em células em cultura. Esse estudo nos permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na indução de câncer por THF.

Um aduto resultante da reação de dGuo com um constituinte da solução de light stick coletado na praia foi purificado e está em fase de caracterização estrutural (espectros de massas e RMN). Células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) foram incubadas com diferentes concentrações da solução de light stick e a sobrevivência foi avaliada pelo ensaio do MTT, verificando-se alta toxicidade. Verificamos ainda que constituintes da solução de light stick reagem com albumina in vitro. Daremos continuidade a este trabalho seguindo o plano abaixo:

1. Caracterização estrutural do aduto dGuo-light stick através de análise de espectros de RMN (1H, 13C, COSY, DEPT).
2. Identificação do constituinte reativo da solução de light stick através da análise da estrutura do aduto e da análise das soluções de light stick por HPLC/PDA e HPLC/ESI/MS antes e após a reação de quimiluminescência. Soluções resultantes da reação de quimiluminescência serão deixadas sob luz do sol por diferentes períodos (1 a 60 dias) para análise da formação de produtos. Reações dessas soluções com dGuo serão realizadas para verificação da formação do aduto dGuo-light stick já isolado.
3. Padronização de método para detecção do aduto por HPLC/ESI/MS-MS.
4. Incubação de DNA comercial (timo de bezerro) com solução de light stick, purificação e hidrólise enzimática para detecção do aduto por HPLC/ESI/MS-MS.
5. Incubação de células HepG2 com diferentes concentrações da solução de light stick antes, imediatamente após a reação de quimiluminescência e após 30 dias de exposição da solução à luz solar para realização de ensaios de citotoxicidade.
6. Avaliação de dano oxidativo nas células incubadas com soluções de light stick expostas e não expostas à luz (8-oxodGuo e 1,N2-dGuo em DNA; malonaldeído para verificação de peroxidação lipídica).
7. Incubação de células HepG2 com solução de light stick, extração de DNA e análise da formação do aduto dGuo-light stick por HPLC/ESI/MS-MS.

As indústrias têxteis provocam grande impacto ao meio ambiente devido à produção de grandes volumes de efluentes coloridos contendo altas cargas de compostos orgânicos de composição extremamente variável. Alem da poluição visual tais efluentes provocam alterações nos ciclos biológicos. Corantes azo formam um grande número de compostos quimicamente relacionados e suas propriedades variam dependendo da presença de diferentes grupos funcionais. Sob certas condições esses corantes podem ser clivados e liberar aminas aromáticas, que possuem efeitos mutagênicos e carcinogênicos já demonstrados na literatura. Neste trabalho investigaremos as vias pelas quais o corante CI Disperse Blue 291 (DB291) exerce efeitos genotóxicos e citotóxicos sobre células humanas em cultura. O DB291 é um corante dinitrobromoaminoazobenzeno com atividade mutagênica para S. typhimurium aumentada na presença de nitroredutase, O-acetiltransferas e enzimas microssomais (S9). Para estudo das vias de atuação do DB291 realizaremos estudos in vitro com produtos de biotransformação enzimática do corante na presença de nucleosídeos do DNA ou de uma proteína (citocromo c), verificando nas diferentes etapas se há modificação das biomoléculas estudadas. Uma vez que produtos finais de redução do corante (PBTAs não clorados) são mais mutagênicos que o composto original, será feita a síntese química dos mesmos para o tratamento de células em cultura. Células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) serão incubadas com o corante, bem como com seus produtos de redução (PBTAs não clorados e clorados) para a realização de ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade. Verificaremos ainda se a redução enzimática do corante (via nitrorredutase) leva à formação de PBTAs não clorados, a qual pode ser uma via importante de bioativação dessa classe de corantes.

