Taísa Magnani Dinamarco.

Confidencial

Projeto Universal CNPQ - Chamada CNPq/MCTI/FNDCT N 18/2021 - Faixa B - Grupos Consolidados (Processo CNPq N 403675/2021-9). O presente projeto tem como objetivo produzir de maneira integrada e otimizada, xilo-oligossacarídeos (XOs), celo-oligossacarídeos (COs) e nanocristais de celulose (NCCs) a partir de resíduos agroindustriais, como bagaço de cana, casca de milho e palha de arroz. Acredita-se que a integração de ondas ultrassônicas associadas à hidrólise enzimática possam promover elevados rendimentos de XOs, COs e NCCs simultaneamente. É importante salientar que este trabalho tem carácter inovador, visto que não há estudos na literatura que englobem a produção integrada e otimizada desses bioprodutos. Além disso, pretende-se estudar os principais mecanismos envolvidos nas atividades biológicas (atividades prebiótica, antioxidante, antidiabética e anti-hipertensiva) e tecnológicas (reologia, atividades emulsificantes e estabilizantes) desses biocompostos, uma vez que ainda não são totalmente elucidadas na literatura. A elucidação destas propriedades é fundamental para ampliar ainda mais a gama de aplicações destes bioprodutos..

Resíduos lignocelulósicos são uma fonte promissora de polissacarídeos que podem ser convertidos em uma variedade de compostos, que vão desde biocombustíveis até bioplásticos. A maior parte desses resíduos podem substituir produtos originados do petróleo, representando uma importante vantagem ambiental. Os materiais lignocelulósicos são teoricamente ilimitados, mais baratos e não competem com as culturas alimentares. No entanto, a principal limitação do seu uso é que a conversão desses materiais em açúcares mais simples geralmente requer enzimas celulolíticas, que ainda estão associadas a um alto custo de produção, o que é considerado um dos principais entraves na valorização econômica desse processo. O conceito de bioprocessamento consolidado (CBP) é uma abordagem promissora para a conversão econômica de biomassa vegetal em combustíveis e produtos químicos e é descrito como uma alternativa para a redução no consumo e custos de celulases. Esse conceito se baseia na utilização de microrganismos que podem hidrolisar as frações celulósica e hemicelulósica da biomassa pré-tratada e, simultaneamente, converter os açúcares monoméricos liberados em produtos úteis. As leveduras são os microrganismos de escolha no CBP, pois podem produzir altos rendimentos de biocombustíveis ou seus precursores moleculares. No entanto, as leveduras utilizadas não são capazes de produzir enzimas que degradam as biomassas de forma eficiente e nesse cenário a engenharia de leveduras, juntamente com a biologia sintética se destacam por permitirem a expressão de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas em leveduras fermentativas. Resultados das contínuas e recentes pesquisas no nosso Laboratório de Biotecnologia de Proteínas da FFCLRP (FAPESP: Processos 2014/10466-0, 2016/19095-0 e 2018/10296-8) apontam para a viabilidade do uso concomitante na hidrólise de biomassas de novas enzimas identificadas pelo nosso grupo de pesquisa. Com isso, a nossa proposta visa à expressão de enzimas celulolíticas em cepas de S. cerevisiae de interesse industrial, que poderão ser empregadas no Bioprocessamento consolidado. A edição genômica será realizada pelo sistema enzimático quimérico CRISPR/Cas, uma ferramenta muito poderosa que está revolucionando as abordagens de engenharia genética e ampliando o repertório de organismos geneticamente modificados (OGM), e por isso desperta o interesse não apenas da pesquisa básica, mas também da indústria biotecnológica. As cepas construídas serão aplicadas no Bioprocessamento consolidado, utilizando diferentes biomassas. Esta etapa do projeto será realizada em cooperação com a Dra. Lucília Domingues do "B. Factory group- Molecular Biotechnology, Bioreactors, Biofuels and Food research group" da Universidade do Minho (Braga, Portugal). Espera-se que os resultados permitam a implantação de tecnologias de segunda geração para a produção sustentável de bioetanol e derivados químicos, a partir de biomassas a um custo muito menor do que a tecnologia atual.

