Adalberto Pessoa Junior.

Para o desenvolvimento do projeto de PDI Aproveitamento de óleos de cozinha residuais em formulações de bioprodutos cosméticos, a ser executado em regime de cooperação científica e tecnológica entre pesquisadores e suas instituições, e traz benefícios mútuos, promovendo a integração de conhecimentos científicos e tecnológicos voltados à valorização de resíduos oleosos em produtos de aplicação cosmética e de higiene. Essa cooperação fortalece os programas de pesquisa aplicada em farmácia, biotecnologia e engenharia de bioprocessos da USP, ao mesmo tempo que potencializa a inovação tecnológica da ÓiaFia!, contribuindo para o desenvolvimento de soluções sustentáveis com impacto socioambientalpositivo. Além disso, fomenta a formação de redes de pesquisa, intercâmbio de metodologias ecapacitação técnica e científica.

Segundo a ONU, o Brasil enfrenta desafios significativos em relação à insegurançaalimentar e à desnutrição. Atualmente, 8,7 milhões de brasileiros passam fome, enquanto70,3 milhões experimentaram insegurança alimentar recentemente. Entre 2020 e 2022,10,1 milhões de pessoas foram afetadas pela desnutrição, que impacta principalmentecrianças, idosos e moradores de rua. A situação dos moradores de rua é crítica, com maisde 281 mil pessoas vivendo nessas condições em 2024, um número expressivo devido aproblemas familiares, desemprego, uso de substâncias e perda de moradia, exacerbadospela pandemia de COVID-19. O projeto "Recomeçar" visa capacitar moradores de ruaatravés de cursos em processamento de alimentos, educação nutricional, e práticas desimplificadas em gestão de negócios alimentares. A iniciativa não só combate ainsegurança alimentar, mas também promove a inclusão social e econômica, alinhando-se aos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável da ONU. As atividades incluempalestras, minicursos, visitas técnicas e análises de alimentos, com foco na autonomia ebem-estar dos participantes. Três turmas de até 15 pessoas receberão formação em BoasPráticas de Fabricação e gestão de negócios alimentares, utilizando uma metodologia queabrange desde diagnósticos iniciais até aulas práticas e teóricas sobre fluxo de caixa ecustos de produção. O objetivo é fornecer ferramentas que permitam aos participantesmelhorar suas condições de vida e contribuir para a redução das desigualdades sociais eeconômicas.

Os óleos essenciais são metabólitos secundários extraídos dediversas partes de plantas medicinais e aromáticas. Uma mesma espéciebotânica pode ser afetada pelo local de cultivo, condições de coleta,estabilização e estocagem, além dos fatores ambientais. Diante da possibilidadede utilização dos óleos essenciais como aromatizantes, pretende-se por meioprojeto capacitar estudantes da graduação para o exercício da práticafarmacêutica e transmissão do conhecimento para a comunidade sobre produtosde origem vegetal, com enfoque no emprego de plantas medicinais na obtençãode produtos aromáticos e de higiene. Prestem-se, ainda, ofertar treinamentospara a comunidade sobre a produção de velas aromáticas e sabonetesmoldados, assim como, exercer o cuidado farmacêutico como a população emvulnerabilidade socioeconômica sobre o uso racional de produtos de higiene etécnicas de higienização, bem-estar e saúde.

R$ 56.900,00 - custeio e capital

As Hialuronidases são uma classe de enzimas pertencentes às endoglucanases que clivam cadeias do biopolímero Ácido Hialurônico (AH). São empregadas pela indústria cosmética e, sobretudo, na área médica/farmacêutica, como auxiliares durante cirurgias e como medicamentos para reversão de procedimentos estéticos que envolvem a aplicação de AH. As hialuronidases, ainda hoje, são obtidas por extração de tecidos animais, principalmente bovinos e ovinos, em um processo caro e difícil de purificar para aplicação médica. Como alternativa, foram criados diversos sistemas de expressão das hialuronidases que usam células de bactérias, de leveduras, de mamíferos, de algas e de insetos. As hialuronidases são divididas em três diferentes classes e atuam de formas específicas, pois clivam as cadeias de AH em diferentes sítios. Algumas enzimas clivam as ligações #946;-1,3 do AH, enquanto outras clivam as ligações #946;-1,4. Ainda hoje, não existe nenhum produto ou processo que tenha simultaneamente unido duas classes diferentes de hialuronidases. Em função disto, este projeto possui como objetivo o desenvolvimento de um produto biotecnológico à base de hialuronidases mais eficiente que os já existentes por unir em um mesmo sistema de expressão as diferentes hialuronidases, em que as classes II e III serão expressas em levedura (Kluyveromyces lactis) e a classe III expressa em bactéria (Escherichia coli). Após selecionada a cepa de microrganismo (K. lactis ou E. coli) que proporcionar características mais adequadas para a produção de hialuronidase, será desenvolvido e otimizado um processo de produção da(s) enzima(s) em escala de shaker e, na sequência, em biorreator de 3 litros, em modo batelada, para levantamento dos dados cinéticos de crescimento celular, produção e produtividade da(s) enzima(s).

