Fabíola Traina.

A síndrome mielodisplásica (SMD) é um grupo heterogêneo de neoplasias hematológicas caracterizadas por hematopoese ineficaz, citopenias e risco de evolução para leucemia mieloide aguda e que acomete principalmente a população idosa. A disfunção mitocondrial e a exaustão de células-tronco são duas características do envelhecimento comumente encontradas na SMD. A hematopoese clonal é perpetuada pela inflamação e está envolvida no desenvolvimento e na progressão de SMD. Recentemente, foi identificado que a metformina suprimiu o crescimento de células com hematopoese clonal. Contudo, a contribuição do metabolismo mitocondrial na fisiopatologia, na sobrevivência celular e no manejo de pacientes com SMD ainda não foi investigada. Os objetivos da pesquisa serão investigar e comparar o metabolismo mitocondrial, o perfil inflamatório e proteico, e presença de mutações em genes relacionados à hematopoese clonal, e por fim, avaliar o efeito de inibidores do complexo mitocondrial na clonogenicidade das células mielodisplásicas. Células da medula óssea de pacientes com SMD serão submetidas à exoma para investigação de mutações em genes relacionados à hematopoese clonal e neoplasias mieloides, imunoensaio para avaliação de citocinas inflamatórias, avaliação do metabolismo mitocondrial em células totais da medula óssea e em diferentes compartimentos da hematopoese: microambiente tumoral, microambiente imune inato e adaptativo. Os efeitos do tratamento ex vivo com inibidores do complexo respiratório da cadeia transportadora de elétrons em células mielodisplásicas serão avaliados por meio ensaio clonogênico. Análises de bioinformática para os dados ômicos e análises estatísticas serão realizadas conforme apropriado.

A doença falciforme (DF) é a hemoglobinopatia mais prevalente no mundo e, apesar do progresso no seu manejo, possui alto risco de morbidade e mortalidade. Além das complicações relacionadas à doença, estima-se que os pacientes tenham um aumento de 3-10 vezes no risco de desenvolvimento de neoplasias hematológicas. O transplante de células progenitoras hematopoéticas (TCPH) alogênico e a terapia gênica são os únicos tratamentos potencialmente curativos para a doença. Entretanto, um estudo com terapia gênica para tratamento da DF foi temporariamente interrompido após a identificação de neoplasia hematológica em 2 pacientes. O desenvolvimento de neoplasias hematológicas também foi relatado em pacientes submetidos ao TCPH alogênico, sendo que a avaliação de dois destes casos demonstrou a presença de clones neoplásicos antes do transplante, que tiveram expansão após o procedimento. Um estudo avaliou 3.090 pacientes com DF e mais de 7.000 controles saudáveis, não sendo identificado um número maior de hematopoiese clonal nos pacientes com DF. A taxa de hematopoiese clonal em pacientes submetidos ao TCPH alogênico para tratamento da DF e o seu impacto nos resultados do transplante não são conhecidos. Inflamação crônica relacionada à doença e ao transplante; regime de condicionamento mieloablativo; uso de drogas imunossupressoras para profilaxia de doença do enxerto contra o hospedeiro podem ser fatores contribuidores. Para que possamos melhorar a segurança e a eficácia dos tratamentos com terapia celular para a DF, é fundamental o estudo da presença e do desenvolvimento de hematopoiese clonal no TCPH alogênico a curto e a longo prazo, sendo este o objetivo do estudo. Para isso, amostras de sangue periférico serão coletadas e submetidas à extração e purificação de DNA. Testes de citogenética molecular, sequenciamento em larga escala de um painel de genes e do exoma para avaliação de alterações moleculares e hematopoiese clonal serão realizados antes e após o TCPH.