Nos últimos 4 anos a agroindústria canavieira brasileira foi um dos setores que mais se desenvolveu no pais. Dentre os principais países produtores, o Brasil está na liderança com uma área superior a 9 milhões de hectares utilizados pelo setor sucroalcooleiro e é responsável por uma produção anual de 632 milhões de toneladas de cana-de-açúcar. De todo o açúcar redutor recuperável a partir de biomassa lignocelulósica, 56% é destinado à produção de etanol e 44% para o processamento de açúcar comercial O processo tradicional de produção de etanol de primeira geração envolve o esmagamento dos colmos para obtenção de caldo, um material rico em sacarose, o qual é, subsequentemente, fermentado pela levedura S. cerevisiae em condições anaeróbias. No entanto, cerca de 30% da massa da cana-de-açúcar é perdida na forma de palha e bagaço. O resíduo lignocelulósico apresenta composição de 32-48% de celulose, 23-27% de hemicelulose e 19-32% de lignina. A conversão eficiente da biomassa lignocelulósica em açúcares solúveis é um grande desafio tecnológico, o qual limita a produção eficiente desse material em produtos químicos e biocombustíveis. Na natureza, o processo é conseguido pela ação de uma grande variedade de celulases, xilanases e enzimas auxiliares. Neste contexto, os fungos filamentosos conhecidos pela sua capacidade em produzir enzimas hidrolíticas capazes de clivar a biomassa lignocelulósica ganhou relevância nos últimos anos, dentre eles o A. fumigatus. Apesar de sua patogenicidade, o A. fumigatus apresenta um destacado potencial biotecnológico relacionado com a desconstrução de resíduos vegetais como o bagaço, fazendo frente até mesmo ao produtor padrão T. reesei, uma vez que é considerado um importante produtor de celulases, hemicelulases, amilases, lignases, lipases, proteases, quitinases e fosfatases, que juntas apresentam alto grau de sinergia. Resultados obtidos pelo nosso grupo de pesquisa em que caracterizou o secretoma e o transcriptoma de A. fumigatus, quando cultivado em bagaço de cana-de-açúcar, revelaram a secreção de 54 enzimas hidrolíticas caracterizadas como Carbohydrate-Active enzymes (CAZy enzymes) e a super-expressão de 145 genes codificadores desse mesmo grupo de enzimas, dentre eles diferentes mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs). As LPMOs são classificadas como enzimas com Atividades Auxiliares (AA) descritas em diferentes bactérias e fungos e apresentam um importante papel na desconstrução da biomassa lignocelulósica, pois apresentam mecanismos de ação oxidativo capaz de impulsionar a atividade de enzimas canônicas como celulases e hemicelulases. São classificadas em 4 classes principais, sendo as classes de AA9, AA10 e AA11 as de maior interesse atualmente. Estudos recentes, nos quais coquetéis enzimáticos comerciais foram suplementados com LPMOs purificadas, mostrou um aumento na eficiência de degradação da biomassa lignocelulósica, destacando a importância dessas enzimas na hidrólise da biomassa. Nesse contexto, o principal objetivo deste trabalho é a caracterização do perfil de expressão das diferentes LPMOs de A. fumigatus em uma variedade de substratos e a expressão heteróloga de quatro LPMOs identificadas como super-expressas nesses substratos em que o fungo foi cultivado. A purificação e caracterização dessas enzimas permitirá uma maior compreensão do papel desempenhado por elas na hidrólise da biomassa, o que poderá ajudar a aumentar a eficiência dos coquetéis enzimáticos disponíveis no mercado atualmente.

