Ariel Mariano Silber.

O foco conceitual desta proposta é examinar as interfaces entre três áreas de pesquisa que normalmente são abordadas como compartimentos separados: metabolismo, epigenética e ciclo celular. A bem demonstrada flexibilidade metabólica desses parasitas por si só não explica sua notável capacidade de sobrevivência em ambientes difíceis como os que enfrentam dentro dos diferentes hospedeiros que parasitam. Sua capacidade de reprogramar funções celulares, incluindo o metabolismo, retendo uma 'memória' desta reprogramação durante vários ciclos de replicação e / ou infecção, bem como sua capacidade de modular a progressão do ciclo celular em função do ambiente as condições nutricionais são por si só problemas biológicos importantes e interessantes.O objetivo geral é cmompreender a interligação entre o metabolismo celular, a regulação do ciclo celular e diferenciação e as regulações epigenéticas em tripanossomatídeos patogênicos.

Diversos estudos têm descrito a importância dos aminoácidos na biologia de diferentes protozoários como o Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Os aminoácidos, além de atuarem na síntese protéica e no metabolismo energético, possuem diversas outras funções no parasito. Dentre eles, vale a pena mencionar a diferenciação entre formas replicativas e infectivas, o sustento energético da invasão das células do hospedeiro mamífero, o estabelecimento da infecção e a resistência a diferentes tipos de estresse aos quais o parasita é naturalmente submetido ao longo do seu ciclo biológico, tais como o estresse osmótico, térmico, oxidativo e nutricional. Até agora tem-se avaliado o papel de vários dos aminoácidos, de maneira individual, nesses processos. Porém, ainda não há um trabalho integrado e sistemático que permita avaliar o papel das principais vias metabólicas envolvendo aminoácidos, nem as suas possíveis interações. Este projeto tem o propósito de: (1) Construir um mapa do metabolismo dos aminoácidos com foco naqueles com funções na bioenergética de T. cruzi, incluindo a definição de auxotrofias para estes metabólitos. (2) Avaliar para todos os aminoácidos a capacidade de: i) induzir síntese de ATP, H2O2, explosão respiratória e potencial de membrana mitocondrial, ii) diferenciação, iii) sustentar a invasão celular, iv) resistência a estresse oxidativo, térmico, nutricional, acídico e à toxicidade por acúmulo de NH4+, v) modular o ciclo celular, a autofagia e a morte celular programada sob estresse metabólico. (3) Avaliar, para os aminoácidos que apresentem alguma das funcionalidades descritas em (2), o papel funcional de enzimas do seu metabolismo, assim como o efeito da sua inibição química ou superexpressão em diferentes aspectos da biologia do parasito mencionadas em (2). (4) Realizar um estudo comparativo entre diferentes estágios das atividades das distintas vias metabólicas de aminoácidos por metabolômica dirigida (targeted metabolomic). (5) Desenvolver mediante CRISPR/Cas9 linhagens nocaute para as enzimas mais relevantes no metabolismo de aminoácidos de vias metabólicas críticas para os diferentes aspectos da biologia do parasita mencionados em (2) com o intuito de avaliar os seus possíveis efeitos relacionados com o potencial terapêutico. Avaliar por metabolômica o efeito da supressão gênica ou do tratamento com os inibidores sobre o perfil metabólico das células. (6) Avaliar o impacto do metabolismo de aminoácidos na administração dos níveis intracelulares de NH4+, e na produção de aminoaçúcares e glicoconjugados.

Este projeto esta orientad a financiar uma rede de pesquisa para descoberta de novos fármacos contra a doença de Chagas e as Lleishmanioses. Este projeto, inclui mais de 50 grupos de pesquisa de Asia, Reino Unido e SulAmerica.