A LMA é um dos tipos mais comuns e agressivos de leucemia em adultos. O mau prognóstico e a resposta clínica da LMA estão intimamente associados às características genéticas e moleculares desta doença, como alterações cromossômicas e mutações recorrentes em genes relacionados às funções hematopoéticas. Essa correlação tem conduzido os pesquisadores à terapia molecular direcionada, enriquecendo gradualmente o padrão atual de tratamento clínico, a fim de aumentar as chances de sucesso. Agentes farmacológicos que têm como alvo proteínas alteradas ou vias de sinalização, como FLT3, mostraram-se promissores, mas ainda apresentam eficácia limitada na prática clínica. Nossa hipótese é de que os inibidores de FLT3 induzam a autofagia e o aumento do fluxo autofágico seja um mecanismo que limita a eficácia terapêutica da droga, e que a terapia combinada com inibidores de autofagia potencializa o efeito anti-leucêmico dos inibidores de FLT3. Derivado de seu evidente aspecto translacional, o projeto possui o mérito de propor a comprovação de que a indução de autofagia é um mecanismo que limita a eficácia terapêutica de inibidores farmacológicos de FLT3 em pacientes com leucemia mieloide aguda com mutação FLT3, investigar os mecanismos celulares e moleculares associados, e testar a combinação de inibidores farmacológicos da autofagia com inibidores farmacológicos de FLT3 como alternativa no tratamento de leucemia mieloide aguda. Caso ocorra potencialização da atividade apoptótica, a terapia combinada pode revelar-se uma estratégia promissora, além de contribuir para a elucidação de mecanismos de resistência adquiridos por células leucêmicas aos inibidores de FLT3. Coletivamente, esses fatos nos fazem crer no potencial científico para publicação dos resultados em conceituadas revistas de veiculação internacional, bem como em congressos internacionais e nacionais da área. O projeto também trará benefícios no que se refere ao desenvolvimento profissional de alunos de pós graduação com envolvimento de 3 alunos de doutorado e 2 de mestrado.

Os processos de autofagia e de ativação de inflamassoma participam da homeostase intracelular e inflamação, e a desregulação desses processos está associada à patogênese de neoplasias. A interação entre estes dois processos influencia as respostas pró-tumor ou antitumorais dependendo dos tipos de câncer. A autofagia neutraliza a hiperativação dos inflamassomas, e a ativação dos inflamassomas pode levar à liberação de fator tecidual (um iniciador essencial da coagulação) por macrófagos piroptóticos, situando os inflamassomas na interface entre inflamação e trombose. A inibição recíproca entre ativação do inflamassoma e autofagia, e o papel controverso e dependente do contexto recentemente destacado da autofagia na leucemia apontam para a modulação da autofagia como um possível alvo terapêutico em leucemia mieloide aguda (LMA). A leucemia promielocítica aguda (LPA) é um subtipo de LMA na qual a ativação da hemostasia é responsável por alta morbimortalidade. A correlação entre autofagia, inflamassoma e hemostasia em LMA ainda é pouco explorada. Neste projeto, propomos investigar a participação dos processos de autofagia, inflamassoma e hemostasia em LMA. Utilizaremos uma abordagem exploratória através de análise da correlação da expressão de genes moduladores da autofagia, inflamassoma e hemostasia, obtidos por RNAseq, de coortes públicas de pacientes com LMA, incluindo LPA. Os estudos exploratórios têm o potencial de gerar as evidências de correlação entre estes três processos na LMA e gerar novas perguntas científicas. Prevemos ainda investigar a participação da proteína inflamatória podoplanina (PDPN) na leucemogênese e coagulopatia em LMA e LPA, através de estudo de sua expressão e da correlação com marcadores da coagulação e desfechos clínicos. Por fim, prevemos realizar estudos funcionais para investigar o processo de autofagia como mecanismo de resistência a inibidores tirosinoquinase em modelos celulares de LMA.