Atualmente, o Brasil produz mais de 25 bilhões de litros de etanol por ano a partir da cana-de-açúcar, o que representa aproximadamente 33% de toda produção mundial, destacando-o em um importante papel na futura demanda deste combustível. Para manter estes índices, são necessários investimentos compatíveis para geração de novas tecnologias na conversão da cana-de-açúcar para etanol. Atualmente, a produção de etanol ocorre a partir de tecnologias de primeira geração que utilizam a sacarose da cana-de-açúcar como fonte energética. Cerca de um terço da energia da planta é usada para a produção de etanol e açúcar, enquanto que o restante permanece no campo na forma de bagaço e palha, produzindo o maior resíduo da agroindústria brasileira. A grande quantidade de bagaço gerado, a fácil disponibilidade e o baixo custo estimulam os estudos para a produção de etanol, podendo o Brasil se tornar uma grande potência no desenvolvimento de etanol de segunda geração. Biocombustíveis de segunda geração podem ser produzidos a partir dos açúcares liberados da parede celular dos resíduos de origem vegetal, como o bagaço de cana-de-açúcar. A biomassa da cana-de-açúcar é constituída de material lignocelulósico, principalmente celulose, hemicelulose, que são polissacarídeos de açúcares de alta energia e que podem ser convertidos a etanol. No entanto, a associação entre a celulose, hemicelulose e pectina impõem grandes dificuldades para recuperar os açúcares constituintes sob a forma de monômeros com elevado grau de pureza. Devido à essa característica recalcitrante do bagaço, um grande desafio na produção de combustíveis de segunda geração é a conversão de substratos lignocelulósicos em açúcares fermentáveis. Com isso se tornam necessários pré-tratamentos mecânico ou químico eficazes, que visam destruir a estrutura celular do bagaço, para posterior hidrólise enzimática. Na natureza, os fungos e bactérias desempenham uma importante função na degradação da biomassa de plantas, pois secretam diferentes enzimas específicas para os polissacarídeos constituintes. Muitas destas enzimas são estudadas, caracterizadas e catalogadas no banco de dados CAZy, sendo as mais abundantes da classe das glicosil hidrolases (GH) e carboidrato esterases (CE). No entanto, pouco ainda é conhecido sobre a resposta dos fungos aos diferentes materiais lignocelulósicos e sobre a produção de enzimas e proteínas acessórias necessárias à quebra da biomassa vegetal. Atualmente estas as enzimas são mais estudadas em fungos como Aspergillus niger e Trichoderma reesei. Porém, outros membros do gênero Aspergillus são capazes de secretar enzimas hidrolíticas de extrema importância, dentre eles o A. fumigatus. Apesar do A. fumigatus ser um fungo patogênico, é considerado um importante produtor de enzimas como celulases, lipases e xilanases, cujo efeito sinérgico aumenta a eficiência hidrolítica das enzimas secretadas, mas ainda pouco se sabe sobre essas enzimas, fato que ressalta a importância do melhor entendimento deste mecanismo em A. fumigatus. Nesse sentido, os principais objetivos deste trabalho são: (i) a análise do perfil transcricional de A. fumigatus quando crescido na presença de bagaço de cana-de-açúcar, através de técnicas de RNA-seq; (ii) identificação das enzimas secretadas no meio através de LC-MS/MS (Secretoma); (iii) caracterização em S. cerevisiae PE-2 das 5 enzimas hidrolíticas mais expressas no RNA-seq. A análise dos dados de RNA-seq, bem como a determinação do secretoma desta espécie, poderá trazer novos conhecimentos das enzimas hidrolíticas que favoreçam sua aplicabilidade industrial, com ênfase no etanol de segunda geração.