A contribuição da investigação científica para o alcance da urgente transição energética mundial é inquestionável e inseparável daquela que busca a ampliação do portifólio de produtos com tecnologias convergentes em um modelo de biorrefinaria do setor sucroalcooleiro em um contexto de bioeconomia. Dentro desta premissa objetiva-se com este projeto estabelecer uma plataforma bioquímica de produção de biomoléculas a partir do bagaço e palha de cana e da biodiversidade de leveduras da Antártica. A relevância da investigação é amparada pela contribuição com inovações e/ou avanços nas diferentes vertentes dentro do aproveitamento de biomassas vegetais de forma integral de suas 3 principais frações, a celulose, hemicelulose e a lignina. Os vastos e longos estudos para a obtenção de biomoléculas a partir da biomassa de cana ocorrem em grande parte com estas frações nem sempre em conjunto e ainda existem lacunas quanto ao aproveitamento biotecnológico de seus principais compostos constituintes carboidratos (C6 e C5) e não carboidratos (fenólicos) particularmente no que se refere a toxicidade natural dos hidrolisados lignocelulósicos. E ainda, o aproveitamento da biodiversidade de microrganismos extremófilos como as leveduras isoladas a partir de amostras de ambientes marinhos e terrestres da Antártica propicia inovações tecnológicas concomitante à exploração de novas abordagens da pesquisa de forma coesa contribuindo com o conhecimento do estado fisiológico destes microrganismos em meios complexos como os hidrolisados lignocelulósicos. Para tanto, a aplicação da principal técnica proposta nesta pesquisa, a de citometria de fluxo, vem a se somar a outras convencionalmente já estudadas em bioprocessos de utilização de biomassas vegetais os quais ocorrem em 3 etapas primordiais: desconstrução da parede celular vegetal, estabelecimento das condições de fermentação e separação das biomoléculas produzidas. Assim, visando contribuir para o estabelecimento de um modelo de biorrefinaria de cana-de-açúcar com a particularidade da heterogeneidade da matéria-prima, as metas prioritárias foram delineadas nas diferentes fases de obtenção e preparo dos hidrolisados celulósico, hemicelulósico e lignina solúvel; seleção das leveduras para obtenção das biomoléculas xilitol, biossurfactante, carotenoides e lipídeos; produção das biomoléculas para estudo cinético do processo; separação das biomoléculas produzidas; testes de aplicabilidade das biomoléculas; avaliação da viabilidade técnico econômica. A investigação do material microbiológico (leveduras de origem Antártica) e dados associados do Biobanco Central de Recursos Microbianos da UNESP-Rio Claro (CRM-UNESP) se alinha à concepção de biobancos microbianos como estrutura de base para o desenvolvimento sustentável e da bioeconomia, que juntamente com esta rede de pesquisadores especialistas nas diferentes áreas de conhecimento, se constitui em um forte indicador para a contribuição deste modelo de plataforma como uma diretriz para outras biomassas vegetais e biomoléculas.

O Brasil possui 25 da biodiversidade mundial, dispersa em biomas únicos, com grande potencial para uma produção sustentável. Entretanto, é ainda dependente de insumos importados, o que encarece o sistema produtivo. Ao viabilizar a bioconversão de biomassa vegetal, algal e microbiana em ingredientes alimentícios, compostos bioativos, bioenergia e bioinsumos agrícolas, os bioprocessos estimulam as cadeias produtivas, seguindo as legislações ambientais e as políticas de prevenção ao desmatamento. Apesar dos benefícios associados ao uso sustentável da agrobiodiversidade em bioprocessos, a falta de processos escalonáveis representa uma barreira à aplicação de novas tecnologias, impedindo que protótipos saiam da escala laboratorial e sejam implementados industrialmente. Sem o escalonamento, o custo deprodução permanece elevado, inviabiliza a competitividade e desestimula os investimentos. O propósito deste projeto é desenvolver, escalonar e aplicar bioprodutos, por meio da criação de biofábricas, alinhadas aos conceitos de biorrefinaria e economia circular, em conformidade com os ODS para o desenvolvimento sustentável do país. O aumento de TRL em bioprocessos é fundamental para o posicionamento do Brasil no mercado. Neste contexto, propõe-se a criaçãodo INCT Biofábricas, por meio da integração de pessoal altamente qualificado e de infraestrutura física com histórico relevante na área e de um movimento crescente de startups e empresas de biofábricas. Os grupos de pesquisa que compõem o INCT Biofábricas possuem comprovada atuação na área, produzindo e disseminando conhecimento de impacto científico e tecnológico, desenvolvendo e transferindo tecnologias e formando recursos humanos qualificados. Provadessa liderança pode ser atestada pelas cartas de apoio à presente proposta, envolvendo empresas, cooperativas, fundações de apoio, instituições internacionais e associações (ABBI e Rede SulBiotec) com quem os pesquisadores da rede possuem vasto histórico de parcerias.