Leucemia neutrofilica crônica (LNC), leucemia mieloide crônica atípica (LMCa), leucemia mielomonocítica crônica (LMMC) e síndrome mielodisplásica (SMD)/neoplasia mieloproliferativa (NMP) não-classificável são neoplasias mieloides raras com sobreposição de características laboratoriais e moleculares, o que dificulta o diagnóstico diferencial e o desenvolvimento de terapias para os pacientes. Mutações no gene CSF3R, que codifica o receptor de fator estimulante de colônias granulocíticas (G-CSFR), ocorrem em LNC e LMCa e tem como consequência a ativação das vias de sinalização JAK/STAT, PI3K/AKT/mTOR e MAPK. A metformina tem sido associado à atividade antitumoral, incluindo neoplasias hematológicas. Recentemente, identificamos que a metformina apresenta efeitos anti-neoplásicos in vitro e in vivo, através de mecanismos que incluem a inibição de JAK/STAT e a função oxidativa mitocondrial. O objetivo deste projeto será avaliar os efeitos celulares e moleculares do tratamento com metformina em neoplasias mieloides raras, em especial as neoplasias com mutação CSF3R com ativação da via JAK/STAT. Será avaliado o efeito da metformina in vitro na capacidade de formação de colônias, atividade mitocondrial, expressão e ativação proteica, proliferação, apoptose e ciclo celular em células primárias de pacientes com neoplasia mieloide rara e em linhagem celular Ba/F3 transduzida para expressar CSF3R T618I. Será avaliado ainda, o efeito da metformina in vivo no fenótipo e sobrevida de modelo murino de leucemia neutrofílica crônica induzida pela mutação CSF3R T618I e na capacidade de autorrenovação da célula tronco hematopoética em modelo murino humanizado.

Neoplasias mieloproliferativas (NMP) constituem um grupo de distúrbios hematológicos caracterizados por alterações moleculares na célula-tronco hematopoética, resultando em proliferação exacerbada de uma ou mais linhagens mieloides. Mutações em JAK2 (Janus Kinase 2), CALR (calreticulina) e MPL (myeloproliferative leucemia vírus oncogene) são frequentes em pacientes com NMP e resultam em ativação constitutiva da via JAK/STAT e fenótipo neoplásico. As biguanidas incluem as drogas metformina, buformina e fenformina, que são compostos ativos antiglicêmicos com potencial de exercerem efeitos antineoplásicos. Recentemente, nosso grupo de pesquisa identificou que a metformina exerce efeitos antineoplásicos in vitro e in vivo em modelos de linhagens celulares e camundongo JAK2V617F knockin. A fenformina é a mais potente biguanida e pode ter uma eficácia antineoplásica aumentada em comparação com a metformina. Os objetivos deste trabalho são investigar os efeitos antineoplásicos da fenformina em NMP JAK2V617F. Em camundongos JAK2V617F knockin, avaliaremos o efeito do tratamento com fenformina in vivo e/ou ex vivo no fenótipo neoplásico, incluindo a avaliação de parâmetros hematológicos, ativação de vias de sinalização e capacidade de autorrenovação da célula tronco hematopoética. Em células primárias de pacientes com PV, avaliaremos o efeito do tratamento com fenformina in vitro na capacidade de formação de colônias eritroides independentes de eritropoietina. Os dados serão analisados através de comparações entre as médias dos grupos experimentais, utilizando teste t-Student ou ANOVA, conforme apropriado.

