Lorena Lôbo de Figueiredo Pontes.

FAPESP (Auxílio à Pesquisa Regular, Fixação de Jovens Doutores, Processo 2024/02164-5); vigência: 01/07/2024 a 30/06/2026

FAPESP (Auxílio à Pesquisa Regular, SPRINT Projetos de Pesquisa Mobilidade, Processo 2024/00286-6); vigência: 01/06/2024 a 31/05/2026.

A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa tratada atualmente com inibidores de tirosinoquinase (ITQ), drogas de alto custo fornecidas pelo Sistema Único de Saúde (SUS). A introdução dos ITQs mudou a história natural da doença, diminuindo drasticamente as taxas de transformação para fase blástica, aumentando a sobrevida dos pacientes, de uma taxa histórica de 10-20% para acima de 80%, resultando numa expectativa de vida atual semelhante à da população normal. Por outro lado, o consequente aumento da prevalência da LMC gera um aumento progressivo do impacto econômico sobre o SUS. Além disso, o uso prolongado dos ITQ está associado a eventos adversos crônicos associados a redução da qualidade de vida destes pacientes. Estudos recentes mostram que o tratamento com ITQ pode ser descontinuado em uma parcela significativa de pacientes que obtêm resposta molecular profunda sustentada, o que representa uma oportunidade para redução da toxicidade a longo prazo e do impacto econômico deste tratamento para o SUS. Entretanto, a remissão livre de tratamento a longo prazo ainda é uma realidade para uma minoria dos pacientes, e não há até o momento definição clara de biomarcadores que permitam predizer a chance de manutenção ou perda da resposta molecular após a suspensão do ITQ. Assim, esta proposta consiste em estudo de iniciativa dos investigadores, multicêntrico, aberto, prospectivo, não randomizado, de único braço para avaliação da efetividade e eficiência de um protocolo de descontinuação de ITQs no SUS, por meio da análise de: (1) varáveis clínicas como tempo de remissão livre de terapia, cinética da resposta molecular do BCR-ABL1, segurança desta estratégia, qualidade de vida e custo-efetividade para os participantes bem como (2) da avaliação de biomarcadores possivelmente associados à manutenção da resposta molecular maior sustentada tais como expressão de microRNAs e fenótipo de células citotóxicas T e Natural Killer (NK).

As células Natural Killer (NK), principal subtipo dentre as Células Linfoides Inatas (do inglês, ILCs), podem afetar a frequência e a auto-renovação das células-tronco hematopoéticas normais (Figueiredo-Pontes et al, Stem Cell Reports, 2021). Por outro lado, disfunção da maturação NK pode contribuir para a leucemogênese em neoplasias mieloproliferativas (NMP) (Bianco Arantes et al, submetido, Frontiers in Oncology, 2021) e leucemia mieloide aguda (LMA). Nossos dados preliminares sugerem um desvio das células NK de altamente citotóxicas para imaturas e secretórias que favorece a sobrevivência de Células Iniciadoras da Leucemia (do inglês, LICs). Evidências de evasão imune em diversos modelos de câncer nos levam à hipótese de que as LICs sejam resistentes às ILCs (em particular às células NK). Assim, em neoplasias mieloides, a exposição ao microambiente leucêmico pode impedir a maturação funcional e a atividade anti-leucêmica das células imunes. O plano de pesquisa atual terá como foco a variabilidade molecular das células citotóxicas imunes e seus mecanismos de evasão imunológica na fisiopatologia das neoplasias mieloides. Pretendemos desenvolver um mapeamento transcricional e imunofenotípico de ILCs presentes em modelos de NMP e LMA por meio de sequenciamento de RNA (single-cell RNA-seq) e citometria de fluxo multiparamétrica. Modelos leucêmicos quiméricos (Bcr-abl1, Jak2V617F e AML1-Eto9a) serão usados para investigar mecanismos e vias de sinalização envolvidos na interação NK:LIC. Esperamos que a caracterização robusta das células imunes inatas contribua para o desenvolvimento de estratégias capazes de restabelecer o efeito imune antitumoral em neoplasias mieloides, que até o presente momento apresentam baixas taxas de cura.

