Guilherme Rabelo Coelho.

Auxílio à participação em reunião científica no exterior.

Auxílio à publicação de artigos.

O relógio circadiano é um importante mecanismo biológico capaz de marcar a passagem do tempo, tendo sido inicialmente descrito no organismo modelo Neurospora crassa. Nesse fungo, o relógio circadiano regula uma variedade de processos biológicos, como a conidiogênese e o metabolismo. O relógio circadiano é importante porque prepara o organismo para responder a mudanças em seu ambiente que ocorrem ao longo do dia. O relógio é baseado em um mecanismo de feedback positivo e negativo, regulado por processos transcricionais e traducionais. A principal proteína responsável pelo controle do ciclo circadiano é denominada FREQUENCY (FRQ). Os fungos do gênero Metarhizium são entomopatógenos utilizados no controle biológico de insetos-praga e vetores de doenças. Porém, existem algumas condições ambientais indutoras de estresse, como exposições à radiação ultravioleta (UV) e a altas temperaturas, nas quais a viabilidade do inóculo e o desenvolvimento de Metarhizium são prejudicados, reduzindo a eficiência do fungo como bioinseticida. Por isso, há uma busca constante pela elucidação dos processos biológicos responsáveis pela patogenicidade, virulência e tolerância do fungo a fatores abióticos indutores de estresse, como altas temperatura e radiação UV. Apesar de potencialmente ter um papel na regulação da tolerância ao estresse e da virulência, o ciclo circadiano de Metarhizium nunca foi estudado. Um estudo recente do nosso grupo descreveu a fotoindução do gene frequency (frq) em Metarhizium acridum, o que pode indicar a presença de um relógio circadiano funcional nessa espécie. Assim sendo, o presente projeto visa estudar o relógio circadiano em M. acridum e Metarhizium robertsii, incluindo seu papel na regulação da tolerância à fração UV da radiação solar e da virulência dessas espécies.

Apesar de extensas pesquisas ao longo de várias décadas, a diversidade de formulações e o escopo de produtos microbianos no mercado permanecem limitados pelas dificuldades que esta área apresenta. Para as plantações agrícolas e florestais, que mostram como ótimos cenários para o controle biológico, muitas questões ainda sem resposta poderiam ser otimizadas para o controle de pragas por micopesticidas. Além disso, a segurança de organismos benéficos, a compreensão das populações de microrganismos que ocorrem no Brasil e na Alemanha, o desenvolvimento de técnicas para a produção de espécies fúngicas não convencionais e que possam ter um alto potencial de uso devem ser estudados. Por estas razões, um movimento entre pesquisadores de diferentes áreas, focando em métodos inovadores baseados em experiências internacionais, é altamente necessário. Entender cada parte do problema é uma chave para soluções e idéias criativas. Com base nesse cenário, pesquisadores do Brasil e da Alemanha estão motivados a estudar profundamente o controle microbiano das pragas desde o isolamento e produção até a aplicação do produto no campo. Para isso, será aplicada uma metodologia de pesquisa que apresenta credibilidade, viabilidade e sustentabilidade, sendo estas as principais ferramentas para atingir os objetivos estabelecidos em 3 anos. Consequentemente, muitos grupos se beneficiarão com a transferência de tecnologia.

Diversos processos importantes em fungos, como o metabolismo primário e secundário, o desenvolvimento, a reprodução, a patogenicidade e a virulência, são regulados pela luz.Apercepção da luz também permite a adaptação morfológica e fisiológica de estruturas, como conídios e micélios, a condições futuras de estresse. No fungo entomopatogênico Metarhizium acridum, exposições à luz branca e azul induzem um aumento da tolerância à radiação UV-B(280-320 nm) e ao calor, o que éextremamente desejável já que a fotoinativação do inóculo pela radiação solar compromete a eficácia do fungo como micoinseticida. Entretanto, os mecanismos moleculares que resultamnesse efeito ainda não foram elucidados. Dessa forma, o objetivo geral desse projeto é elucidar os sistemas envolvidos na indução da tolerância à radiação UV pela luz em Metarhiziumpor meio do uso combinado das análises transcriptômica e proteômica. Os fotorreceptores envolvidos na percepção da luz serão identificados por meio da obtenção de linhagens do fungo comdeleções nos genes que codificamos principais fotorreceptores conhecidos (WhiteCollar-1, Cry-DASH, Cryptochrome-2 e para umaCDPphotolyase). As abordagens transcriptômica, por meio do sequenciamento deRNA(RNA-seq), e proteômica, por meio deLC-MS/MS, serão utilizadas, de forma integrada e complementar, nas mesmas amostras, para identificar os genes e as proteínas envolvidos na resposta à luz visível. Espera-se que os resultados, além de fornecerem informações sobre os mecanismos envolvidos na percepção e resposta à luz no fungo, contribuam para a obtenção de linhagens mais tolerantes ao estresse ambiental e, portanto, mais apropriadas para serem utilizadas como micoinseticidas.

