Ana Campa.

Apesar da inflamação resultante da obesidade estar bem caracterizada, tem-se discutido mais recentemente se a obesidade poderia ser uma das consequências do processo inflamatório. É conhecido que lipopolissacarídeo (LPS), administrado em doses muito baixas por infusão contínua (mimetizando a condição de endotoxemia provocada pela microbiota intestinal), induz a resistência à insulina, obesidade e diabetes em modelo experimental murino. Neste estudo pretendemos avaliar se a inflamação aguda é capaz de induzir a obesidade. Esta hipótese será testada pela indução seriada de eventos inflamatórios agudos, provocados por administração intra-peritoneal de altas doses de LPS, em camundongos swiss webster. Serão feitas análises no soro, carcaça, tecido adiposo e adipócitos isolados. Dentre os eventos sistêmicos marcantes do quadro agudo, está a síntese da proteína amilóide sérica A (SAA). Nosso interesse pela SAA é fruto de resultados do laboratório, que mostram uma ação na proliferação, diferenciação e lipólise de pré-adipócitos 3T3-L1. Sendo assim, nosso interesse é avaliar se há relação entre os mediadores gerados na inflamação aguda e a gênese da obesidade, através do efeito do soro oriundo de animais inflamados sobre a proliferação, diferenciação e lipólise de pré-adipócitos 3T3-L1. Como conseqüência dos efeitos que descrevemos para a SAA em relação à adipogênese, avaliaremos a contribuição da SAA como um elo entre a inflamação e a obesidade através da superexpressão de SAA em células 3T3-L1.

Para alguns tipos de tumores foi evidenciada uma correlação positiva entre a produção da proteína amilóide sérica A (SAA) e sua malignidade. Nosso grupo tem descrito o papel da SAA como um fator de crescimento estimulando a proliferação de diferentes tipos celulares. Em duas linhagens de glioma, além do efeito na proliferação, a SAA modifica a migração e invasão dependentemente de metaloproteinases de matriz (MMPs). Curiosamente, para uma das linhagens a SAA provocou um decréscimo de atividade das MMPs e conseqüente inibição da migração e invasão, enquanto que para a outra linhagem foi observado o inverso. Este resultado nos leva à este projeto que visa avaliar o efeito de SAA num conjunto maior de linhagens de tumores para melhor definir sua contribuição na malignidade. Melanomas foram escolhidos por serem agressivos, estudados por grupos competentes em São Paulo e para o qual a SAA tem sido proposta como fator prognóstico. Serão utilizados um banco de células com padrões distintos de mutações, cultivados tanto em monocamadas como em modelos tridimensionais imunocompetentes (colaboração Profa. Silvya Stuchi - FCF/USP) e amostras clínicas (colaboração Prof. Gilles Landman- UNIFESP). Resultados preliminares com duas linhagens de melanoma mostraram um perfil diferenciado na expressão gênica de SAA e na invasão e migração. Outra questão importante é a definição do(s) receptor(s) da SAA na célula tumoral. Neste sentido, também em estudo preliminar, identificamos que a expressão de Toll-like receptors (um dos receptores identificados para SAA) é maior na linhagem mais responsiva.

A proteína de fase aguda Amilóide sérica A (SAA) é conhecida por modular processos inflamatórios e foi descrita como o mais novo marcador de progressão tumoral. Isto porque trabalhos demonstram aumento sérico de SAA em neoplasias humanas. Esta constatação é suportada ainda pelo fato de SAA ser produzida de forma constante e tênue em processos crônicos e estes contribuírem na gênese e progressão de tumores. Numa abordagem inédita nosso objetivo tem sido avaliar o efeito direto de SAA sobre duas linhagens de glioblastomas humanos (projeto de mestrado FAPESP nº07/56864-2). Trabalhando com as linhagens A172 e T98G, mostramos que SAA afeta a produção de citocinas e outros fatores relacionados ao crescimento e disseminação de tumores (MMPs e RECK). Nossas investigações também permitiram verificar que glioblastomas são capazes de expressar e produzir a proteína SAA. Os efeitos de SAA sobre o crescimento, migração e invasão dependeram da linhagem e da concentração da proteína e sugerem que SAA seja importante para a biologia dos tumores, exercendo tanto efeitos pró quanto anti-neoplásicos. Assim sendo, neste projeto nos propomos a analisar o efeito da SAA sobre o citoesqueleto da célula e adesões focais, atividade enzimática das MMPs, ciclo celular, apoptose e necrose, vias de sinalização, receptores, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Também avaliaremos o efeito da hipóxia sobre a produção de SAA pelas células tumorais. Também pretendemos identificar indutores de SAA em tumores e ainda, avaliar o impacto da superexpressão e supressão de SAA nos mesmos. Este estudo permitirá reconhecer os mecanismos pelos quais SAA age sobre células tumorais e uma ação autócrina para esta proteína e contribuirá com a compreensão de como os processos inflamatórios interferem na progressão tumoral.

