Eutimio Gustavo Fernández Nuñez.

Apresentar para alunos de ensino médio os cursos de graduação da Universidade de São Paulo

Professor tutor da Empresa Junior do Curso de Bacharealdo em Biotecnologia-EACH-USP

Boletim mensal do Curso de Bacharelado em Biotecnologia EACH-USP

O século XXI está sendo marcado pela ocorrência de mudanças climáticas e o aparecimento de novas doenças infecciosas. Vírus anteriormente restritos aos seus ecossistemas naturais têm entrado em contato com a população humana, provocando epidemias e pandemias. Em uma dessas ocorrências, o Brasil foi acometido pela transmissão em massa de vírus Zika a partir do mesmo vetor transmissor de outras arboviroses. A epidemia de Zika provocou uma variedade de malformações em recém-nascidos, sendo denominada de síndrome congênita do Zika vírus. A comunidade científica brasileira fez vários avanços na época da epidemia, porém não chegamos à solução para a prevenção eficaz de prováveis novos surtos. A proposta do Instituto Butantan desde o início do surto tem sido de desenvolver uma vacina de Zika com tecnologia nacional. Para isso foram executados muitos passos de pesquisa básica para a produção de vírus Zika, inativação e sua apresentação em forma de um protótipo vacinal. Essa preparação demonstrou ser imunogênica, gerando anticorpos neutralizantes em animais de laboratório. Atualmente o protótipo requer a finalização de seu desenvolvimento em escala de bancada e piloto, realização de ensaios pré-clínicos e produção de lote em condições de boas práticas de fabricação (BPF) para estar acessível para o combate da doença. O desenvolvimento ainda possui desafios científicos a serem superados, como: melhoria dos processos; proposição, construção e teste de métodos analíticos; estudo da melhor composição da formulação base já estabelecida; determinação da dose e esquema vacinal; descrição aprofundada da resposta imune provocada pela vacina. No que diz respeito ao desenvolvimento, o planejamento do produto, utilizando os conceitos de qualidade planejada ou Quality by Design, está no cerne do projeto, pois os registros serão a base para a produção consistente dos lotes para os ensaios pré-clínicos e posteriormente transferência da tecnologia para as áreas BPF e produção do produto experimental. O projeto está construído com a premissa do engajamento de várias áreas da instituição, através de representantes focados no produto, formando o Grupo de Desenvolvimento Avançado. Esse grupo atuará conjuntamente em várias etapas do desenvolvimento, procurando identificar precocemente os problemas ou necessidades do projeto ao protótipo, seguindo os melhores exemplos internacionais de centros de pesquisa e desenvolvimento focados na obtenção de produtos de base científica.

A tecnologia de produção de vacinas através de partículas-semelhantes a vírus (VLP) vem se estabelecendo comercialmente. Estas nanoestruturas compostas por proteínas virais são mais seguras que as vacinas tradicionais (vírus atenuado e inativado) e mais imunogênicas que as de subunidades. Entre as plataformas de produção de VLP, o sistema baculovírus/célula de inseto (B/IC) tem uma posição de destaque. Duas estratégias de expressão viral para gerar VLP complexas são viáveis com o B/IC: infecção com múltiplos baculovírus monocistrônicos (coinfecção) e infecção com um único baculovírus policistrônico (coexpressão). As VLP pelo B/IC são usualmente produzidas em biorreatores tipo tanque com agitação mecânica e aeração (STB), para posteriormente ser purificadas dependendo da escala, através de centrifugação por gradiente de densidade (laboratório) ou técnicas cromatográficas (comercial) principalmente. Em cada uma destas etapas múltiplos parâmetros operacionais devem ser otimizados inicialmente na escala laboratorial em equipamentos semelhantes aos utilizados na escala comercial, para assim obter bioprocessos que possam ser escalonados até a implementação industrial. Desta forma, o objetivo desta proposta será otimizar as condições de agitação e aeração, modo de operação (batelada, batelada alimentada) em STB, assim como as condições cromatográficas (sistema de tampões, volume de amostra/volume de coluna, velocidade linear) nos processos de propagação de baculovírus recombinantes e na produção de VLP, utilizando como modelos, o vírus rábico e o SARS-CoV-2, agentes etiológicos da raiva (uma doença negligenciada) e da COVID-19, respectivamente. Finalmente as VLP purificadas e caracterizadas serão avaliadas imunologicamente por técnicas in vitro de modo que seja reduzido o uso de animais de laboratório e possam ser validados os bioprocessos propostos. Se estas metas forem atingidas com sucesso, poderão ser transferidos bioprocessos robustos para etapas posteriores de desenvolvimento com rendimentos e produtividades otimizadas, assim como produtos associados com atividade biológica comprovada preliminarmente. Os resultados desta proposta permitiriam também implementar uma plataforma escalonável de produção de VLP para diferentes doenças virais conhecidas e por conhecer.