As neoplasias mieloproliferativas clássicas se originam da célula-tronco hematopoética, são caracterizadas pela ativação da via se sinalização JAK/STAT e proliferação de uma ou mais células da linhagem mieloide. Os pacientes podem apresentar alteração das contagens hematimétricas, esplenomegalia e eventos tromboembólicos e evoluir com aumento da fibrose na medula óssea e leucemia mieloide aguda. O único tratamento com potencial de cura é o transplante de células tronco hematopoéticas, o qual é associado a alta morbimortalidade e reservado para pacientes jovens com doador compatível. O inibidor seletivo de JAK1/2 reduz os sintomas constitucionais sem modificar a história natural da doença e não é disponível no sistema único de saúde devido ao custo elevado. Nosso grupo de pesquisa determinou os benefícios pré-clínicos da metformina em células JAK2V617F: redução da viabilidade celular, inibição da via JAK/STAT e da atividade mitocondrial in vitro e redução da esplenomegalia in vivo. O objetivo será avaliar a eficácia, segurança e tolerabilidade da metformina em pacientes com mielofibrose primária (MFP), mielofibrose pós-policitemia vera e mielofibrose pós-trombocitemia essencial. Indivíduos do sexo feminino e masculino, maiores de 18 anos, que tenham sido diagnosticados com MFP, mielofibrose pós-PV e mielofibrose pós-TE serão elegíveis. O estudo será executado em duas fases, sendo previsto a inclusão de 10 pacientes na primeira fase, e caso 1 dos pacientes responda, 5 pacientes adicionais serão recrutados na segunda fase. A droga será considerada efetiva se pelo menos 2 pacientes responderem. Resposta será definida como redução e 35 no volume do baço a partir do início do tratamento até a semana 24, medido por tomografia computadorizada sem contraste ou ressonância magnética de abdome. Avaliações exploratórias incluirão a avaliação do balanço hemostático.

A hematopoese é um processo finamente regulado por citocinas e fatores de crescimento. A regulação dessas moléculas depende, dentre outros fatores, da ação de proteínas adaptadoras citoplasmáticas, como os substratos de receptores de insulina (IRS). A ativação de IRS promove o recrutamento de proteínas efetoras envolvidas na regulação das vias JAK/STAT, PI3K/AKT/mTOR e MAPK. Estas vias de sinalização estão envolvidas na hematopoese normal e encontram-se desreguladas em neoplasias hematológicas, como a síndrome mielodisplásica, caracterizada por uma hematopoese ineficaz, que resulta em citopenias no sangue periférico. Trabalhos prévios conduzidos pelo nosso grupo de pesquisa indicam que IRS1 e IRS2 encontram-se diferencialmente expressos em neoplasias hematológicas, incluindo as síndromes mielodisplásicas e leucemias agudas. Nosso grupo também demonstrou que IRS2 é recrutado durante o processo de diferenciação eritroide, megacariocítica e granulocítica; e participa na transdução de sinal da sinalização aberrante induzida pela mutação JAK2V617F. No entanto, o papel de IRS1 e IRS2 na transdução de sinal dos receptores de fatores de crescimento hematopoéticos e sua participação na diferenciação e transformação maligna de células hematopoéticas permanece pouco explorado. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo principal, investigar a participação das proteínas IRS1 e IRS2 na hematopoese normal e mielodisplásica utilizando modelos murinos e células tronco hematopoéticas humanas. Para avaliação da hematopoese in vivo, serão utilizados modelos murinos nocautes Irs1 e Irs2 e animais submetidos a inibição farmacológica de Irs1/Irs2. Para avaliação dos efeitos da inibição dessas proteínas sobre o fenótipo de progenitores hematopoéticos humanos normais, células CD34+ serão submetidas ao silenciamento de IRS1 e IRS2 e avaliadas através de ensaios funcionais de diferenciação, capacidade de formação de colônia, proliferação e apoptose. Com o propósito de investigar o perfil de expressão de genes envolvidos na sinalização mediada por IRS em um modelo de neoplasia com hematopoese ineficaz, iremos investigar e comparar a expressão gênica de IRS1, IRS2 e genes relacionadas entre células CD34+ de indivíduos normais e de pacientes com síndrome mielodisplásica, através de PCR array.