O metabolismo do triptofano (TRP) se dá pela via das quinureninas (via QUIN) e pela via serotonérgica (via SER). A primeira gera quinurenina (QUIN) e uma gama de produtos secundários e, quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO), contribui para os fenômenos de tolerância e o imune escape de células tumorais. A via SER leva à produção de serotonina (5-HT), que pode gerar melatonina (MLT) e outros metabólitos. Os produtos da via SER, assim como MLT e metabólitos, possuem efeitos imunomodulatórios e, no que concerne ao câncer, há evidências de que estes compostos podem controlar o crescimento tumoral. Visto que diferentes tipos de tumores e células do sistema imune expressam IDO e dada a importância desta via na avaliação de severidade e no desenvolvimento de estratégias da terapia anti-neoplásica, o objetivo do presente projeto é identificar qual a importância das vias QUIN e SER no metabolismo de TRP em monócitos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos e algumas linhagens tumorais humanas. Estas rotas serão avaliadas também após tratamento das células mantidas em cultura com IFN-g. Apesar do IFN-g ser um indutor clássico da via QUIN, não se conhece seu efeito sobre a via SER. A partir da tabulação das vias QUIN e SER nas diferentes células estudadas neste projeto, saberemos se as vias de degradação de TRP são ativadas concomitantemente ou se elas competem entre si. Alguns estudos nossos feitos em sistema livre de células amparam a participação de metabólitos de ambas as vias na regulação destas. Nossas hipóteses são de que a via QUIN e SER exerçam controle uma sobre a outra, que os produtos gerados pela via SER modulam a resposta imune e que, além da via QUIN, a via SER também definiria o rumo da progressão tumoral. Com ensaios de co-cultura avaliaremos o impacto das vias de metabolização do TRP na comunicação celular entre células imunológicas e tumorais.

Nos últimos anos nosso grupo de pesquisa tem reconhecido várias atividades da amilóide sérica A (SAA) sobre leucócitos humanos no que diz respeito à liberação de citocinas pró-inflamatórias, produção de espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico (NO). Com isso houve uma contribuição na definição da SAA como um potente agente imunorregulador que deve contribuir para a gênese e progressão da doença inflamatória. Apesar dos esforços no reconhecimento das ações da SAA, há ainda muitos questionamentos relacionados às ações desta sobre outros tipos celulares. Recentemente, foi descrito que a SAA é expressa por células trofoblásticas entre a 10a e 12a semanas de gravidez, porém o seu papel na interface materno-fetal permanece desconhecido. Assim, com este trabalho, fruto de uma colaboração com a Profa. Estela Bevilacqua (ICB-USP), pretendemos, em um primeiro momento, avaliar a presença da SAA em trofoblasto humano do vilo placentário durante os processos associados à implantação embrionária como a diferenciação e a invasão in vitro. Havendo a detecção da SAA durante os processos acima citados é de nosso interesse silenciar o gene da SAA e monitorar o efeito do silenciamento sobre estes mesmos processos. Para isso, pretendemos padronizar todas as condições de silenciamento gênico da SAA na linhagem de coriocarcinoma (JAR), que mimetiza a célula trofoblástica primária e expressa SAA de forma constitutiva, para depois estender para o citotrofoblasto humano. Em um segundo momento, verificaremos os efeitos da SAA sobre o citotrofoblasto extraviloso no que se refere à proliferação, a diferenciação e invasão, expressão e atividade de metaloproteinases (MMP-2 e MMP-9), liberação de citocinas e produção de NO. Além disso, avaliaremos se na ação da SAA sobre o citrofoblasto há a ativação de receptores Toll-like 2 e 4, para os quais a SAA é um dos ligantes. Portanto, com este estudo será possível verificar a participação da SAA em processos protetores e/ou deletérios para o desenv