A luz é um fator ambiental que regula o metabolismo, desenvolvimento, reprodução e até mesmo a patogenicidade e a virulência em diversas espécies de fungos. A exposição à luz também pode pré-adaptar estruturas fúngicas, como conídios e micélios, a condições futuras de estresse. No fungo entomopatogênico Metarhizium acridum, a exposição à luz visível induz um aumento da tolerância à radiação UV-B (280-320 nm). Como Metarhizium é utilizado para o controle de insetos-praga, a indução da tolerância é extremamente desejável, já que um dos fatores que comprometem a sua eficácia como micoinseticida é a inativação do inóculo pela radiação solar. Apesar da importância prática que a indução da tolerância à radiação UV tem para o uso de Metarhizium spp., os mecanismos moleculares que resultam nesse efeito ainda não foram determinados. O objetivo geral do projeto é elucidar as bases moleculares da indução da tolerância à radiação UV pela luz visível em Metarhizium. A identificação dos fotorreceptores envolvidos na percepção da luz será feita por meio da obtenção de linhagens do fungo com deleções nos genes para os principais fotorreceptores conhecidos (White Collar-1, Cry-DASH, Cryptochrome-2 e para uma CDP photolyase). Adicionalmente, as abordagens transcriptômica, por meio do sequenciamento de RNA (RNA-seq), e proteômica, por meio de LC-MS/MS, serão utilizadas, de forma integrada e complementar, nas mesmas amostras, para identificar os genes e as proteínas envolvidos na resposta à luz. Espera-se que os resultados, além de fornecerem informações sobre os mecanismos envolvidos na percepção e resposta à luz no fungo, contribuam para a obtenção de linhagens mais tolerantes ao estresse ambiental e, portanto, mais apropriadas para serem utilizadas como micoinseticidas.

As espécies de fungos filamentosos Fonsecaea pedrosoi e Fusarium sp. são importantes causadores de micoses oportunistas em humanos. O aumento crescente da tolerância às drogas antifungicas e a emergência de novas espécies de fungos patogênicos torna extremamente necessária a identificação e o desenvolvimento de novas estratégias para o controle desses patógenos, com mecanismos de ação diferentes dos já existentes. A inativação fotodinâmica antimicrobiana (IFA) surge como uma alternativa promissora ao uso de fungicidas convencionais. A IFA envolve a utilização de um fotossensibilizador (FS) que acumula preferencialmente nas células-alvo e é ativado por exposição à luz com comprimento de onda adequado. A ativação do FS na presença de oxigênio molecular induz a geração de espécies reativas de oxigênio, que são capazes de danificar as biomoléculas, provocando a morte da célula microbiana. Apesar de promissora, a IFA ainda é pouco utilizada para o tratamento de micoses. Os principais objetivos desse projeto são: (i) Avaliar a eficácia pela da IFA com os FS fenotiazínicos na inativação de conídios e conídios germinados de Fonsecaea pedrosoi, Fusarium moliniforme, F. oxysporum e F. solani; (ii) Determinar a localização intracelular dos FS nas estruturas especializadas de Fonsecaea pedrosoi, Fusarium moliniforme, F. oxysporum e F. solani; (iii) Avaliar os efeitos da IFA com os diferentes FS na integridade da parede celular, membrana plasmática e na integridade do material genético (DNA genômico); (iv) Análise proteômica por gel bidimensional em conídios germinados de Fonsecaea pedrosoi, Fusarium moliniforme, F. oxysporum e F. solani na IFA com doses sub-letais de FS fenotiazínicos; (v) Determinar o efeito da IFA na transcrição dos respectivos genes codificadores das proteínas identificadas como diferencialmente expressas na IFA com doses sub-letais de FS fenotiazínicos em conídios germinados das diferentes espécies.