A. fumigatus é um fungo patógeno primário e oportunista, alergênico, que também causa asma severa e sinusites em pacientes imunocompetentes. Devido ao fato de que A. fumigatus produz quantidades prodigiosas de conídios, o trato respiratório humano está continuamente exposto ao fungo. Os conídios alcançam as vias aéreas por inalação e chegam ao pulmão devido ao seu pequeno tamanho; nos alvéolos tornam -se ativos e germinam. O sensoriamento e a obtenção de nutrientes essenciais do ambiente são características fenotípicas que estão associados ao crescimento do saprófita A. fumigatus em ambientes inóspitos. Apesar da importância médica e ecológica, a biologia básica deste organismo é mal compreendida. Dentre os aspectos da fisiologia celular de A. fumigatus, o funcionamento do ajuste fino do balanço entre fosforilação e defosforilação de alvos proteicos ainda é pouco conhecido. Uma vez que as modificações pós-traducionais envolvendo transferência e remoção de grupamentos fosforil de proteínas é um dos mais importantes eventos que têm consequência na sinalização celular em células eucarióticas, os principais objetivos deste projeto são: (i) a caracterização molecular de genes modulados ao nível transcripcional por CrzA, um fator de transcrição chave na via de sinalização de cálcio/calcineurina o qual está posicionado downstream à fosfatase calcineurina. Os genes em questão foram previamente identificados por Chromatin Immunoprecipitation seguida por sequenciamento de DNA (Chip-Seq); (ii ) a caracterização molecular de todos os genes que codificam proteínas fosfatases em A. fumigatus e o seu envolvimento em virulência e patogenicidade; (iii) a verificação da participação das diferentes fosfatases de A. fumigatus nas via de sinalização de integridade da parede celular (CWIP cell wall integrity pathway e osmoresistência (HOG High Osmolarity Glycerol ); e (iv) a identificação global de alvos regulados ao nível transcripcional e proteico por fosfatases de A. fumigatus. Para o cumprimento desses objetivos propostos esses genes serão deletados e os fenótipos das linhagens mutantes bem como a sua virulência e patogenicidade investigadas, tanto no modelo alternativo Galleria mellonella, assim como no modelo de imunossupressão em camundongos. As abordagens propostas neste trabalho poderão ser capazes de descrever novos genes reguladores (e não somente os efetores) nesses processos. Além disso, os resultados obtidos a partir do estudo desses genes irão proporcionar novos conceitos a respeito da biologia e dos mecanismos de sinalização e adaptação ao ambiente do hospedeiro em A. fumigatus..

O Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso que apresenta pouca incidência em indivíduos imunocompetentes. Entretanto, nas últimas décadas, esta incidência tem aumentado em pacientes com neutropenia, na doença granulomatosa crônica e na AIDS. Muito pouco é conhecido sobre a regulação dos níveis de cálcio neste fungo e tem sido descrito que os íons cálcio têm importância crucial no controle de vários processos biológicos. A sinalização celular promovida pela fosfatase calcineurina, mediada por cálcio, altera o nível de expressão de diversos genes. A modulação da transcrição gênica pela calcineurina está relacionada à ativação de proteínas ou fatores de transcrição específicos que possuem motivos de ligação (?docking site?) à calcineurina, semelhantes à PxIxIT encontrados no NFAT e CrzA. Para a elucidação desta via de sinalização, foram realizadas análises computacionais que revelaram a presença de ?docking sites? para calcineurina em diferentes proteínas e fatores de transcrição. Neste contexto, o presente projeto visa a caracterização molecular dos fatores de transcrição Rpn4 e Seb1 e do trocador Ca2+/H+ vacuolar VcxA em A. fumigatus, que apresentaram o motivo semelhante ao PxIxIT. Esta abordagem tem como objetivo avaliar as alterações fenotípicas destes mutantes como a virulência, crescimento e sensibilidade destas cepas na presença de agentes produtores de radicais livres e antibióticos, bem como o entendimento da transdução de sinal mediada por cálcio neste fungo. Além disto, serão determinadas e caracterizadas as proteínas que interagem com a calcineurina durante a sinalização celular. Para tanto, a abordagem adotada será a inserção de uma cauda S-tag na calcineurina, a qual permitirá sua posterior purificação, bem como das proteínas que interagem com ela, permitindo assim a sua identificação.