Dentre os possíveis marcadores de dano biológico, adutos de DNA servem para identificação da atividade genotóxica de substâncias e para a monitoração da exposição humana aos agentes genotóxicos. O nosso grupo vem estudando alguns mecanismos pelos quais o tetrahidrofurano (THF) exerce seus efeitos genotóxicos. O THF é um solvente muito utilizado industrialmente. Um estudo recente mostrou sua ação carcinogênica em animais experimentais, mas há poucos dados sobre sua toxicidade celular, danos a biomoléculas e genotoxicidade. Em trabalho anterior (Hermida e col., 2006) mostramos que adutos de DNA são formados a partir da reação de THF oxidado com 2?-desoxiguanosina (dGuo-THF 1 e dGuo-THF 2), 2?-desoxiadenosina (dAdo-THF) e 2?-desoxicitidina (dCyd-THF). Esses adutos foram caracterizados por análises espectroscópicas e diferentes condições de HPLC/ESI/MS-MS foram otimizadas para sua detecção em DNA comercial incubado com THF in vitro. Apesar de detectadas, a quantificação das lesões não foi possível, uma vez que não possuímos os coeficientes de extinção molar dos adutos e os padrões isotópicos para serem utilizados como padrões internos na quantificação por ESI/MS. O uso de um padrão interno isotópico permite alta especificidade e precisão na quantificação de adutos por ESI/MS. Tendo como base os métodos de análise por HPLC/ESI/MS-MS que já utilizamos para detecção dessas lesões em DNA, é importante que nesta etapa do trabalho os mesmos sejam validados para quantificação (análise de linearidade, precisão, limites de detecção e quantificação). Alterações das condições cromatográficas utilizadas anteriormente poderão ser feitas para obtenção de maior sensibilidade. Padrões isotópicos (15N5) dos adutos dGuo-THF, dAdo-THF e (15N3) dCyd-THF serão sintetizados, purificados por HPLC e caracterizados por espectrometria de massas. Análises de 1H RMN serão feitas para determinação das concentrações dos adutos em soluções cujas absorbâncias serão obtidas (utilizando comp. onda máxim

Objetivos: determinar os níveis de dano oxidativo em humanos através da análise de um marcador de dano oxidativo ao DNA (8-oxodGuo) e de uma lesão decorrente da adição de produtos de peroxidação lipídica à base guanina no DNA (aduto 1,N2-etenodGuo). Será também feita a análise dessas lesões na urina.

O antantreno é um hidrocarboneto hexacíclico aromático (HPA) bastante difundido no meio ambiente e que não apresenta as regiões de baía ou fjord, que em geral, conferem alta reatividade a esses compostos após oxidação. Entretanto, sua mutagenicidade em bactérias após ativação metabólica é comparável à do Benzopireno (BP) e, com base na sensibilidade das linhagens de S. typhimurium utilizadas, os metabólitos do antantreno causam substituições de pares de base, trocas de fita e possivelmente dano oxidativo ao DNA. Alguns dos metabólitos que apresentam ação genotóxica em bactérias foram recentemente identificados, mas uma investigação mais ampla considerando a ligação desses e outros possíveis metabólitos a biomoléculas, com a identificação dos adutos formados, pode contribuir para um melhor esclarecimento das vias envolvidas em sua genotoxicidade.
	Neste trabalho investigamos a reação do antantreno (oxidado quimicamente e pelo sistema HRP/H2O2) com dG e DNA in vitro, tendo sido observada a formação de possíveis adutos nas análises por HPLC/ESI/MS, HPLC/UV/Fluorescência e espectrofluorimetria. Células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e hepatócitos de fígado humano normal (THLE-2) foram incubadas com antantreno e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas), verificando-se citotoxicidade dose dependente em diferentes condições de cultura. Uma vez que a sobrevivência relativa das células THLE-2 cultivadas sobre filme de colágeno e em meio PFMR-4 se assemelhou à sobrevivência relativa das células HepG2 cultivadas em meio DME e sem filme de colágeno, utilizamos as células HepG2 para análise de dano oxidativo. Produtos de oxidação do antantreno (quinonas e hidroquinonas acetiladas) induziram a formação de 8-oxodGuo no DNA celular.
Os dados obtidos nos indicam que duas vias podem estar envolvidas na genotoxicidade do antantreno observada nos estudos com S.typhimurium realizados por Platt et al. (2002): indução de dano oxidativo e formação de adu