Os objetivos específicos deste projeto atendem a diferentes áreas: a) determinação da irradiância espectral efetiva de amostras biológicas (células, fungos, tecidos, DNA); b) caracterização espectral de lâmpadas e leds empregados em estudos de fotoquímica e fotobiologia; c) desenvolvimento de protótipos de borda-da-lâmina, unidimensional (1D) e bidimensional (2D), para caracterização espacial de fontes; d) caracterização radiométrica de lasers, leds e lâmpadas empregadas na pesquisas clínica e laboratorial na Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP) e Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP); e) apoio experimental no estabelecimento da dosimetria pessoal de todos os laboratórios da Universidade de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto, que possuem fontes de radiação ultravioleta e infravermelha; f) determinação de protocolos experimentais e auxílio a empresas produtoras de equipamentos médicos e hospitalares com emissão ótica no atendimento às normas técnicas; g) consolidação de um Laboratório de Dosimetria Ótica com diferentes procedimentos de pesquisa e prestação de serviços para a comunidade científica e para o setor produtivo.

O aumento crescente da tolerância aos fungicidas, observado em diversos gêneros de fungos patogênicos, tanto de interesse médico como agrícola, tem estimulado o desenvolvimento de novas estratégias para o controle desses patógenos. O tratamento fotodinâmico antimifúngico (TFA) é uma alternativa promissora ao uso de fungicidas convencionais e pode ser utilizado tanto para controlar micoses localizadas como para reduzir populações de patógenos no meio ambiente. O TFA envolve a utilização de um ativo fotossensibilizante (FS) que se acumula seletivamente nas células-alvo e é ativado por exposições à luz com comprimento de onda apropriado. A ativação do FS, na presença de oxigênio molecular, induz à formação de espécies reativas de oxigênio, que provocam a morte do micro-organismo alvo, com poucos danos ao hospedeiro. Apesar de muito promissor, o TFA ainda é pouco utilizado para o tratamento de micoses e o seu princípio ainda não foi explorado para o controle de fitopatógenos. Os objetivos deste projeto são: (1) identificar novos FS mais eficazes para o TFA de micoses localizadas em humanos e para a inativação fotodinâmica de fungos fitopatogênicos; (2) determinar o mecanismo de ação do TFA com os novos FS, tanto em estruturas metabolicamente ativas, como hifas e leveduras, como em estruturas quiescentes, como conídios, de espécies dos gêneros Candida, Trichophyton, Colletotrichum e Aspergillus; (3) avaliar e caracterizar os danos do TFA em células e tecidos dos hospedeiros e (4) isolar (de espécies do gênero Citrus), identificar e avaliar o potencial de cumarinas e furanocumarinas para o TFA de fungos fitopatogênicos. As contribuições esperadas incluem: melhorar a eficácia do TFA para o tratamento de micoses em humanos, estabelecer os fundamentos necessários para que o TFA possa ser utilizado para o controle de fungos fitopatogênicos e ampliar a compreensão da mecanística do TFA com os novos FS nas estruturas especializadas dos diferentes fungos de interesse.

O fungo filamentoso Scytalidium spp. é um microrganismo saprofítico e fitopatogenico, encontrado no solo e vegetação de clima tropical e subtropical. Este gênero encontra-se dentre os principais agentes filamentosos não dermatófitos causadores da doença, juntamente com os gêneros Scopulariopsis, Fusarium, Aspergillus e Onychocola. Espécies de Scytalidium sp. estão sendo associadas à patogenia primária de unha, o qual a prevalência das infecções vem aumentando nas últimas décadas, embora ainda pouco seja relatado. Há relatos de infecções profundas e superficiais pelo gênero Scytalidium em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes, incluindo abscesso no sistema nervoso central, endoftalmites, sinusites, osteomielites, fungemias, infecções subcutâneas, eumicetoma, linfangite, linfadenite, tinea pedis, onicomicoses, entre outras. O Scytalidium dimidiatum tem sido mais associado a infecções profundas quando comparada a sua variante hialina, S. hyalinum. A variante hialina está envolvido preferencialmente em infecções de pele e unha sugerindo que o isolado deficiente de melanina pode ser menos virulento que o pigmentado. Pouco é descrito na literatura sobre a sensibilidade a drogas antifúngicas e não há relatos de avaliação do uso da terapia fotodinâmica para Scytalidium dimidiatum e Scytalidium hyalinum, embora trabalhos demonstrem o aumento da resistência de fungos não dermatófitos quando comparadas aos dermatófitos. Devido a maior resistência de Scytalidium para algumas drogas, quando comparada aos fungos dermatófitos, o diagnóstico diferencial é imprescindível para o sucesso do tratamento. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho é investigar possíveis polimorfismos entre isolados clínicos de S. hyalinum e S. dimidiatum, analisar o perfil de susceptibilidade a antifúngicos e fotossensibilizadores de cepas de Scytalidium dimidiatum e Scytalidium hyalinum isolados de amostras clínicas, assim como investigar fatores envolvidos que justificariam diferença na resistência e patogenicidade entre eles, como tolerância a diferentes pH, temperaturas e expressão diferencial de proteínas.