A COVID-19 é uma doença infecciosa causada pelo vírus SARS-CoV-2, descrita pela primeira vez no final de 2019. Desde então, tem acometido uma parcela crescente da população mundial devido à sua alta transmissibilidade. Em geral, cursa sem alterações clínicas ou com sintomas leves, porém em cerca de 5-10 dos casos pode ocasionar quadros graves, com síndrome respiratória aguda grave, choque, lesão renal, injúria miocárdica e até morte. Estas manifestações parecem mais comuns em indivíduos com hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus, obesidade e doenças crônicas pulmonares. Entretanto, como a descrição da doença é recente, ainda há poucos estudos que esclareçam sua história natural e o grande espectro de suas manifestações clínicas. Considerando que indivíduos com neoplasia maligna apresentam algum grau de deficiência imunológica e maior risco de doenças infeciosas oportunistas, especialmente aqueles em tratamento com quimioterapia com drogas imunossupressoras, é possível que haja uma maior incidência da COVID-19 nesse grupo. Até o momento, há poucos dados na literatura, incluindo apenas coortes retrospectivas, apontando para esta associação. Portanto, novos estudos em indivíduos com câncer são relevantes para guiar a conduta quanto à necessidade de investigação laboratorial da doença antes da quimioterapia, capaz de acentuar mecanismos de deficiência imunológica e levar a desfechos graves da COVID-19. As recomendações atuais de especialistas em Oncologia recomendam adiar tratamentos e utilizar drogas menos tóxicas quando possível, ou seja, quando a estimativa do risco de morte por COVID-19 é maior do que a mortalidade esperada pela neoplasia. Entretanto, neoplasias com elevado risco de letalidade não podem ter seu tratamento postergado. Não sabemos o quanto tais medidas terão implicações na mortalidade por câncer e não conhecemos a incidência real de COVID-19 nos pacientes oncológicos. Diante disso, esta pesquisa objetiva estudar uma coorte prospectiva de 200 pacientes com neoplasias malignas em tratamento quimioterápico no serviço de Hematologia e no serviço de Oncologia do Hospital das Clínicas da FMRP-USP para determinar a incidência de infecção por SARS-CoV-2 por meio de RT-PCR. Em paralelo, pretendemos confirmar e acompanhar os potenciais casos de COVID-19 nestes pacientes com sorologia para detectar anticorpos IgM e IgG. Acredita-se que os resultados possam contribuir para a formulação de recomendações quanto ao adiamento, suspensão ou modificação do tratamento destes pacientes, a fim de reduzir o número de indivíduos acometidos pela COVID-19 sem comprometer excessivamente a eficácia do seu plano terapêutico.

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) são doenças causadas por mutações em células-tronco da medula óssea que levam a um ganho de proliferação celular, resultando em aumento das contagens de uma ou mais séries de células sanguíneas (eritroide, granulocítica e megacariocítica). Apesar de apresentarem potencial de transformação para mielofibrose e leucemia mielode aguda, caracterizam-se por alterações inflamatórias, disfunção endotelial e ativação da coagulação que predispõem à trombose. Assim, eventos tromboembólicos, sobretudo os arteriais, são frequentes em pacientes com NMP e constituem sua principal causa de morbimortalidade. Diversos parâmetros clínicos, laboratoriais e moleculares podem estar relacionados à maior ou menor incidência de trombose nestas neoplasias. Dado que as descobertas sobre a fisiopatologia das NMPs e de seus mecanismos de trombogênese são recentes, ainda há poucos estudos destinados a caracterizar os eventos trombóticos mais incidentes nesses pacientes considerando o sítio anatômico e a rede vascular (arterial ou venosa) acometidos, a caracterização detalhada destes eventos bem como o tempo de ocorrência em relação à data do diagnóstico. Ademais, apesar do conhecimento sobre os principais fatores de risco que direcionam a terapêutica atual, tais como idade acima de 60 anos, presença da mutação JAK2 e ocorrência prévia de trombose, a relevância de outros fatores de risco cardiovasculares e marcadores laboratoriais de trombose permanece elusiva. A presente pesquisa tem por objetivo estudar a coorte de pacientes com NMPs em acompanhamento no serviço de hematologia do HC-FMRP USP para determinar a incidência de seus eventos trombóticos e caracterizá-los, bem como correlacioná-los ao tipo de NMP (Policitema Vera, Trombocitemia Essencial ou Mielofibrose Primária), fatores de risco cardiovasculares, estratificação de risco, presença de mutações iniciadoras (JAK2, CALR e MPL), contagens de leucócitos e plaquetas ao diagnóstico e presença de marcadores pró-trombóticos circulantes (DNA-mieloperoxidase). Espera-se que os resultados deste trabalho auxiliem na elaboração de abordagens terapêuticas mais individualizadas para os pacientes com NMPs, que contemplem parâmetros clínicos, laboratoriais e as características fenotípicas de suas doenças, no intuito de prevenir eventos tromboembólicos e promover melhoria em qualidade de vida e sobrevida.