: O Aspergillus fumigatus é um fungo saprofítico, amplamente distribuído no mundo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação de conídios do fungo, com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Muito pouco é conhecido sobre a nestes microrganismos. Estudos da respiração mitocondrial de A. fumigatus realizados em nosso laboratório, sugerem a presença de vias alternativas como a oxidase alternativa e a NADH desidrogenase alternativa (TUDELLA et al., 2004). Estas vias alternativas podem estar envolvidas na adaptação destes organismos em ambientes instáveis como estresse ao frio, estresse oxidativo e condições anaeróbias, os quais influenciam na expressão ou atividade destes componentes alternativos (AMORA et al., 2000; CALEGARIO et al., 2003). A NADH desidrogenase alternativa de A. fumigatus, é semelhante àquelas descritas em plantas, fungos, eubactérias e arqueobactérias. Sabe-se que sua atividade encontra-se estimulada durante a fase de crescimento da célula, porém seu papel fisiológico ainda é pouco conhecido (WACKWITZ et al., 1999). A possível resistência de inúmeros fungos a drogas que atuam sobre as mitocôndrias, tem sido atribuída à presença de uma oxidase alternativa que previne a autoxidação da ubiquinona reduzida e a subseqüente formação de espécies reativas de oxigênio. O gene que codifica uma oxidase alternativa mitocondrial foi clonada e seqüenciada no projeto n 02/01452-5. No projeto 05/51677-4, a seqüência de cDNA do gene foi clonada em plasmídeos pET28a(+) e pYES2 e expressa em dois sistemas heterólogos, um procarioto, E. coli RosettaTM (DE3)pLysS e um eucarioto, S. cerevisiae INVSc1. Em ambos os sistemas a oxidase alternativa expressa conferiu uma respiração resistente a cianeto. Esta característica herdada provocou uma discreta diminuição na taxa de crescimento, mas uma capacidade de sobrevivência na presença de KCN. Desta forma, a fim de se caracterizar molecularme

The conidia are responsible for the reproduction, dispersal and environmental persistence of different fungal species. In pathogenic species, conidia also are the structures predominantly responsible for host infection. Following inhalation of conidia by the immunocompetent host, the innate cellular immune system (comprised of alveolar macrophages and neutrophils) is responsible for the killing of the conidia, exposing them to reactive oxygen and nitrogen species. In addition to oxidative stress, others environmental changes in the mammalian host relative to saprotrophic nice takes place such as temperature, nutrient availability, pH and osmolarity. The objective of the present study is to use DNA microarrays to identify genes differentially expressed during exposition to oxidative stresses. The inactivation of some of these genes will be used to confirm the importance of the genes in question for tolerance to oxidative stresses. In this sense, gene expression analysis, using microarray to examine the expression of the multiple genes encoding alternative pathway components in response to such stresses in Aspergillus fumigatus cultures will be useful to identify novel gene responses and roles proposed for the alternative pathways, and signalling mechanisms which may play a role in mitochondrial regulation.

O Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso e saprofítico, encontrado em todas as regiões do mundo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação de conídios do fungo com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Muito pouco é conhecido sobre a bioenergética mitocondrial do A. fumigatus. Entretanto, estudos preliminares de respiração mitocondrial realizados em nosso laboratório, sugerem a presença de uma oxidase alternativa semelhante àquelas descritas em plantas, tripanosomas, amebas e outros organismos. A função dessa oxidase no metabolismo desses organismos não está totalmente elucidada, mas tem sido sugerido que as principais funções da via alternativa estejam ligadas à diferenciação celular, termogênese e manutenção da concentração de ubiquinona suficientemente oxidada prevenindo a auto-oxidação da ubiquinona reduzida e a subseqüente formação de espécies reativas de oxigênio. No projeto anterior, nosso laboratório clonou e seqüênciou o gene da oxidase alternativa mitocondrial de Aspergillus fumigatus. A tradução da maior fase aberta de leitura resulta em um polipeptídeo deduzido de 353 aminoácidos, com pI calculado de 9,47 e peso molecular 40,8 Kda e seis regiões propostas como ligantes de metal (Fé). Além disso, a análise de hidropaticidade indicou a presença de dois domínios transmembrana, do aminoácido 147 ao 169 e do 209 ao 231. Estas características são compatíveis com a alternativa oxidase de outros fungos, sendo que a comparação da seqüência deduzida de aminoácidos apresentou homologia de 78% e 51% com A.niger e P. anserina, respectivamente. Assim, uma vez seqüenciado o gene da oxidase alternativa, o objetivo do presente projeto é a expressão em dois sistemas heterólogos (1) Em bactérias (2) Em Saccharomyces cerevisiae..