O início de 2020 viu o surgimento do surto de COVID-19 causado por um novo coronavírus, O Coronavírus-2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS CoV-2). É iminente o melhor entendimento desse novo vírus e o desenvolvimento de maneiras de controlar sua propagação. Neste estudo, pretendemos testar uma plataforma já estabelecida de produção de VLPs através do uso do sistema de expressão gênica baseado no baculovírus. Inicialmente propomos expressar 4 genes inteiros do SARS CoV-2, o gene das proteínas de Nucleocapsídeo (N), de Envelope (E), das Espículas (S) e de Membrana (M), sendo estas em 4 diferentes bacmídeos. Isto nos fornece maleabilidade para testar diferentes MOIs, diferentes combinações e ainda combinações com proteínas de outros CoVs, abrindo a possibilidade de buscar VLPs universais para CoVs. Além disso, é nossa expectativa utilizar epitopos dessas mesmas proteínas para testes de imunogenicidade. As VLP-SARS CoV-2, poderão ser estudadas não apenas para produção de vacinas, mas também de material biológico seguro para produção de kits diagnósticos, produção de soros hiperimunes e outros imunobiológicos. Assim, nossos estudos poderão fornecer material biológico que poderá ajudar a orientar os esforços experimentais para o desenvolvimento de vacinas contra SARS-CoV-2 e outros CoVs que existem ou poderão surgir no futuro.

The aim of this experimental case is to calibrate multivariate models for quantifying biological parameters (nutrients, metabolites, cell density and viability, recombinant baculovirus titration, virus-like particles (VLPs) attributes) in upstream stage of a bioprocess to obtain Rabies virus-like particles using insect cell-baculovirus system from on-line Raman spectra. Four bioreactions will be performed at bench scale. Briefly, the first one will comprise the Spodoptera frugiperda (Sf9) cells growth, second and third reactions to obtain recombinant baculovirus (rBV) containing Rabies G glycoprotein and matrix protein (M). The last one will involve the generation of rabies VLPs from rBVs. The biological reactions will last 120 hours, samples to quantify biological parameters will be taken out every 12 hours. The on-line Raman spectra will be acquired with a probe coupled to an RXN2 Raman spectrometer (Kaiser Optical Systems, Ann Arbor, MI, USA) equipped with a 785-nm laser source. The Partial Least Square models will be calibrated in the software SIMCA (Umetrics, Malmö, Sweden). The results derived from this proposal could be a pioneer in bioprocess spectroscopical monitoring using insect cells for VLPs manufacturing, which are gaining ground the pharmaceutical industry.

Uma grande quantidade de espécies vegetais tem sido utilizada como fontes primárias para a obtenção de metabólitos secundários com diversas aplicações industriais, farmacêuticas e cosméticas. A presença desses metabólitos no material vegetal usualmente é menor que 1% em massa seca, e essas espécies vegetais podem ser afetadas por diversas condições ambientais. Fatores como sazonalidade, índice pluviométrico, altitude e temperatura alteram os níveis de metabólitos secundários, dificultando sua obtenção e o estabelecimento de processos rigorosamente controlados. Como resultado, esses processos de extração são geralmente caros e podem ocasionar um impacto ambiental negativo. Entre as alternativas para solucionar os problemas anteriormente referidos, o cultivo de células de plantas tem sido utilizado na obtenção de metabólitos secundários com alto valor agregado quando estes bioprocessos apresentam viabilidade financeira. O objetivo do presente projeto será definir as variáveis críticas de operação associadas às etapas de cultivos de calos e em suspensão utilizando sistema de frascos em agitação, usando células vegetais provenientes da espécie Capsicum baccatum var. pendulum para produzir metabólitos secundários com propriedades antioxidante e fotoprotetora. Na etapa de cultivo de calos serão estabelecidos o meio de cultura basal (Murashige e Skoog; Gamborg e Knudson C), a localização anatômica do explante (caule, folha e gema) e a concentração do hormônio tipo citocininas(1x10-7 ; 2,58x10-6; 5,05x10-6 ; 7,53x10-6 e 1x10-5 M), que garantem a produção máxima de metabólitos secundários com propriedades farmacológicas, utilizando como ferramenta experimental um delineamento fatorial multiníveis. Na etapa de cultivo em suspensão será utilizado um delineamento composto central para otimizar a composição do meio de cultura focando nas concentrações das fontes de elementos primários e carbono, tendo, como critérios de seleção da melhor combinação destes fatores, os mesmos utilizados na etapa precedente. Finalmente, estudos de elicitação química serão realizados com o intuito de aumentar a produção de metabólitos com propriedades antioxidantes e fotoprotetoras. Os resultados provenientes deste projeto poderão ser utilizados no estabelecimento de um bioprocesso a ser executado em biorreatores tipo tanque com agitação e aeração, permitindo o escalonamento da produção de extratos com propriedades antioxidantes e fotoprotetoras.