Considerando que as células-tronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de citocinas como IFNg, TNFa, TGFb, GM-CSF, MIP1, IL-10 e outras, acreditamos que a atividade secretora das células Natural Killer (NK) possa regular a função da CTH (subprojeto 1) e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna (subprojeto 2). Para avaliar o papel das células NK na hematopoese normal, pretendemos co-cultivar células NK (normais e deficientes, oriundas de animais do modelo condicional murino Cebpg knockout) e CTH normais, e avaliar os efeitos das células NK sobre a proliferação e capacidade de reconstituição hematopoética da CTH, além de investigar os mecanismos dessa regulação por meio de estudos de expressão gênica e do perfil de citocinas NK. Na segunda parte do projeto, pretendemos estudar a regulação das CTH iniciadoras das neoplasias mieloproliferativas (NMP) pela atividade NK por meio do uso de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da mutação Jak2V617F (Jak2VF), o qual recapitula as principais características clínicas e laboratoriais da Policitemia Vera humana. Observamos recentemente que os camundongos Jak2VF tem menores números de células NK quando comparados aos controles e objetivamos estudar o imunofenótipo, ativação de receptores, perfil de citocinas e função desta população de células. Planejamos co-cultivar células NK Jak2WT e Jak2VF com CTH e avaliar a sua proliferação, diferenciação e potencial de auto-renovação. Em resumo, almejamos estudar a regulação entre CTH e células NK, as quais podem colaborar na tarefa de regular a hematopoese normal e maligna, objetivando identificar novos alvos terapêuticos que possam interferir nesta complexa interação.

Descrição: Apesar da importância das células NK na imunidade e hematopoese, pouco se sabe acerca dos mecanismos moleculares que os regulam. Sabe-se que o fator de transcrição C/EBPG está envolvido na maturação funcional de células NK. Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. Pretendemos com esta proposta estudar os mecanismos dependentes do C/EBPG que regulam a função secretória das células NK. Utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvo com potencial para regulação da hematopoese. Concluímos, até o presente momento, que as células NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, maior potencial secretório e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFN#947;, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK.

Descrição: o estudo tem como objetivo principal a disponibilização de métodos citogenéticos e moleculares, bem como a padronização do tratamento e do método de pesquisa da doença residual mínima (DRM) para pacientes com LMA (excluindo-se os casos de leucemia promielocítica aguda) em centros brasileiros. O segundo objetivo é testar a viabilidade do tratamento de consolidação usando o transplante autólogo de células progenitoras hematopoéticas em pacientes com LMA de baixo risco e de risco intermediário sem doador HLA compatível. O estudo de viabilidade do protocolo de DRM constitui um trabalho secundário de estabelecimento de um painel de 8 cores de citometria de fluxo multiparamétrica bem como da metodologia de análise da DRM e correlação prospectiva com fatores prognósticos e resposta ao tratamento dos pacientes com LMA incluídos no ICAML2015.

Descrição: Acreditamos que a expressão anômala de BCL2 nas células progenitoras hematopoéticas (CPH) das NMPs pode contribuir para a patogênese desse grupo de doenças. Avaliamos a expressão gênica, por meio de PCR em Tempo Real, da família BCL2 (genes antiapoptóticos BCL-xL e BCL2 e o pró-apoptótico BIM) nas diferentes subpopulações de progenitores hematopoéticos murinos (de um modelo condicional knockin de expressão heterozigótica condicional da Jak2V617F) e de pacientes portadores de NMPs bem como sua contribuição para o fenótipo da doença e resposta ao inibidore da JAK2 (com a droga ruxolitinibe) e/ou inibição da família BCL2 (com o inibidor de BCL2 obatoclax). Observamos que componentes da família BCL2 são diferencialmente expressos no modelo murino de NMP JAK2V617F, com maior expressão de Bcl-xL em mieloprogenitores (MPs) em relação à subpopulação de células mais imaturas Linhagem negativas, Sca-1+ e cKit+ (LSKs) e menor expressão de Bim em LSKs em relação às células MPs dos animais mutados. Após tratamento ex-vivo de células primárias com os inibidores de JAK2 e BCL2, observou-se que as células LSKs foram mais resistentes à apoptose o que as células MPs independentemente da mutação da JAK2. Além da resistência à apoptose, demonstrou-se que o tratamento combinado com ruxolitinibe e obatoclax resultou no aumento de apoptose dos progenitores hematopoéticos JAK2 mutados em relação aos animais Jak2 controles. Em conclusão, demonstramos que a resistência à apoptose nas NMPs ocorre desde as CPH iniciadoras da doença. Assim, a modulação de apoptose mitocondrial pode ser uma nova estratégia terapêutica para pacientes com NMP em combinação aos inibidores de JAK2, na medida em que atua tanto nas CPH que iniciam a doença como nos MPs, responsáveis pelos sinais e sintomas de mieloproliferação.