Nas duas últimas décadas, infecções oportunistas causadas por fungos têm sido freqüentemente diagnosticadas em pacientes imunocomprometidos, sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes hospitalizados em todo o mundo. Com o rápido aumento dos casos de AIDS, algumas micoses aumentaram dramaticamente, sendo a candidíase a principal infecção oportunista. Entretanto, novas espécies de fungos são regularmente identificadas como causa de doenças nesses pacientes, dentre esses patógenos emergentes são importantes causadores de micoses sistêmicas o fungo Aspergillus fumigatus, como a segunda espécie mais notificada em pacientes imunossuprimidos. Muito pouco é conhecido sobre a bioenergética e regulação dos níveis de cálcio nestes microrganismos. A possível resistência de inúmeros fungos a drogas que atuam sobre as mitocôndrias, têm sido atribuidas a presença de uma oxidase alternativa que previne a autoxidação da ubiquinona reduzida e a subseqüente formação de espécies reativas de oxigênio. O gene que codifica uma oxidase alternativa mitocondrial foi clonada e seqüenciada no projeto anterior (processo n 02/01452-5). Desta forma, o cDNA do gene da aox foi funcionalmente expresso em S. cerevisae. Recentemente, o nosso laboratório clonou, seqüênciou e expressou em organismos heterólogos o gene de uma Ca2+-ATPase da subclasse PMR1 de A. fumigatus (SORIANI et al., 2005). A PMR1 parece contribuir de forma decisiva na manutenção das concentrações citoplasmáticas de íons cálcio e manganês em fungos. Estes íons estão envolvidos na distribuição (Ca2+) e glicosilação de proteínas (Mn2+). Nesse sentido, tem sido sugerido que o mesmo possa ser um alvo útil para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Assim, foi construído um plasmídeo para indução da RNAi através da inserção de seqüência homóloga ao gene de pmr1, em direções invertidas, com um espaçador de GFP e marcador o gene alb1. A cepa CEA 17 pyr G+ foi transformada com o plasmídeo pGlapmr.

Nas duas últimas décadas, infecções oportunistas causadas por fungos têm sido freqüentemente diagnosticadas em pacientes imunocomprometidos, sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes hospitalizados em todo o mundo. Com o rápido aumento dos casos de AIDS, algumas micoses aumentaram dramaticamente, sendo a candidíase a principal infecção oportunista. Entretanto, novas espécies de fungos são regularmente identificadas como causa de doenças nesses pacientes, dentre esses patógenos emergentes são importantes causadores de micoses sistêmicas o fungo Aspergillus fumigatus, como a segunda espécie mais notificada em pacientes imunossuprimidos. Muito pouco é conhecido sobre a bioenergética e regulação dos níveis de cálcio nestes microrganismos. Entretanto, a presença de um grande número de mitocôndrias e vacúolos ácidos elétron-densos sugere os seus envolvimentos na regulação dos níveis de cálcio intracelular. Assim, serão realizados estudos envolvendo o movimento de cálcio e parâmetros cinéticos da Ca2+-ATPase, H+-ATPase e de outros possíveis transportadores nos vacúolos ácidos de Aspergillus fumigatus. Estudos moleculares envolvendo o compartimento ácido serão realizados através da caracterização do gene da Ca2+-ATPase vacuolar. Além disso, os estudos da função da oxidase alternativa mitocondrial em Aspergillus fumigatus serão abordados através de técnicas moleculares.