Nos últimos anos surgiu o conceito geral de que uma inflamação sutil e crônica acompanha o desenvolvimento excessivo de tecido adiposo. Os elementos que associam a obesidade com a inflamação são: (i) o aumento tênue de fatores inflamatórios no soro de indivíduos obesos, (ii) a expressão de genes inflamatórios pelo adipócito e (iii) a infiltração de macrófagos no tecido adiposo e sua relação com o crescimento do tecido. Estas observações fizeram surgir a hipótese de que o desenvolvimento de um processo inflamatório no tecido adiposo em crescimento é o evento primário na gênese das alterações metabólicas e vasculares e podem ser a condição que associa a obesidade com doenças como a diabetes tipo II e aterosclerose. Há 2 anos iniciamos um projeto cujo objetivo foi o de avaliar o efeito da proteína amilóide sérica A (SAA), uma proteína de fase aguda, sobre adipócitos humanos. As justificativas para este estudo foram que, na mesma época, havia sido mostrado que adipócitos expressavam SAA e que havia uma proporcionalidade entre a concentração sérica de SAA e índice de massa corpórea (IMC), sendo que indivíduos obesos que perdiam peso tinham uma redução na concentração desta proteína no soro. Vimos com bastante interesse estes estudos uma vez que estudávamos o efeito de SAA sobre células do sistema imune. Em macrófagos, neutrófilos e PBMC, a SAA induzia respostas inerentes à ativação celular e inflamação, ou seja, SAA era capaz de induzir a expressão e liberação de uma gama de citocinas, aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS). Inicialmente tínhamos como objetivo avaliar se SAA também era capaz de induzir ROS e RNS e a síntese de citocinas por adipócitos e também se teria um papel na diferenciação de pré-adipócitos. Resultados de amostras de adipócitos humanos obtidos de tecido subcutâneo retirado de cirurgias plasticas estéticas e mantidos em cultura mostraram que estas respondiam à incubação com SAA aumentando a

Tumores malignos são acompanhados de inflamação crônica e aumento de proteínas de fase aguda. Neste contexto, está inserida a amilóide sérica A (SAA), uma proteína que apresenta atividade imunomodulatória por promover a expressão e liberação de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio por leucócitos. Até o momento, a relação estabelecida entre a SAA e neoplasias se restringe a trabalhos clínicos que descrevem a SAA como um marcador diagnóstico. Todavia, a existência de relação da SAA com a proliferação celular ainda não foi investigada. Assim sendo, nos propomos a analisar o efeito direto da SAA nas linhagens celulares de glioma humano - A172 e T98G - a fim de investigar a ação desta proteína na proliferação celular. Caso a SAA afete o crescimento dos gliomas, caracterizaremos os marcadores envolvidos na proliferação ou regressão celular, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de óxido nítrico (NO), assim como, a expressão de metaloproteinases de matriz (MMP-2 e MMP-9), expressão de mTOR (molécula alvo da rifampicina) e os marcadores de apoptose e necrose. Caso um efeito direto sobre a proliferação não seja evidenciado, estudaremos estes parâmetros em co-culturas destas duas linhagens tumorais com células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Também avaliaremos se SAA é expressa nas linhagens A172 e T98G. Este estudo proverá um maior conhecimento acerca da ação da SAA em células tumorais e elucidará possíveis mecanismos imunológicos envolvidos na proliferação ou regressão do tumor.

Este é um projeto multiusuário da FAPESP para aquisição e instalação de espectrometro de massas (ion-trap) para a FCFUSP cuja coordenação geral é da Profa. Ana Campa. O número de alunos refere-se a todos os pesquisadores envolvidos (coordenação geral, dois coordenadores, 12 docentes de diferentes insitutos da USP).