Emer Suavinho Ferro.

Financiamento da FAPESP, Projeto Multiusuários - Aquisição de Equipamento Promethium (Sable Systems) para a fenotipagem metabólica, cardiovascular e respiratória de roedores em diferentes temperaturas e ciclos claro-escuro..

O estudo das oligopeptidases resulta da descoberta dessas enzimas como cininases do sistema nervoso central de coelhos no inicio dos anos 70, pelo Prof. Antonio C.M. Camargo, na Faculdade de Medicina da USP em Ribeirão Preto. Estudos nossos (auxílios regulares Fapesp 96/05904-8 e 99/01983-9) e de outros grupos sobre secreção e localização subcelular da thimet-oligopeptidase (EC3.4.24.15; EP24.15) e neurolisina (EC3.4.24.16; Nln) sugeriram que mais de 90% dessas enzimas se concentram no interior das células; essa distribuição subcelular sugeria certa contradição à maior função originalmente demonstrada para essas oligopeptidases na geração e degradação de neuropeptídeos como a bradicinina (1-11). No meio intracelular fomos pioneiros em sugerir que a EP24.15 funciona no processamento e degradação de antígenos associados moléculas de histocompatibilidade de classe I (12,13), estudos esses corroborados posteriormente por diversos grupos (14-20). Ainda investigando a função intracelular das oligopeptidases, desenvolvemos mutantes cataliticamente inativos e capturamos substratos intracelulares dessas oligopeptidases (21-23), que inicialmente levaram à descoberta da hemopressina um novo peptídeo agonista inverso de receptores canabinóide tipo 1 (24-62). Esses achados nos levaram depois a propor que no meio intracelular, peptídeos sejam reguladores naturais de interações protéicas (63-78; Temático Fapesp 04/04933-2). Agora, propomos investigar a relevância funcional e as aplicações terapêuticas dos peptídeos intracelulares, sendo os objetivos centrais desse projeto: 1) investigar o possível uso terapêutico da hemopressina e de outros peptídeos intracelulares, 2) investigar mecanismos moleculares de ação dos peptídeos intracelulares, 3) realizar análises peptidomicas e desenvolver métodos para determinação da concentração absoluta de peptídeos em amostras biológicas, 4) caracterização fenotípica de camundongos C57BL6 knockout para a EP24.15, Nln e EP24.15/Nln. As possíveis aplicações clínicas desse conhecimento serão um objetivo constante durante o desenvolvimento desse projeto.

Nosso laboratório, bem como a do Prof Fricker, usaram técnicas de peptidoma para identificar centenas de peptídeos intracelulares em linhagens de células humanas e em cérebros de camundongos e ratos, bem como em outros tecidos (Gelman et al, 2011;. Fricker et al ., 2012; Castro et al, 2014;.. Cavalvanti et al, 2014). Enquanto muitos destes peptídeos são comuns a vários tecidos e linhas celulares analisadas, outros peptídeos são do tipo de célula específico. Mais importante, a grande maioria dos peptídeos intracelulares não correspondem às proteínas mais abundantes nem as proteínas mais instáveis, o que sugere que eles não são produtos não específicos de degradação de proteínas. 
Recentemente, o nosso grupo testou vários dos peptídeos intracelulares e descobriram que alguns
peptídeos possuem atividades farmacológicas que modulam a transdução do sinal através de receptores acoplados a proteínas G (Cunha et al 2008;.. Russo et al, 2012), a absorção de glicose em adipócitos (Berti et al., 2012), e morte celular por apoptose e / ou necrose (Araújo et al., 2014).

Nosso objetivo nesse projeto é investigar novos alvos e novos compostos para controle do
metabolismo energético. A partir de resultados preliminares que se encontram em diferentes
níveis/estágios de desenvolvimento, propomos: 1) caracterização fenotípica de animais knockout para
as oligopeptidases Nln e EP24.15, que são processadoras de peptídeos intracelulares, 2) caracterização
funcional de novos peptídeos intracelulares sobre o metabolismo energético; 3) screening
farmacológico e caracterização funcional de derivados de hemopressina, cuja administração por via oral
melhorem parâmetros relacionados à síndrome metabólica, sem induzir efeitos comportamentais
indesejáveis.

O presente projeto foi selecionado pela Pró-Reitoria de Pesquisa da USP para participar das Olimpíadas USP do Conhecimento, na Área de Ciências da Saúde, no Tema Diagnóstico Preventivo. 

O projeto se destina ao desenvolvimento de um Kit ?hipertensão sob controle? para o diagnóstico precoce da hipertensão arterial (pré-hipertensão) por meio da dosagem de proteínas na urina. Trabalhos anteriores validam essa proposta, bem como a prova de conceito desenvolvida pela nossa equipe com uma pequena amostragem de voluntários. O Kit modelo será composto por um frasco coletor, um conta-gotas, 30 tubos plásticos de 1,5 mL contendo o reagente de dosagem de proteínas, uma fita indicadora de cores e condição clínica, além de informações e instruções simples.