Diversos estudos têm descrito a importância dos aminoácidos na biologia de diferentes protozoários como o Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Os aminoácidos, além de atuarem na síntese protéica e no metabolismo energético, possuem diversas outras funções no parasito. Dentre eles, vale a pena mencionar a diferenciação entre formas replicativas e infectivas, o sustento energético da invasão das células do hospedeiro mamífero, o estabelecimento da infecção e a resistência a diferentes tipos de estresse aos quais o parasita é naturalmente submetido ao longo do seu ciclo biológico, tais como o estresse osmótico, térmico, oxidativo e nutricional. Até agora tem-se avaliado o papel de vários dos aminoácidos, de maneira individual, nesses processos. Porém, ainda não há um trabalho integrado e sistemático que permita avaliar o papel das principais vias metabólicas envolvendo aminoácidos, nem as suas possíveis interações. Este projeto tem o propósito de: (1) Construir um mapa do metabolismo dos aminoácidos com foco naqueles com funções na bioenergética de T. cruzi, incluindo a definição de auxotrofias para estes metabólitos. (2) Avaliar para todos os aminoácidos a capacidade de: i) induzir síntese de ATP, H2O2, explosão respiratória e potencial de membrana mitocondrial, ii) diferenciação, iii) sustentar a invasão celular, iv) resistência a estresse oxidativo, térmico, nutricional, acídico e à toxicidade por acúmulo de NH4+, v) modular o ciclo celular, a autofagia e a morte celular programada sob estresse metabólico. (3) Avaliar, para os aminoácidos que apresentem alguma das funcionalidades descritas em (2), o papel funcional de enzimas do seu metabolismo, assim como o efeito da sua inibição química ou superexpressão em diferentes aspectos da biologia do parasito mencionadas em (2). (4) Realizar um estudo comparativo entre diferentes estágios das atividades das distintas vias metabólicas de aminoácidos por metabolômica dirigida (targeted metabolomic). (5) Desenvolver mediante CRISPR/Cas9 linhagens nocaute para as enzimas mais relevantes no metabolismo de aminoácidos de vias metabólicas críticas para os diferentes aspectos da biologia do parasita mencionados em (2) com o intuito de avaliar os seus possíveis efeitos relacionados com o potencial terapêutico. Avaliar por metabolômica o efeito da supressão gênica ou do tratamento com os inibidores sobre o perfil metabólico das células. (6) Avaliar o impacto do metabolismo de aminoácidos na administração dos níveis intracelulares de NH4+, e na produção de aminoaçúcares e glicoconjugados.

A presente proposta visa elucidar o(s) mecanismo(s) envolvido(s) no efeito tripanocida exibido pela droga dietilcarbamotioilsulfanil, - conhecida comercialmente como Disulfiram® (aqui nomeado como DSF), sobre o parasita causador da doença de Chagas, o Trypanosoma cruzi. O DSF é suscetível de degradação metabólica, pelo que os seus derivados metabólicos também serão testados; o que chamaremos de efeito DSF. A ação inibitória do DSF em formas proliferativas e infectivas dessa espécie têm sido observadas pelo nosso grupo gerando alguns resultados que consideramos relevante aprofundar. Além disso, vimos que o DSF diminui a atividade especifica da enzima mitocondrial delta-1-pirrolina-5-carboxilato desidrogenasse (TcP5CDH); a segunda enzima da via oxidativa de prolina. Isto sugere que, a interferência no metabolismo de prolina resultaria numa diminuição da viabilidade do parasita através de mecanismos ainda não aprofundados. Considerando a variabilidade intraespecífica existente no T. cruzi propõe-se avaliar o efeito DSF em formas proliferativas e infectivas provenientes de distintas cepas do T. cruzi. Será avaliado também o efeito do DSF em modelo de infecção experimental em camundongos. Uma vez feito isto, pretende-se caracterizar o tipo de morte celular envolvida. Dados preliminares sugerem que o DSF age na mitocôndria do parasita, pelo que também, serão avaliadas algumas funções mitocôndrias decorrentes do efeito DSF. Paralelamente, com o intuito de desvendar os processos e/ou alvos metabólicos envolvidos no efeito DSF será utilizada uma abordagem do tipo metabolomica. Esse conjunto de dados fornecerão informações relevantes sobre o uso alternativo de drogas comercialmente aprovadas para outros fins, e as suas possibilidades de uso no desenho e aplicação de terapias efetivas contra a doença de Chagas.