A utilização das técnicas de geoprocessamento pode ser uma importante aliada em planejamentos da área ambiental como, por exemplo, no caso do mapeamento da qualidade da água ao longo de rios. Assim, o presente projeto tem como objetivo determinar o Índice de Qualidade das Águas (IQA) em cinco pontos do Córrego do Jacu e em cinco pontos do córrego Água da Porca, ambos localizados no município de Assis-SP, e gerar um mapa da qualidade da água utilizando tecnologia SIG (Sistema de Informação Geográfica). Para determinação do IQA serão analisados os parâmetros: oxigênio dissolvido, coliformes fecais, pH, demanda bioquímica de oxigênio, nitrogênio total, fósforo total, turbidez, sólidos totais e variação da temperatura. A fim de simplificar a determinação desse índice, reduzir os custos e a geração de resíduos químicos, este projeto visa, também, a calibração de uma Rede Neural Artificial para determinar o valor do IQA a partir de padrões espectrofotométricos da água. Para isso, serão realizadas análises espectrais UV-Vis entre 190 e 800nm em cada amostra coletada, de modo a treinar a rede e obter uma única camada como saída, correspondente ao valor do IQA. O método de correlação utilizado será baseado em uma RNA de aprendizagem supervisionada, modelo "Multilayer Perceptron", com algoritmo de aprendizado por retropropagação.

As células tronco mesenquimais (CTM) constituem uma subpopulação de células estromais, multipotentes, que apresentam aspecto fibroblastóide, com marcadores de superfície característicos, aderência à superfície plástica dos frascos de cultura e, sob condições específicas de indução, potencial de diferenciação em osso, cartilagem e tecido adiposo. O emprego das CTM tem sido considerado como uma alternativa terapêutica potencialmente promissora em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O grande interesse nas CTM para a terapia celular deve-se a uma série de características tais como, facilidade de obtenção, sendo pouco imunogênicas, podendo ser empregadas em transplantes alogênicos e podem ser obtidas de vários tipos de tecidos. Há, atualmente, mais de 200 ensaios clínicos envolvendo a utilização de CTM em diferentes condições patológicas, que vão desde imunomodulação até regeneração e reparo de lesões teciduais. Embora a medula óssea tenha sido o primeiro órgão identificado como fonte de CTM's, outros órgãos e tecidos tem sido apontados como fontes potenciais dessas células, como do cordão umbilical, placenta, fígado, rim e, sobretudo, mais recentemente, o tecido adiposo. Entre os desafios chaves das tecnologias de expansão e coleta de células-tronco encontram-se a retenção dos principais atributos celulares qualitativos com relação à identidade, potência, pureza e segurança. Em função destes aspectos, busca-se com este projeto estabelecer e padronizar um bioprocesso para a multiplicação de células-tronco mesenquimais provenientes de tecido adiposo que possa ser escalonado em condições de boas práticas de produção farmacêutica, utilizando com base a tecnologia de cultura em microcarregadores em biorreator tipo tanque com agitação mecânica e aeração. Será também, desenvolvido um sistema de monitoramento para o metabolismo e a diferenciação celular baseado na espectroscopia infravermelha próxima combinada com técnicas multivariadas de análise de dados. Paralelamente, as culturas celulares de CTM provenientes do tecido adiposo serão monitoradas quanto à integridade genômica, durante todo processo tanto de cultura em placas quanto de culturas e expansão em biorreator.

