Tie koide.

Projeto de doutorado sanduíche no exterior, Institute for Systems Biology, Seattle, EUA

A hipótese da transcrição pervasiva, onde todo o DNA de um organismo está associado a pelo menos um transcrito, tem se fortalecido com a aquisição massiva de dados de transcritoma. Uma questão importante que surge neste contexto é a funcionalidade e regulação desses transcritos na rede de regulação gênica de um dado organismo, principalmente de transcritos antisense a genes anotados. Neste projeto de pesquisa, utilizaremos a archaea halofílica Halobacterium salinarum NRC-1 como um modelo para estudo do transcritoma antisense de archaeas e da sua influência na regulação pós-transcricional. Membro do terceiro domínio da vida, este microorganismo com características bioquímicas únicas tem sido utilizado como modelo em Biologia Sistêmica, com redes de regulação gênica construídas focados em genes que codificam proteínas. Neste projeto, utilizaremos abordagens experimentais associadas a utilização de ferramentas de bioinformática para identificar com precisão o transcritoma antisense de H. salinarum, estudar a sua regulação mediante estresses ambientais e a influência de RNAses. A integração de dados em larga escala utilizando abordagens de Biologia Sistêmica deverão permitir a formulação de hipóteses a respeito de RNAs antisense específicos que serão validadas experimentalmente através da superexpressão desses RNAs e avaliação fenotípica. Assim, este projeto deverá contribuir para a compreensão da rede de regulação gênica pós-transcricional em archaeas, consolidando a utilização de abordagens sistêmicas para elucidar a ainda incipiente biologia do terceiro domínio da vida.

Os sistemas de secreção do tipo VI (SSVI) de bactérias são complexos proteicos que atravessam o envelope bacteriano, promovendo a translocação de proteínas para o interior de células-alvo. Os SSVI foram descobertos recentemente e diversos estudos sobre a estrutura do complexo de proteínas e seu mecanismo de ação demonstram semelhanças com a maquinaria de injeção de DNA nas células bacterianas por bacteriófagos, especialmente o fago T4. Os SSVI exercem papel essencial na virulência em espécies de bactéria e podem atuar também na competição entre micro-organismos, secretando toxinas para bactérias vizinhas e aumentando o fitness da espécie que os possui. A infecção de citros por Xanthomonas citri pv citri (Xac) causa o cancro cítrico, doença responsável por grandes prejuízos à agricultura no Brasil. O genoma de Xac codifica um SSVI completo, dividido em dois grupamentos gênicos, separados por 10 genes. Este projeto visa a realizar um estudo funcional do SSVI de Xac, utilizando técnicas de genética bacteriana e biologia molecular. Para isso, cepas mutantes em genes essenciais do SSVI serão caracterizadas fenotipicamente e a expressão de genes que codificam seus componentes será analisada em diferentes condições. A identificação de substratos do SSVI será realizada pela análise do secretoma de cepas que apresentam atividade alterada de seus componentes. Dois fatores sigma alternativos codificados por genes localizados entre os dois grupamentos gênicos do SSVI também serão caracterizados, através de análise por transcriptoma de cepas que expressam altos níveis destas proteínas regulatórias e estudos fenotípicos de cepas mutantes. Os resultados obtidos contribuirão para a compreensão dos mecanismos de atuação dos SSVI e da fisiologia e patogenicidade de Xac.

A percepção de sinais ambientais é crucial para a célula modificar seu padrão de expressão gênica para enfrentar mudanças no ambiente. À medida que a população aumenta, as células enfrentam uma redução progressiva da disponibilidade de nutrientes que traz a necessidade de responder adequando os sistemas metabólicos para permanecer em situação de carência prolongada. O principal objetivo deste projeto é identificar os sinais ambientais, os sistemas de transdução de sinais e os mecanismos regulatórios importantes para a resposta a estresses na bactéria oligotrófica Caulobacter crescentus. Esta bactéria Gram-negativa aquática está adaptada a viver em ambientes com baixíssimo teor nutricional, e possui um ciclo de desenvolvimento com um passo de diferenciação celular, não usual em bactérias. A manutenção da funcionalidade dos RNAs celulares sob situações de estresse é garantida pela indução de proteínas que modulam a transcrição, tradução e turnover dos RNAs. As proteínas de choque frio (CSP) são induzidas em baixa temperatura e/ou em fase estacionária, e atuam como chaperones de RNA, permitindo a tradução nestas condições, e também agindo como reguladoras da expressão gênica. Outro sistema importante para esta resposta é constituído pelas RNA helicases da família DEAD, que são responsáveis por desfazer as estruturas secundárias nos RNAs, auxiliando a tradução. Estas enzimas também atuam junto ao sistema de degradação dos RNAs (degradossomo), e na montagem de estruturas riboproteicas, como os ribossomos. Este projeto pretende avaliar os sistemas regulatórios que controlam a expressão gênica das CSPs, e o papel de cada RNA helicase DEAD na resposta a estresses. As bactérias aeróbias também têm que responder a um aumento na concentração de espécies reativas de oxigênio, que ocorre especialmente quando a população entra em fase estacionária. A homeostase de ferro e de outros metais redox-ativos é um ponto importante no controle do estresse oxidativo, e deve ser estritamente regulada por diversos mecanismos. Além dos reguladores Fur e OxyR, pequenos RNAs regulatórios exercem controle sobre a expressão dos genes do metabolismo de ferro, e serão estudados neste projeto.

Organisms from the Archaea domain are excellent models to investigate the different strategies used by living cells to thrive in extreme niches. The current proposal has as the main goal the investigation of the gene regulatory network of the model organism Halobacterium salinarum NRC-1. First, a new set of modular genetic tools will be developed to improve the capability to genetically manipulate this organism. Second, the regulatory role and the molecular mechanism of action of new non-coding RNAs (ncRNAs) will be investigated in H. salinarum. Finally, the newly in vivo generated information will be integrated with pre-existing knowledge in order to implement a computational model of the regulatory network in H. salinarum taking into account the interplay of both general transcriptional factors (GTFs) and ncRNAs. This integrative approach attempts to get insight into the molecular mechanisms used by this organism to adapt to environmental signals. The model predictions will be validated in vivo using pre-existing and newly implemented genetic tools. The expected results from this project would allow enhancing our knowledge about the adaptation mechanism used by this organism to thrive under hash environments, with high relevance for new biotechnological applications.

Estrutura implica função. No universo das biomoléculas, esse é um paradigma amplamente aceito. Porém, quando o foco é o transcritoma, a configuração estrutural é uma camada de informação que ainda é pouco considerada. A partir do reconhecimento das diferentes funções desempenhadas pelos RNAs, é fundamental que sua estrutura seja desvendada para que seja possível a compreensão de como essas biomoléculas atuam em diversos processos cruciais para a existência e manutenção dos sistemas biológicos, como armazenamento, transporte, além de atividades de catálise e regulação. No presente Projeto de Pesquisa, propõe-se realizar a modelagem in silico em larga escala da estrutura de todos os RNAs (RNA Estruturoma), utilizando como organismo de estudo o extremófilo Halobacterium salinarum. A partir da modelagem, será possível classificar essas moléculas em grupos estruturais, além de investigar a correlação entre esses agrupamentos e informações sobre função e regulação do transcritoma. Para a validação das predições in silico, propõe-se a utilização de metodologias de footprinting para o mapeamento estrutural in vitro e in vivo de alguns RNAs candidatos.