O objetivo deste projeto é desenvolver um processo de produção de anticorpos monoclonais com potencial para tratamento de câncer de câncer

Projeto PIPE 1 - FAPESP 2024/09080-1 - A presente proposta tem por objetivo a produção recombinante das proteínas elicitoras Flagelina, Flg22, Harpin e Harpin Hpa10-47 em plataforma de Escherichia coli e Kluyveromyces lactis e, posterior, a sua avaliação ex vivo em modelo de Glycine max (soja). Trata-se de conceitos bem estabelecidos na área de proteção de plantas, os quais utilizam diferentes elicitores para a indução de resistência sistêmica. A novidade da presente proposta está na utilização de PAMPs expressos de forma heteróloga para a geração de um produto comercial para o uso em uma estratégia de controle integrado de doenças.

As Hialuronidases são uma classe de enzimas pertencentes às endoglucanases que clivam cadeias do biopolímero Ácido Hialurônico (AH). São produzidas pela indústria cosmética e, sobretudo, na indústria médica/farmacêutica, usadas como auxiliadoras durante cirurgias e como medicamentos para reversão de procedimentos estéticos que envolvem a aplicação de AH. As hialuronidases, ainda hoje, são obtidas por extração de tecidos animais, principalmente bovinos, em um processo caro e difícil de purificação para aplicação médica. Como alternativa, foram criados diversos sistemas de expressão das hialuronidases que usam células de bactérias, de leveduras, de mamíferos, de algas e de insetos. As hialuronidases são divididas em 3 diferentes classes e atuam de formas específicas, pois clivam as cadeias de AH em diferentes sítios. Algumas enzimas clivam as ligações -1,3 do AH, enquanto outras clivam as ligações -1,4. Os sistemas de expressão envolvendo o uso de E. coli podem resultar em processos com baixa produtividade de Hialuronidases comparados com os sistemas envolvendo o uso de leveduras. Ainda hoje, não existe nenhum produto ou processo que tenha simultaneamente unido 2 classes diferentes de hialuronidases. Em função disto, este projeto possui como objetivo o desenvolvimento de um produto biotecnológico à base de hialuronidases mais eficiente que os já existentes por unir em um mesmo sistema de expressão as diferentes hialuronidases, em que as classes II e III serão expressas em levedura (Kluyveromyces lactis) e a classe III expressa em bactéria (Escherichia coli). Após selecionada a cepa de microrganismo (K. lactis ou E. coli) que proporcionar as características mais adequadas para a produção de hialuronidase, será desenvolvido e otimizado um processo de produção da(s) enzima(s) em escala de shaker e, na sequência, em biorreator de 3 litros, em modo batelada, para levantamento dos dados cinéticos de crescimento celular, produção e produtividade da(s) enzima(s).