As técnicas de quantificações de atividades enzimáticas para extratos aquosos provenientes de fermentações em estado sólido são geralmente executadas seguindo protocolos constituídos por múltiplos passos, fazendo das mesmas procedimentos demorados, e com alta probabilidade de obter resultados imprecisos quando analistas inexperientes executam estas técnicas de analise. O presente projeto visa estabelecer um método quimiométrico que permita quantificar as atividades enzimáticas amilolíticas e proteolíticas simultaneamente a partir dos espectros ultravioleta-visíveis de extratos enzimáticos diluídos provenientes de processos fermentativos em estado sólido utilizando o fungo filamentoso Rhizopus oligosporus. O método utilizado será correlação em mínimos quadrados parciais. Um conjunto de amostras superior a 100, composto por extratos obtidos a partir de quatro resíduos agrícolas fermentados de maneira isolada e por duas misturas ternárias dos referidos substratos serão utilizadas para ajustar e calibrar o modelo em mínimos quadrados parciais. Para isto, serão determinadas as atividades enzimáticas proteolíticas e amilolíticas por métodos clássicos dos extratos e ao mesmo tempo serão realizadas as analises espectrais UV-Vis das amostras diluídas. O modelo a ser obtido permitirá reduzir tempo e custos das analises enzimáticas e paralelamente aumentar segurança dos resultados.

Concepção de 8 medicamentos empregando técnicas estatísticas avançadas. Estes resultados permitiram treinar os profissionais farmacêuticos na combinação das ferramentas estatísticas e os conhecimentos em tecnologia farmacêutica.

A detecção do linfonodo sentinela contribui significativamente para o diagnóstico pré-operatório de metástase linfática e mediante sua identificação surgem perspectivas mais positivas para uma conduta terapêutica corretamente dimensionada, minimizando as agressões, e possibilitando uma evolução clínica favorável e livre de complicações. Alguns produtos já foram ensaiados ou se encontram disponíveis comercialmente para esta finalidade. No entanto a captação previsível e específica pelo gânglio sentinela, que é a primeira estação de drenagem tumoral, sem retenção no local de injeção nem ultrapassagem do alvo e contaminação de nódulos de segunda linha, ainda é uma meta difícil de atingir. Estudos recentes mostraram que macromoléculas manosiladas marcadas com 99mTc podem oferecer melhores características governadas pelo tamanho bem definido da macromolécula. Um novo conjugado dextran-manose combinado a novas metodologias de marcação com 99mTc, utilizando como precursor 99mTc-carbonila, e dextran de várias dimensões (10,20,40 kDa) conjugado com manose e com um derivado de ditiocarbazato (DTCZ), será aqui desenvolvido. Para tanto, selecionou-se um modelo in-vivo utilizando ratos Wistar, com pesquisa por método de imagem (gama-câmara) e exame direto do linfonodo.

Atualmente encontram se em fase de revisão todos os capítulos deste livro que constituirá um material de referência para os farmacêuticos cubanos.

Escala satisfatória da reação de ativação da Sepharose CL-4B com CNBr para a imobilização de proteínas. Avaliação da mesma na preparação de imunoabsorventes específicos para a purificação de antígeno de superfície do vírus da Hepatitis B.

Otimização a escala de laboratório dos parâmetros operacionais para desenvolver esta reação.

Otimização da reação de lixiviação das espécies de ferro a partir de resíduos da indústria metalúrgica cubana. Desenhos de comprimidos de sulfato ferroso por compressão direta e por granulação compressão que cumprem com os requisitos da USP vigente.

Definição de todas as operações unitárias e de equipamento necessário para obter cloreto férrico apartir de cinzas piríticas. Solicitação de patente de invenção à Oficina Cubana da Propriedade Industrial.

Obtenção de comprimidos de carbonato de cálcio que cumpram com a USP vigente. (Se aplicou um Desenho de Mistura)

Definição de tecnologia para obter citrato de sódio

Desenho de um reator a escala de laboratório para obter este composto

Definição dos parâmetros tecnológicos em provas de laboratório para la obtenção deste sal a partir do enxofre de produção nacional.

Obtenção do fertilizante nitrogenado com melhores propriedades físicas aumentando seu valor adicional. (A escala de Laboratório)

Obtenção uma gama de fertilizantes portadores dos três elementos primários com melhores propriedades físico-mecânicas, empregando um desenho de experimentos com misturas ( A escala de Laboratório)

Obtenção de fertilizante nitrogenado com melhores propriedades químicas e alto valor adicional, empregando aditivos nacionais portadores de Ca e Mg. (A escala de Laboratório)

Obtenção de um fertilizante nitrogenado com melhores propriedades químicas, e propriedades físicas similares as do Nitrato de Amônio, incrementando seu valor adicional (A escala de Laboratório)