A presente proposta visa elucidar o(s) mecanismo(s) envolvido(s) no efeito tripanocida exibido pela droga dietilcarbamotioilsulfanil, - conhecida comercialmente como Disulfiram® (aqui nomeado como DSF), sobre o parasita causador da doença de Chagas, o Trypanosoma cruzi. O DSF é suscetível de degradação metabólica, pelo que os seus derivados metabólicos também serão testados; o que chamaremos de efeito DSF. A ação inibitória do DSF em formas proliferativas e infectivas dessa espécie têm sido observadas pelo nosso grupo gerando alguns resultados que consideramos relevante aprofundar. Além disso, vimos que o DSF diminui a atividade especifica da enzima mitocondrial delta-1-pirrolina-5-carboxilato desidrogenasse (TcP5CDH); a segunda enzima da via oxidativa de prolina. Isto sugere que, a interferência no metabolismo de prolina resultaria numa diminuição da viabilidade do parasita através de mecanismos ainda não aprofundados. Considerando a variabilidade intraespecífica existente no T. cruzi propõe-se avaliar o efeito DSF em formas proliferativas e infectivas provenientes de distintas cepas do T. cruzi. Uma vez feito isto, pretende-se caracterizar o tipo de morte celular ali envolvida. Dados preliminares sugerem que o DSF age na mitocôndria do parasita, pelo que também, serão avaliadas algumas funções mitocôndrias decorrentes do efeito DSF. Paralelamente, com o intuito de desvendar os processos e/ou alvos metabólicos envolvidos no efeito DSF será utilizada uma abordagem do tipo metabolomica. Esse conjunto de dados fornecerão informações relevantes sobre o uso alternativo de drogas comercialmente aprovadas para outros fins, e as suas possibilidades de uso no desenho e aplicação de terapias efetivas contra a doença de Chagas.

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fontes de carbono e energia. Vários aminoácidos mostraram também estar envolvidos em outros processos fundamentais para a progressão do ciclo de vida do parasito. O aminoácido histidina participa em diversos organismos de uma grande quantidade de funções biológicas (como antioxidante, fornecedor de intermediários metabólicos através da conversão a glutamato, regulador da disponibilidade de metais como Cu2+ ou Ni2+ através da sua coordenação, entre outros). Porém, seu estudo foi pouco abordado em tripanosomatídeos. A conversão de histidina em glutamato, aminoácido cujo metabolismo vem sendo estudado no nosso laboratório, parece plausível, já que os genes codificantes das enzimas dessa via metabólica foram identificados no genoma de T. cruzi. São os objetivos principais deste projeto: 1. Caracterizar o transporte de histidina em T. cruzi; 2. Caracterizar sob o ponto de vista bioquímico e molecular as enzimas da via histidina ? glutamato (histidina amonio liase, urocanato hidratase, imidazolona propionase e formiminoglutamase); 3. Avaliar o efeito de inibidores dessas enzimas sobre os diferentes aspectos da biologia do T. cruzi (replicação, infectividade, diferenciação, metabolismo energético).

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fontes de carbono e energia. Vários aminoácidos mostraram também estar envolvidos em outros processos fundamentais para a progressão do ciclo de vida do parasito. O aminoácido histidina participa em diversos organismos de uma grande quantidade de funções biológicas (como antioxidante, fornecedor de intermediários metabólicos através da conversão a glutamato, regulador da disponibilidade de metais como Cu2+ ou Ni2+ através da sua coordenação, entre outros). Porém, seu estudo foi pouco abordado em tripanosomatídeos. A conversão de histidina em glutamato, aminoácido cujo metabolismo vem sendo estudado no nosso laboratório, parece plausível, já que os genes codificantes das enzimas dessa via metabólica foram identificados no genoma de T. cruzi. São os objetivos principais deste projeto: 1. Caracterizar o transporte de histidina em T. cruzi; 2. Caracterizar sob o ponto de vista bioquímico e molecular as enzimas da via histidina ? glutamato (histidina amonio liase, urocanato hidratase, imidazolona propionase e formiminoglutamase); 3. Avaliar o efeito de inibidores dessas enzimas sobre os diferentes aspectos da biologia do T. cruzi (replicação, infectividade, diferenciação, metabolismo energético).