O Ácido Hialurônico (AH) é um biopolímero composto por repetições alternadas de ácido glucurônico (GlcUA) e N-acetil glucosamina (GlcNAc) e está presente em todos os vertebrados. Segundo projeções da empresa Grand View Research, o mercado global de AH foi avaliado em 10,80 bilhões de dólares em 2020 e projeta-se um crescimento anual composto de 8,1, além de atingir o valor de 14,48 bilhões de dólares em 2027. Devido às suas propriedades reológicas e físico-químicas, o AH encontra-se em frequente ascensão na utilização da formulação de diversos cosméticos, produtos associados a cirurgias médicas, suplementação alimentar, bem como nas áreas de medicamentos, oftalmologia, ortopedia, reumatologia e dermatologia. No Brasil, o AH utilizado em produtos é em sua grande maioria obtido por importação de outros países. O AH é produzido naturalmente por bactérias pertencentes ao gênero Streptococcus que são patogênicas e consequentemente dificultam a manipulação segura do microrganismo em laboratório e posterior cultivo em biorreatores. O processo de escalonamento das tecnologias usando estas células também é altamente custoso devido às altas exigências de biossegurança e purificação. Adicionalmente, o AH é extraído de tecidos animais como crista de galo e globo ocular de bovino, entretanto, as grandes companhias de fabricação de cosméticos, que são as principais interessadas na comercialização do AH, evitam a utilização de produtos de origem animal em suas formulações. Como alternativa a essas bactérias e tecidos animais, organismos geneticamente modificados (OGMs) vêm sendo desenvolvidos para sintetizar AH, alcançando valores de produção similares a bactérias do gênero Streptococcus. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de um processo economicamente viável e escalonável para produção de AH vegano e cruelty-free de grau cosmético e médico utilizando K. lactis. Serão realizadas otimização de meios de cultura e determinadas condições de produção em biorreator de bancada. As técnicas de purificação também serão otimizadas a fim de obter AH de grau de pureza compatível com aplicações cosméticas e médicas. Durante todas essas etapas de desenvolvimento serão realizadas avaliações técnico-econômicas do processo objetivando diminuição de custo e eficiência de processo. Por fim, será realizada uma profunda caracterização do AH produzido por K. lactis seguindo padrões de qualidade estabelecidos pelas farmacopeias e agências regulatórias. Também serão realizados testes de segurança em culturas de células e tecidos. Concomitante ao processo de PD será realizado o desenvolvimento comercial do projeto. Inicialmente o objetivo é a comercialização do AH produzido por K. lactis como um produto destinado a pesquisa (Research Use Only). Posteriormente, com o avanço do desenvolvimento do processo, pretende-se buscar certificações de qualidade para alcançar o mercado cosmético, tais como empresas que utilizam AH nas formulações de cremes, shampoos e protetores solares. Por fim, o objetivo comercial a longo prazo e a produção do AH destinado a mercados nobres, tais como oftalmologia, ortopedia, reumatologia e dermatologia. No Brasil não existe atualmente nenhuma tecnologia de produção de AH por OGM e apenas poucos estudos são focados na caracterização do AH produzido por cepas patogênicas. Após o fim deste projeto, é esperada a obtenção do primeiro processo economicamente viável e escalonável para produção de AH utilizando uma cepa OGM no Brasil. Além disso, acreditamos que o desenvolvimento deste projeto contribuirá para o desenvolvimento de tecnologia nacional de produção de biopolímeros utilizando OGM a qual poderá ser empregada futuramente em outros produtos.

Resíduos agroindustriais, como sabugo de milho, possuem blocos de construção renováveis, como celulose, hemicelulose e lignina, que são muito atraentes para um amplo espectro de aplicações industriais e de consumo. No entanto, para o desenvolvimento viável de processos tecnológicos para obtenção de produtos sustentáveis, diferentes pré-tratamentos (termoquímicos, químicos e enzimáticos) devem ser realizados na biomassa. A tecnologia de extrusão dupla rosca pode ser um método de pré-tratamento viável devido à exposição simultânea da biomassa sob condições de cisalhamento em diferentes temperaturas em um processo de fluxo contínuo. Além disso, sua combinação com fracionamento por solvente (organosolv) pode separar as frações (celulose, hemicelulose e lignina) com alta pureza e baixa geração de efluentes. A pirólise rápida é uma tecnologia que converte a estrutura lignocelulósica em uma mistura líquida de moléculas de menor massa molecular, denominada bio-óleo, rica em monômeros e oligômeros aromáticos (lignina pirolítica). Este projeto propõe o uso do sabugo de milho em diferentes rotas de extração (pirólise, química e enzimática) para obter carbono sustentável a partir da despolimerização de diferentes ligninas (organosolv, enzimática e pirolítica) em que o maior desafio está na despolimerização da lignina pirolítica. Haverá monitorização e caracterização avançada dos produtos, ou seja, ao nível molecular, pois é fundamental conhecer em profundidade a composição química destes produtos. Os monômeros obtidos são uma fonte primária de hidrocarbonetos e compostos aromáticos contendo carbono renovável com um vasto potencial de aplicação industrial. O projeto também prevê como carbono sustentável, a obtenção de açúcares solúveis e nanolignina, e a utilização do biocarvão produzido no processo de pirólise para obtenção de nanobiocarvão funcional com potencial de uso na imobilização covalente de enzimas, criossorção e aplicação na descontaminação de líquidos e gases. Em etapas estratégicas será realizada uma avaliação ambiental do ciclo de vida para verificar os benefícios potenciais desta nova proposta. Com essa prerrogativa, espera-se buscar produtos de fontes renováveis a partir de biomassa residual abundante no Brasil com o apoio de parceiros de instituições brasileiras e alemã, visando estimular o desenvolvimento nacional de uma indústria que no Brasil ainda é incipiente, mas que na Europa já está prosperando, com várias startups de sucesso estabelecidas.