The initial step of the proposed project will be a collection of hundreds of new isolates from all major Brazilian biomes and agricultural areas. Unlike culture-collection isolates, the new isolates will be fresh from nature, i.e., not adapted to laboratory culture conditions. Secondly, the tolerances to UV-B radiation and heat of these native isolates will be measured. Thirdly, an integrated approach involving both proteomics and metabolomics will be used to identify the main proteins and metabolites (primary and secondary) present in isolates with exceptionally high or low constitutive tolerance of their conidia and/or mycelia to solar radiation and high temperature. The effects of increased environmental levels of UV-B radiation and temperature on the metabolism, reproduction and interaction with host insects of these exceptional isolates will be examined in detail. The results are expected to (a) clarify proteins and metabolites involved in tolerance to two changing environmental factors, UV-B and heat; (b) indicate potentially vulnerable natural populations of Metarhizium in Brazil; and (c) identify appropriate Metarhizium strains for biocontrol in specific environmental conditions. The findings of the proposed research will be directly applicable to understanding, and perhaps manipulating, the consequences of climate change on other important fungi; i.e. plant pathogens.

Os objetivos do projeto visam organizar as competências academico científicas existentes para criar a cadeia de inovação radical em férmacos e medicamentos no país e realizar estudos prospectivos de oportunidaddes reais em novos genéricos ou novas rotas sintéticas para genéricos conhecidos. O projeto é coordenado pelo Prof. Dr. Eliezer Jesus de Lacerda Barreiro (UFRJ) e conta com a participação de 24 IES, de 10 unidades federativas e 141 pesquisadores.

Uso de microarrays genômicos e microarrays de ESTs para a identificação de genes envolvidos na tolerância à radiação solar e na persistência ambiental de conídios dos fungos A. nidulans e M. anisopliae

Os principais objetivos do projeto são: (1) identificação de genes envolvidos na proteção constitutiva e na resposta adaptativa à radiação solar; (2) Análise qualitativa e quantitativa de pigmentos como carotenóides e melaninas presentes em conídios de linhagens selvagens e de mutantes; (3) Estimativa da correlação entre pigmentação e tolerância à radiação e (4) Estimativa da importância de fatores ambientais durante o crescimento, particularmente a luz, para a tolerância à radiação solar dos conídios produzidos.

O projeto envolve o estudo de dois tópicos distintos da fotobiologia de fungos: (1) a identificação de genes e de sistemas celulares envolvidos na proteção e na resposta fúngica à radiação solar e (2) a triagem e a identificação de fotossensibilizadores com potencial para ser utilizados na fototerapia dinâmica antimicrobiana e a identificação dos genes e dos sistemas envolvidos na resposta celular à fotossensibilização. Classificação do Projeto: Auxílio à Jovens Pesquisadores em Centros Emergentes FAPESP Proc. 03/07702-9 (Responsável)

Um dos fatores limitantes para o uso comercial de fungos no controle de pragas agrícolas e de vetores de doenças é a alta suscetibilidade de seus conídios à radiação solar (principalmente a UV-B). A proposta central deste trabalho é estudar os efeitos da UV-B sobre o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae e ao mesmo tempo desenvolver mecanismos que tomem seus conídios mais tolerantes à radiação. O aumento da tolerância será tentado através de modificações genéticas que aumentem os fatores protetores presentes nos conídios (catalases, SOD, carotenóides), através da pré-adaptação dos conídios ao estresse oxidativo imposto pela luz UV-B e através do uso de protetores nas formulações.

NRICGP (Grant 99-35305-8052)