O nosso maior objetivo com a criação do Núcleo de Apoio à Pesquisa na Interface Proteólise-Sinalização Celular (NAPPS), com apoio da da Pró-reitoria de Pesquisa da USP, é criar um equipe de cientistas focados no estudo funcional desses peptídeos intracelulares. A equipe proposta, somando as expertises individuais, tem plenas condições para mapear as redes de interações proteicas celulares que esses peptídeos podem modular, bem como entender as vias de síntese e metabolismo desses peptídeos e fazer as correlações necessárias entre proteólise e sinalização celular. Também, essa equipe esta preparada para aplicar esse conhecimento na geração de inovações na área biomédica.

Apresentamos a proposta para aquisição de material bibliográfico ao Programa Fap-Livros- Fase VI, visando a ampliação do acervo bibliográfico de pesquisa da área biomédica.

Endo-oligopeptidases foi um termo cunhado por Camargo e cols. (Oliveira et al., 1976) para descrever a especificidade proteolítica de um grupo de enzimas (denominadas à época, endo-oligopeptidases A e B) que agem apenas sobre peptídeos contendo entre 5-17 resíduos de aminoácidos (oligopeptídeos), não degradando proteínas. Nossos estudos anteriores permitiram a caracterização de oligopeptídeos intracelulares como moléculas funcionais e abundantes no meio celular interno. Demonstramos que alterações no metabolismo intracelular desses peptídeos, bem como eles próprios, afetam a sinalização celular iniciada por agonistas de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). Observamos também que animais obesos com resistência a insulina apresentam conteúdo diferencial de peptídeos intracelulares no tecido adiposo quando comparados a animais controle. Identificamos ainda o alvo farmacológico da hemopressina (PVNFKFLSH; HP) como sendo o receptor canabinóide tipo 1 (CB1). Além disso, revelamos as novas HPs RVD-HPα, VD-HPα e VD-HPβ, demonstrando pela primeira vez a existência de canabinóides peptidérgicos endógenos. Como resultado desses estudos, várias publicações de alto impacto foram geradas, com por exemplo, nas revistas Journal of Biological Chemistry, FASEB Journal e Proceedings of National Academy of Sciences of USA (PNAS). Esses resultados foram obtidos dentro do nosso subprojeto na Rede de Proteoma do Estado de São Paulo (RPSP), e propomos agora, pela rede Genoprot, dar continuidade à caracterização biológica dessa nova classe de moléculas bioativas, os peptídeos intracelulares. O presente projeto pretende, assim, aumentar ainda mais a sinergia dos laboratórios colaboradores (dos Profs. Drs. Fábio C. Gozzo do IQ/UNICAMP e Marcelo D. Gomes da FMRP/USP) de forma a trazer os resultados das colaborações atuais para um nível ainda maior, utilizando a infra-estrutura já existente dentro dos grupos.

Em neurônios acredita-se que a EP24.15 desempenhe um papel na degradação de produtos derivados do catabolismo gerados inicialmente pelo proteasoma (Fontenele-Neto et. al, 2001). Recentemente tem sido proposto papel importante na limitação da quantidade de peptídeos livres no citoplasma e portanto prevenindo que as interações proteína/proteína sofram interferência e portanto provoque disfunção celular (Cunha et al., 2008; Berti et al., 2009). Através de mutação sítio dirigida a EP 24.15 foi mutada na região do sitio catalítico e o mutante não ativo que ainda era capaz de se ligar a peptídeos sintéticos, foi utilizado em associação a técnicas de espectrometria de massas para identificar possíveis ligantes naturais no cérebro de ratos. A partir desta estratégia Rioli et al. (2003) identificaram vários possíveis substratos destes um novo peptídeo, derivado da cadeia alfa da hemoglobina, a hemopressina (PVNFKFLSH). A observação que em animais anestesiados este peptídeo provoca hipotensão sugere o desenvolvimento de novas drogas para o controle da pressão arterial e desperta grandes interesses na biologia celular pois como paradigma acredita-se que os nineis de peptídeos intra-celulares sejam limitados. Estudo recente caracterizou a hemopressina como um agonista inverso do receptor canabnóide CB1 (Heimann et al., 2007; Gomes et al., 2009). Estudos morfológicos são necessários para evidenciar a localização deste, e possivelmente outros, peptídeos no neurônio, bem como verificar se há co-localização entre hemopressina e receptores, em animais adultos e durante o desenvolvimento. Esses dados são importantes peças para compreensão a biologia celular deste peptídeo.