CI Disperse Blue 291 (CI DB 291) é um corante dinitrobromoaminoazobenzeno com atividade mutagênica para S. typhimurium, aumentada na presença de nitrorredutase, o-acetiltransferase e enzimas microssomais (S9). Neste estudo foram isolados e caracterizados quatro produtos da redução de DB 291 com ditionito de sódio (in vitro), sendo denominados 2-fenilbenzotriazóis não clorados (não-ClPBTAs). Os espectros de absorbância não apresentam o pico correspondente à ligação azo (613 nm), indicando a redução dessa ligação. Espectros de massas e de 1H RMN mostram que os produtos são dois pares de tautômeros com m/z 465 [M+H]+ e m/z 449 [M+H]+. Esses produtos foram incubados com piridina/anidrido acético e seus espectros de massas indicam a adição do grupo acetil (m/z 507 [M+H]+ e m/z 491 [M+H]+). Após reação desses compostos com dGuo, foram detectados dois produtos, com m/z 632 [M+H]+ e m/z 683 [M+H]+, cujas estruturas ainda precisam ser elucidadas.
A incubação do corante CI DB 291 com nitrorredutase/NADH (uma noite, 37oC) levou à perda de grupos cromóforos (perda de cor). Análises por HPLC/ESI/MS indicam a formação de um não-ClPBTA (m/z 449) a partir da redução enzimática do corante. Uma vez que não-ClPBTAs são compostos mais mutagênicos para linhagens de S. typhimurium (com fração S9) que seus dinitrofenilazo corantes precursores, a conversão enzimática do corante para não-ClPBTAs pode ser uma via importante para sua bioativação.

Exposição a Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) está relacionada com o aumento de risco de câncer. Esses carcinógenos dependem da sua ativação para intermediários eletrofílicos para causar danos em biomoléculas. As vias de ativação melhor estudadas incluem (i) a formação de diol-epóxido nas regiões de baía ou fjord dos HPAs através de epoxidações catalisadas pela citocromo P450 (CYP450), com uma hidrólise intermediária pela epóxido hidrolase e (ii) oxidação (CYP450 ou peroxidases) levando à formação de um cátion radical reativo. Outras vias incluem a formação de derivados metilados, quinonas e metabólitos de anel aberto cujas contribuições para a carcinogênese ainda são pouco estudadas, assim como o papel do estresse oxidativo na toxicidade dos HPAs.
Investigamos neste trabalho a citotoxicidade e genotoxicidade do indeno[1,2,3-cd]pireno, trifenileno e coroneno e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas). Linhagens de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e de hepatócitos humanos normais (THLE-2) foram incubadas com os HPAs e suas respectivas quinonas e hidroquinonas acetiladas para análise de viabilidade celular (MTT) em diferentes condições de cultivo (por 16 horas, de 20 a 200µM). Células HepG2 foram incubadas por 16 horas com indeno[1,2,3-cd]pireno (50 µM), coroneno (20 µM), trifenileno (10 µM) ou seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas) para análise de dano oxidativo em DNA e peroxidação lipídica. Nas concentrações descritas acima, esses HPAs estruturalmente diferentes e seus produtos de oxidação são citotóxicos e levam ao aumento dos níveis de 7,8-dihidro-8-oxo-2?-desoxiguanosina e malonaldeído. Tais danos podem contribuir para o aumento do risco de desenvolvimento de doenças, como o câncer, na população exposta.

O tetrahidrofurano (THF) é um solvente altamente utilizado em indústria e pesquisa e estudos recentes indicaram atividade carcinogênica em animais experimentais, o que incentiva a investigação da sua possível interação com biomoléculas.
Adutos de DNA servem como marcadores para a identificação da atividade genotóxica de substâncias e para a monitoração da exposição humana aos agentes genotóxicos. Estudos realizados in vitro, em células em cultura e em animais experimentais permitem que mecanismos sejam desvendados e metodologias sejam desenvolvidas para uma posterior avaliação da exposição humana.
O objetivo do presente projeto é investigar a possível interação do THF com DNA em sistemas biológicos, através da análise da formação de adutos THF-desoxiguanosina já caracterizados. Para isso, realizamos incubações de THF com sistemas in vitro consistindo de: i) cultura primária de hepatócitos de camundongos; ii) DNA na presença da fração microssomal de fígado de ratos. Tal análise é importante para que possamos considerar a possibilidade de um efeito genotóxico do THF, o que teria implicações sobre os atuais limites de exposição ocupacional adotados para esse solvente amplamente utilizado. Além disso, é um primeiro passo para que possamos estabelecer os adutos já estruturalmente caracterizados como marcadores relacionados à exposição ao solvente.