Programas Regulares/Auxílios a Pesquisa/Publicações Científicas/Artigo

As neoplasias mieloproliferativas crônicas BCR-ABL1 negativas (NMP) apresentam como característica comum a ocorrência de proliferação celular exacerbada, mantendo a capacidade de diferenciação mieloide terminal. Em parcela significativa dos casos, a ativação da proliferação celular ocorre pelo aumento da atividade tirosina quinase de proteínas específicas. Entretanto, a heterogeneidade molecular observada nos pacientes e as respostas clínicas insatisfatórias observadas em parte dos casos com os tratamentos vigentes sugerem que mecanismos adicionais, como interações proteicas não descritas e novas mutações, possam estar envolvidos na fisiopatologia destas neoplasias. O substrato do receptor de insulina 2 (IRS2) é uma proteína adaptadora citoplasmática identificada inicialmente por seu papel na sinalização da insulina, mas também pode interagir com os receptores EPOR, MPL e IGF1R e ativar as vias JAK/STAT, PI3K/Akt/mTOR e MAPK. Estudos recentes do nosso grupo de pesquisa evidenciaram a interação JAK2/IRS2 em modelos de células JAK2V617F. Os objetivos deste projeto são avaliar os efeitos do tratamento combinado de ruxolitinib e inibidores de IRS2 ou mTOR em células JAK2V617F e estabelecer um modelo murino de animais knockout Irs2. Linhagens leucêmicas e células primárias humanas serão utilizadas para os estudos funcionais; modelo murino de animais knockout Irs2 será estabelecido. Os métodos incluem avaliação da sobrevivência celular e da ativação de vias de sinalização em células leucêmicas humanas submetidas a diferentes condições de inibição das proteínas de interesse através da metodologia de terapia gênica e/ou uso de inibidores específicos, estabelecimento de modelo murino knockout Irs2 e avaliação da hematopoese neste modelo.

As neoplasias mieloides são doenças clonais resultantes da aquisição de alterações moleculares que resultam em diferenciação e proliferação anormal de uma célula tronco hematopoética e podem ser agrupadas em três grandes grupos: síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas crônicas e leucemias mieloides agudas, totalizando trinta diferentes entidades diagnósticas. A citogenética convencional é exame indispensável para a investigação de alterações cromossômicas nos pacientes com suspeita de neoplasia hematológica, sendo capaz de evidenciar a clonalidade da doença, definir diagnóstico, prognóstico e tratamento, além de fornecer dados que permitiram a elucidação da fisiopatologia e desenvolvimento de terapia alvo de doenças específicas, como a identificação da t(9;22) na leucemia mieloide crônica e t(15;17) na leucemia aguda promielocítica. Apesar do significativo valor clínico das alterações cromossômicas detectadas através da citogenética convencional, sabe-se que o conhecimento das alterações moleculares e seu impacto clínico ainda representam uma área da medicina que exige uso integrado de novas metodologias de estudo do genoma, a identificação de novas alterações moleculares e o entendimento biológico e funcional destas alterações. O objetivo deste projeto é o uso integrado da citogenética convencional aliada a novas tecnologias baseadas em array de DNA, o Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-A), na identificação de alterações cromossômicas em neoplasias hematológicas, ,especialmente neoplasia mieloide. Acredita-se que o uso integrado destas metodologias permitirá a detecção de alterações cromossômicas adicionais com valor diagnóstico e prognóstico no atendimento de pacientes, além de indicar genes com potencial de desenvolvimento de estudos específicos na elucidação de mecanismos fisiopatológicos envolvidos com a hematopoese normal e neoplásica.

A Organização Mundial de Saúde distingue quatro grupos de neoplasias mieloides: neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP), síndromes mielodisplásicas (SMD), NMP/SMD e leucemia mieloide aguda (LMA). As NMP são desordens clonais malignas que acometem uma ou mais linhagens mieloides, levando a uma vantagem proliferativa na diferenciação terminal. As SMD resultam de alterações na célula pluripotente, caracterizadas por hematopoese ineficaz, citopenias e displasias. NMP/SMD são doenças clonais que apresentam características comuns aos dois grupos de doenças. As NMP, SMD e NMP/SMD podem evoluir para LMA, grupo de doenças caracterizadas pela expansão clonal de blastos mieloides e que apresenta alta mortalidade. O conceito de drogas que atuam nas células neoplásicas e preservam a célula normal é atraente e existem muitos potenciais alvos a serem estudados. Recentemente, um conjunto de dados tem mostrado que a presença de alterações citogenéticas fornece dados prognósticos e pode apresentar implicações terapêuticas em neoplasias mieloides. Além disso, alterações epigenéticas causam impacto significativo na estrutura da cromatina e na atividade transcricional, podendo regular e modular o processo neoplásico. Proteínas sabidamente envolvidas em outras neoplasias ou em importantes vias de sinalização celular também podem participar da fisiopatologia das neoplasias mieloides. Estudos investigando as consequências clínicas e biológicas de cada alteração molecular são fundamentais para o melhor entendimento da biologia dessas doenças, identificação de marcadores prognósticos, preditores de resposta a drogas e novos alvos terapêuticos. Nosso objetivo consiste em contribuir na elucidação de mecanismos genéticos, epigenéticos e de sinalização celular envolvidos na fisiopatologia das neoplasias mieloides.