A definição de diversos genomas teve uma tremenda relevância e impacto científico, deixando claro que o funcionamento celular é muito mais complexo do que se imaginava previamente. Hoje, acreditamos que o conhecimento das complexas redes de interação envolvendo proteínas adicione suficiente informação a ponto de nos permitir finalmente entender a biologia in toto (Ferro et al., 2004). O primeiro passo nesse sentido é definir a composição protéica de células e tecidos. Funcionando em redes, as proteínas interagem de forma induzida e reversível atravéz de domínios específicos. Nosso laboratório vem trabalhando com a hipótese que peptídeos gerados intracelularmente, após a degradação de proteínas pelo proteassoma, possam exercer um papel importante no estabelecimento e regulação dessas complexas redes proteícas (Rioli et al., 2003; Ferro et al., 2004; Heimann et al., 2005). Dando suporte experimental a essa hipótese, demonstramos recentemente que ~75% dos ~35 peptídeos derivados de proteínas intracelulares isolados pelo nosso grupo possuem motivos de modificação pós-traducional, e podem realmente regular interações protéicas específicas (Machado et al., 2006). Os testes funcionais desses peptídeos reintroduzidos em células modelo estão em andamento em nosso laboratório, e os resultados iniciais confirmam a hipótese acima (Cunha F.M., Berti, D.A., Ferreira Z.S., Markus, R.P. and Ferro, E.S., em preparação).
Nosso objetivo maior nesse projeto na ?Rede de Proteoma SP? é conhecer/determinar em larga escala a composição peptídica intracelular do cérebro e tecido adiposo de ratos e camundongos (selvagem e knockout). Essas informações serão fundamentais para validar nossa hipótese que peptídeos gerados no meio intracelular contêm motivos de modificação pós-traducional bem como donínios de interação protéica, podendo assim regular a formação e manutenção de redes de interação envolvendo proteínas. É importante ainda mencionar que nessas mesmas amostras obtidas de tecido cereb

Endo-oligopeptidases foi um termo cunhado por Camargo e cols. (Oliveira et al., 1976) para descrever a especificidade proteolítica de um grupo de enzimas (denominadas à época, endo-oligopeptidases A e B) que agem apenas sobre pequenos peptídeos (5-17 aminoácidos), não degradando proteínas. Nesse Projeto Temático pretendemos dar continuidade aos nossos dois projetos individuais anteriores, financiados pela FAPESP (96/05904-8 e 99/01983-9), investigando a função celular das endo-oligopeptidases EP24.15 (EC 3.4.24.15) e EP24.16 (EC 3.4.24.16).
A predominante localização intracelular das oligopeptidases EP24.15 e EP24.16 sugere função adicional àquela descrita no metabolismo extracelular de neuropeptídeos (Fontenele-Neto et al. 2001; Checler et al. 1995; Kato et al. 1997). Nesse sentido, estudos do nosso laboratório, em colaboração com os laboratórios dos Professores Antonio C.M. Camargo (Instituto Butantan) e Célio Silva (FMRP, USP), sugerem que endo-oligopeptidases como a EP24.15 exerçam um importante papel no metabolismo intracelular de peptídeos produzidos pelo proteassoma 26S. Esses estudos foram posteriormente confirmados por outros grupos, gerando um importante avanço no entendimento da biologia celular dessas enzimas (Ferro et al., submetido).
Assim, este projeto temático tem como objetivo investigar a biologia celular molecular das endo-oligopeptidases EP24.15 e EP24.16.

Em nosso primeiro projeto "multiusuários", a equipe aqui proposta solicitou à FAPESP equipamentos básicos para compor uma "Sala Multiusuários de Bioquímica e Biologia Molecular". Esta Sala foi montada conforme proposta original, e hoje vem sendo diariamente utilizada pelos integrantes do projeto, além de auxiliar outros docentes/alunos.
Uma vez cumpridas as expectativas de utilização dos equipamentos solicitados em nosso primeiro projeto "multiusuários", estamos agora encaminhando solicitação para complementar este Setor. Entre os equipamentos novos propostos acima encontra-se 1) um sequenciador automático de DNA que irá possibilitar a realização de tal tarefa de modo rápido e eficiente, conforme requer nossa demanda atual, 2) um aparelho de PCR com múltiplos blocos, que poderá ser utilizado por vários laboratórios ao mesmo tempo, 3) um 
microscópio confocal que irá beneficar todos os integrantes desse projeto, cobrindo assim o excesso na demanda de uso de um aparelho semelhante locado em nosso Departamento, 4) um upgrade em microscópio de fluorescência que irá beneficiar todos os integrantes desse projeto, pois irá automatizar um equipamento já existente permitindo
que se façam analises morfológicas quantitativas, 5) um spectrofotometro termostatizado com capacidade para realização de cinética enzimática, 6) um aparelho tipo "Storm" que permite a quantificação de Western blots, Northern and Southern blots, além 
de dispensar o uso de filmes autoradiográficos para estes experimentos (mesmo aqueles que se utilizam de substratos quimioluminescentes), e 7) um aparelho para leitura de fluorescência e luminescência, com controle de temperatura e comprimento de onda variável 250-850 nm.