A terapia contra a doença de Chagas mediante o uso do benzonidazol é efetiva na fase aguda da infecção, mas a sua eficiência na fase crônica ainda é controversa (revisado por Urbina & Docampo, 2003). Na maior parte dos casos os pacientes cursam a fase aguda sem manifestações clínicas, ou com sintomas não específicos que não permitem diagnosticar a aquisição da infecção. Isto faz com que a maior parte dos pacientes não seja diagnosticada em tempo, perdendo a chance de lançar mão de tratamentos mais eficientes. Esses fatos reforçam a necessidade de novas abordagens terapêuticas que permitam ?per se? ou em combinação com o benzonidazol otimizar o tratamento da fase crônica da doença. Está demonstrada na literatura a participação de aminoácidos tais como prolina, glutamato, aspartato e arginina em processos relevantes da biologia do T. cruzi tais como a diferenciação, administração dos recursos energéticos da célula e a resistência a diferentes tipos de estresse, além da sua participação na geração de energia. Porém, chama a atenção o fato de haver ainda poucos estudos na literatura sobre a identificação de funções relevantes para a biologia do parasita, associadas a outros aminoácidos pouco abordados até agora em Trypanosoma cruzi. O estudo da especificidade dos transportadores e enzimas do metabolismo desses e outros aminoácidos do T. cruzi, é de interesse com vistas à sua exploração como alvos para a obtenção de inibidores seletivos. Propôe-se identificar aminoácidos com funções relevantes na biologia do parasita (além da sua participação como constituintes das proteínas) não abordados até agora, caracterizar bioquímicamente o transporte e as enzimas envolvidas no metabolismo desses aminoácidos e finalmente procurar e/ou desenhar análogos dos substratos dos transportadores e enzimas caracterizados para avaliar sua atividade tripanocida in vitro e, dependendo dos resultados a serem obtidos, in vivo.

Ver descrição do projeto em:
http://inbeqmedi.ifsc.usp.br

Está bem estabelecido que em Trypanosoma cruzi, assim como outros organismos dos gêneros Trypanosoma e Leishmania os aminoácidos constituem uma fonte de carbono e energia relevante, e participam também de processos biológicos tais como diferenciação, e regulação do volume celular. Entre os aminoácidos mais relevantes pelas suas múltiplas funções destacam-se a prolina e o glutamato. No caso particular de T. cruzi, sabe-se que esse organismo metaboliza ativamente prolina através da sua conversão em glutamato, que pode ser deaminado a a-cetoglutarato, um intermediário do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Ambos os aminoácidos estão também envolvidos no processo de diferenciação celular que acontece no inseto vetor, e a prolina em particular está envolvida na diferenciação das formas epimastigotas intracelulares para formas tripomastigotas no citoplasma da célula hospedeira. Apesar da reconhecida variedade de funções que esses aminoácidos possuem, a via metabólica que os relaciona ainda não foi estudada. Essa via consta de dois passos enzimáticos: 1: conversão de prolina em D1-pirrolina-5-carboxilato ou P5C (este passo acontece através das enzimas prolina oxidase ou prolina desidrogenase, dependendo do organismo). 2: Conversão de P5C em glutamato (através da enzima P5C desidrogenase). No presente projeto propomos: 1. caracterizar em termos bioquímicos e moleculares as enzimas envolvidas na via prolina-glutamato em T. cruzi (Prolina oxidase ou prolina desidrogenase, e P5C desidrogenase), e 2. avaliar mediante o uso de inibidores específicos relatados na literatura, o efeito da sua inibição sobre a biologia desse organismo, o que eventualmente poderá constituir uma contribuição à definição de um novo alvo terapêutico.

As doenças causadas por tripanossomos constituem um problema de saúde relevante nas Américas, Africa e na região tropical e subtropical do planeta. Na maior parte dos casos, as terapias são ineficientes e as probabilidades de cura são baixas. Porém, a terapia é um elemento essencial para o controle dessas doenças infecciosas e a descoberta de novas drogas contra organismos dos gêneros Trypanosoma e Leishmania constituem objetivos de pesquisa considerados relevantes. Está demonstrada a participação dos aminoácidos na diferenciação e no metabolismo energético nestes parasitas. É importante destacar o fato de que os processos de transporte constituem um primeiro passo para o metabolismo dos aminoácidos e portanto, constituem-se em alvos alternativos importantes para o desenho de drogas. Nesse contexto, chama a atenção o fato de haver poucos estudos na literatura sobre transporte de aminoácidos. Até o presente, não foi caracterizada a nível molecular, nestes organismos, nenhum transportador de aminoácidos. Neste projeto, propõe-se caracterizar os genes codificantes de transportadores de aminoácidos do Trypanosoma cruzi e procurar análogos de seus substratos com potencial terapêutico.