A doença falciforme é caracterizada pela presença de crises vaso-oclusivas e hemólise intravascular com conseqüente depleção de óxido nítrico, disfunção e ativação endotelial. Praticamente todos os elementos da coagulação, incluindo o endotélio, os elementos celulares, o sistema anticoagulante e fibrinolítico estão alterados na direção pró-coagulante na doença falciforme, de forma que uma incidência aumentada de trombose tem sido descrita nesta doença. Possíveis fatores envolvidos no estado de hipercoagulabilidade na doença falciformes são: (1) o aumento da exposição de fosfatidilserina, que serve como ancoradouro para os fatores da coagulação, (2) o aumento da atividade pró-coagulante e da expressão do fator tecidual, o iniciador fisiológico da coagulação e (3) o aumento na expressão de micropartículas derivadas de diversas origens celulares. A principal droga atualmente disponível capaz de reduzir as complicações vaso-oclusivas e a hemólise intravascular é a hidroxiuréia. São vários os benefícios do seu uso, incluindo a elevação da hemoglobina fetal, aumento do óxido nítrico e redução da expressão de moléculas de adesão endotelial, mas os seus efeitos no estado pró-coagulante são pouco conhecidos. Este estudo tem como objetivo avaliar o efeito que a hidroxiuréia tem nos diversos componentes do balanço hemostático na doença falciforme, a saber: (1) expressão do fator tecidual; (2) geração final de trombina; e (3) ativação endotelial. Indivíduos sadios e doentes falciformes com e sem o uso de hidroxiuréia serão submetidos à dosagem de fator tecidual através de citometria de fluxo, PCR em tempo real e ELISA; a expressão de micropartículas em diferentes tipos celulares será avaliada através de citometria de fluxo; as avaliações do complexo trombina-antitrombina (TAT), fragmento 1+2 da protrombina (F1+2) e dímero D (DD) serão utilizados para mensurar a geração de trombina; a dosagem do trombomodulina e do fator de Von Willebrand serão utilizados para avaliação da ativa

Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes ativamente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. A proteína Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada, em humanos, em linhagem celular de adenocarcinoam de próstata, LNCaP. Recentemente, o nosso grupo de pesquisa identificou que ANKHD1 é uma proteína citoplasmática altamente expressa em linhagens de leucemias agudas humanas (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células hematopoéticas normais. Adicionalmente, através de ensaio de duplo híbrido em levedura, identificamos a associação da ANKHD1 com a proteína pró-apoptótica SIVA. Estes dados sugerem que ANKHD1 pode estar envolvida em vias de sinalização de apoptose celular em neoplasias, de forma que os objetivos do presente trabalho são confirmar a interação protéica entre ANKHD1 e SIVA e estudar se ANKHD1 exerce uma função na apoptose celular em células leucêmicas (Jurkat) e em células de adenocarcinoma de próstata (LNCaP). A confirmação da interação entre ANKHD1 e SIVA será realizada através de hiperexpressão das mesmas em células HEK-293N e através de imunoprecipitação e imunoblotting da proteína endógena em células Jurkat e LNCaP. Ensaios funcionais para o estudo da ativação da apoptose celular serão realizados em células submetidas ou não a inibição da expressão de ANKHD1 através de RNAi.