Projeto com o obejtivo de sequenciar o genoma de plantas de interesse comercial

We believe that protein structure determination is crucial for the better understanding of life organization. And that is the main reason we are eagle to joint the group of the first "structural genomic program" sponsored by FAPESP. Face the existence of equipment facilities and technical expertise of our group, we already started to identify and overexpress new protein targets of potential medical/pharmaceutical/scientific interest - we started just before the first call for application on this structural genome program. For these protein expression we have been used the same system we described before (Rioli et al., 1998). However, facing the occurrence of possible "problems" for the expression of these and/or other proteins (having in mind this application), we also start to test the new "Gateway system" (GibcoBRL), which allow easy cDNA subcloning (by directional recombination) for expression in distinctive cell systems, using either GST or His-tag tails. My lab has great interest in endopeptidases, and has been specifically working in the past five years (in collaboration with other groups) with neurolysin and thimetoligopeptidase. A previous contact with Dr. Wolfram Bode during a Gordon conference last June, led to the initiative to determine the crystal structure of neurolysin. We produced 35 mg of homogeneous neurolysin protein and started the screening during our visit to the Max Planck Institute last November. We recently started to clone the cDNA encoding a new endopeptidase ("Damage Induced Neuronal Endopeptidase", DINE). Our final goal in the later project is to obtain the crystal structure for this enzyme. In addition, to be able to easy identify specific protein motifs (of potential medical/pharmaceutical and scientific interest) in genomic databases, we are currently trying to generate a computer program. Moreover, we expect gain and exchange experience if qualified to participate in this structural biology program.

No decorrer sas últimas três décadas, várias peptidases endógenas foram isoladas e caracterizadas como possíveis metabolizadoras de neuropeptídeos. Embora a maior parte dessas enzimas tenha sido demonstrada estar presente extracelularmente, o que é uma qualificação mínima e essencial para que possamos associa-las ao metabolismo fisiológico de neuropeptídeos, muitas predominam no meio celular interno.
Em nosso laboratório temos nos empenhado na investigação de diferentes aspectos do metabolismo de peptídeos (Rioli et al., 1998; Ferro et al., 1999; Garrido et al., 1999; Portaro et al., 1999; Silva et al., 1999). Com o projeto atual pretendemos nos próximos três anos desenvolver os seguintes objetivos:

O Departamento de Histologia e Embriologia do ICB/USP, que durante muito tempo esteve voltado a investigação da morfologia tecidual, vem procurando se adequar a realidade multidisciplinar da ciência atual. Para isso, nos últimos anos, tem anos contratou um "grupo" de Docentes com formação básica em diferentes áreas do conhecimento. O referido "grupo" Departamento contou com o apoio da FAPESP em um projeto anterior, quando foram adquiridos equipamentos básicos para qbioquímica e biologia molecular. Setor de Multiusuários com infra-estrutura infra - estrutura necessária para suportar os Projetos de Pesquisa de abordagem bioquímica e biologia molecular, que vêm sendo utilizados por todo Departamento beneficiando alunos e docentes.
Com o presente projeto pretendemos atualizar o referido " Setor de Biologia Molecular do Departamento de Histologia e Embriologia do ICB da USP de Histologia e Embriologia do ICB da USP" adquirindo equipamentos para atender as necessidades atuais do nosso grupo, e que não haviam sido incluídos no primeiro projeto multi-usuários.

Com o presente projeto pretendemos criar a infraestrutura necessária para a instalação do "Setor de Biologia Molecular do Departamento de Histologia e Embriologia do ICB da USP
de Histologia e Embriologia do ICB da USP", onde serão alocados os equipamentos adquirdos com nosso primeiro projeto multi-usuários.

Projeto inicial de criação de infraestrutura do Laboratóriode Comunicação Celular

Sumário do Projeto
A finalidade do corrente projeto é investigar a função celular da endo-oligopeptidase 24.15 (EC 3.4.24.15; EOP24.15), que também é conhecida como endo-oligopeptidase A (Camargo et al., 1973; Carvalho and Camargo, 1981), metalloendopeptidase (Orlowski et al., 1983), pz-peptidase ou thimet-oligopeptidase (revisto por Tisljar, 1993 e Barrett et. al., 1995).