No presente trabalho foi investigada a reação de produtos de oxidação do THF com os nucleosídeos 2'-desoxiadenosina (dAdo) e 2'-desoxicitidina (dCyd). As estruturas dos adutos formados foram elucidadas por análises de espectros de massas (ESI/MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) após purificação de quantidade suficiente dos produtos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Com isso, foi aberta a possibilidade de validação de novos marcadores de exposição a THF. Tais lesões foram detectadas em DNA incubado com THF oxidado in vitro, após o desenvolvimento de uma metodologia sensível e seletiva baseada em HPLC/ESI/MS-MS. 
Além disso, camundongos foram expostos a vapor de THF e foi feita análise de dano oxidativo (8-oxo-2?-desoxiguanosina) no DNA de fígado e rim. Um aumento de aproximadamente oito vezes no nível de 8-oxo-2?-desoxiguanosina foi observado no DNA dos órgãos dos camundongos expostos ao THF. 
Nossos estudos in vitro apontam para a possibilidade de ação genotóxica do THF oxidado (formação de adutos com o DNA). A ocorrência dessa via in vivo será investigada em estudos posteriores. Adicionalmente, há aumento de dano oxidativo em órgãos alvos de carcinogênese induzida por esse solvente.

Tetrahidrofurano (THF) é um solvente muito utilizado industrialmente. É volátil (ponto de ebulição 67ºC) e considerável concentração de vapor pode ser encontrada nos locais de trabalho, com grande potencial de exposição ocupacional entre seres humanos. Estudos recentes em roedores evidenciaram a atividade
carcinogênica desse solvente, o que incentiva a investigação dos mecanismos envolvidos. Recentemente nosso grupo mostrou a reação de produtos de oxidação do THF com bases do DNA, levando à formação de adutos que
podem contribuir para a carcinogênese observada em roedores [1]. Neste trabalho investigamos a reação de THF oxidado com aminoácidos e albumina in vitro, iniciando a busca de biomarcadores de exposição sensíveis para a determinação da dose biologicamente efetiva do solvente. Há alteração da massa da albumina de forma
dose dependente após incubação com THF oxidado (MALDI/TOF/MS). Diferentes produtos da reação dos aminoácidos lisina e histidina com THF foram observados por HPLC/UV/ESI/MS. Seus espectros de massas
indicam a adição de várias moléculas de THF aos aminoácidos ou a polimerização dos produtos de reação. Após digestão enzimática da albumina, peptídeos com massas correspondentes à adição de 1 a 7 moléculas
de THF foram identificados (MALDI/TOF/MS). Verificamos ainda diferenças entre os cromatogramas dos peptídeos de albumina controle e albumina incubada com THF oxidado. A continuidade do trabalho envolve a
definição de peptídeos que nos mostrem especificamente a ligação de moléculas de THF à proteína, bem como a padronização de uma metodologia para quantificação dessas lesões.

Neste projeto é investigada a reação de produtos de oxidação do THF com o nucleosídeo 2'-desoxiguanosina (dGuo). Dois adutos foram isolados e caracterizados por análises de espectros de massa (ESI/MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN). Padronizamos um método seletivo e sensível (HPLC/ESI/MS-MS) para a detecção dos adutos caracterizados, observando-se sua formação em DNA incubado com THF oxidado in vitro. Paralelamente analisamos danos induzidos por THF oxidado em células de carcinoma hepatocelular humano em cultura (HepG2). Ensaios para verificação da sobrevivência, nível de sulfidrilas não-proteicas (NPSH) e peroxidação lipídica das células HepG2 após exposição a diferentes concentrações de THF oxidado e não oxidado foram feitos, assim como a determinação dos níveis de 8-oxodGuo, verificando-se um efeito deletério desencadeado por produtos de oxidação do THF. Uma vez que a decomposição de hidroperóxidos do THF para radicais peroxila seria uma possível fonte de oxigênio singlete, monitoramos a geração dessa espécie reativa pela emissão de luz na região do infravermelho próximo e pelo efeito supressor de azida de sódio, na presença de FeII, confirmando-se a sua formação. Os dados indicam que produtos de oxidação do THF danificam biomoléculas, contribuindo para explicar o efeito carcinogênico observado em animais experimentais.