CEBPG é preferencialmente expresso em células progenitoras hematopoéticas quando comparadas às células mielóides mais diferenciadas. Assim, a nossa hipótese é a de que a expressão do CEBPG seja essencial à manutenção da função da células tronco e que a perda de sua expressão resulte em função deficiente, ou seja, em capacidade multipotencial e de auto-renovação prejudicadas. Observamos, que a enxertia de células-tronco hematopoéticas provenientes dos camundongos knockout é menor quando comparada àquela dos progenitores normais para a expressão do CEBPG e os mecanismos responsáveis por tal defeito estão em estudo no momento.

Descrição: O projeto incluiu determinação preferencial da expressão de proteínas ligadas à resistência a múltiplas drogas (P-gp, MRP, BCRP, LRP) em subpopulações de células CD34+CD38-CD123+, contendo as células-tronco iniciadoras da LMA em relação aos progenitores mais maduros CD34+CD38+. Ademais, desenvolveu-se um estudo de avaliação do benefício da adição de ciclosporina A ao tratamento com citarabina e daunorrubicina em pacientes com LMA na ocasião do diagnóstico, recaída e/ou refratariedade, com fenótipo MDR detectado por meio de ensaio funcional por citometria de fluxo. Além de analisar o efeito antileucêmico desta combinação de drogas, o estudo avaliou a tolerância e toxicidade do esquema. A análise final revelou que, apesar de induzir maiores taxas de remissão completa, a associação da droga inibidora de MDR à terapia convencional na indução de remissão para LMA não foi capaz de prolongar a sobrevida livre de doença ou sobrevida global.

Na LPA, a expressão do PML/RARA está associada à resistência às ações do TGFβ e aumento da angiogênese. A halofuginona (HF) é um alcaloide capaz de regular o TGFβ e reduzir a angiogênese em tumores não hematopoéticos. Demonstramos maior expressão do TGFβ em células leucêmicas da LPA do que em células normais da medula óssea (MO). A quantificação do TGFβ, VEGF e angiogenina mostrou que as células leucêmicas secretam altos níveis desses fatores angiogênicos. A imunoistoquímica da MO de camundongos leucêmicos PML-RARα revelou aumento da densidade microvascular e do VEGF em relação aos animais selvagens. Um modelo condicional retroviral no qual a expressão do PML-RARα era regulada pela tetraciclina foi gerado em precursores hematopoéticos, e, na presença do PML-RARα, o Tgfβ se encontrou reprimido, resultando em regulação do c-Myc, sendo este efeito acentuado pelo tratamento das células com HF. Células NB4 e NB4-R2, esta última resistente ao ATRA, foram cultivadas sob doses crescentes de HF, observando-se que a droga inibiu o crescimento celular e induziu apoptose, além de bloquear o ciclo celular na transição G1/S de maneira dose-dependente. A análise da expressão de genes-alvo do TGFβ em resposta à HF mostrou aumento de TGFβ, TβRI, P15, P21 e SMAD3 e repressão do c-MYC em ambas as linhagens. Os resultados mostraram que na LPA: (1) a angiogênese está aumentada; (2) a regulação dos genes-alvo do TGFβ é dependente do PML-RARα; e (3) a HF teve efeitos antiproliferativos e antiangiogênicos, revertendo o bloqueio da sinalização do TGFβ. Embora a desregulação das vias do TGFβ e VEGF não seja suficiente para iniciar a transformação maligna, esta pode ser um segundo evento que contribui para a progressão leucêmica. Nesse contexto, a modulação da sinalização do TGFβ e da angiogênese pode ter potencial terapêutico.