O Ácido Hialurônico (AH) é um biopolímero composto por repetições alternadas de ácido glucurônico (GlcUA) e N-acetil glucosamina (GlcNAc) e está presente em todos os vertebrados. Segundo projeções da empresa "Grand View Research", o mercado global de AH foi avaliado em 10,80 bilhões de dólares em 2020 e projeta-se um crescimento anual composto de 8,1, além de atingir o valor de 14,48 bilhões de dólares em 2027. Devido às suas propriedades reológicas e físico-químicas, o AH encontra-se em frequente ascensão na utilização da formulação de diversos cosméticos, produtos associados a cirurgias médicas, suplementação alimentar, bem como nas áreas de medicamentos, oftalmologia, ortopedia, reumatologia e dermatologia. No Brasil, o AH utilizado em produtos é em sua grande maioria obtido por importação de outros países. O AH é produzido naturalmente por bactérias pertencentes ao gênero Streptococcus que são patogênicas e consequentemente dificultam a manipulação segura do microrganismo em laboratório e posterior cultivo em biorreatores. O processo de escalonamento das tecnologias usando estas células também é atrasado devido aos custos de biossegurança e purificação. Como alternativa a essas bactérias, organismos geneticamente modificados (OGMs) vem sendo desenvolvidos para sintetizar AH, alcançando valores de produção similares a bactérias do gênero Streptococcus. No Brasil, uma cepa OGM da levedura Kluyveromyces lactis, chamada cepa BAP, foi previamente modificada para produzir AH. Este foi o primeiro estudo na literatura a usar K. lactis como plataforma para síntese de AH; a primeira levedura produtora de AH OGM criada no Brasil e a segunda no mundo. Cultivos em biorreator utilizando a cepa BAP apresentaram uma produtividade de 1,89 g/L de AH sem nenhuma otimização de meio de cultura e condição de fermentação. Neste contexto o objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de um processo economicamente viável e escalonável para produção de AH de grau cosmético e médico utilizando K. lactis. Serão realizadas otimização de meios de cultura e determinadas condições de produção em biorreator de bancada. As técnicas de purificação também serão otimizadas a fim de obter AH de grau de pureza compatível com aplicações cosméticas e médicas. Durante todas essas etapas de desenvolvimento serão realizadas avaliações técnicos-econômicas do processo objetivando diminuição de custo e eficiência de processo. Por fim, será realizada uma profunda caracterização do AH produzido por K. lactis seguindo padrões qualidade estabelecidos pelas farmacopeias e agências regulatórias, e também serão realizados testes de segurança em culturas de células e tecidos. Concomitante ao processo de PD será realizado o desenvolvimento comercial do projeto. Inicialmente o objetivo é a comercialização do AH produzido por K. lactis como um produto destinado a pesquisa (Research Use Only). Posteriormente, com o avanço do desenvolvimento do processo, pretende-se buscar certificações de qualidade para alcançar o mercado cosmético, tais como empresas que utilizam AH nas formulações de cremes, shampoos e protetores solares. Por fim, o objetivo comercial a longo prazo e a produção do AH destinado a mercados nobres, tais como oftalmologia, ortopedia, reumatologia e dermatologia. No Brasil não existe atualmente nenhuma tecnologia de produção de AH por OGM e apenas poucos estudos são focados na caracterização do AH produzido por cepas patogênicas. Após o fim deste projeto, é esperada a criação da primeira cepa OGM brasileira produtora de AH com potencial de concorrência com as outras cepas existentes no mundo. Além disto, é esperada a criação da primeira tecnologia nacional utilizada para a produção de AH no Brasil.

Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common cancer in children worldwide and is
characterized by the overproduction of undifferentiated lymphoblasts in bone marrow. The treatment of first choice is the enzyme L-asparaginase (ASNase) isolated from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi. Its mechanism of action is to hydrolyse plasma L-asparagine to aspartic acid and ammonia. Leukemic cells, unlike healthy cells, are unable to synthesize enough L-asparagine for their survival, due to a reduction in expression of the asparagine synthetase gene. These cells must rely on plasma L-asparagine for survival and hence, ASNase causes malignant cell death by starvation. ASNase formulations from E. coli and E. chrysanthemi can cause significant adverse side-effects, especially immunogenicity. PEGylation of E. coli ASNase is a post-translational modification strategy to minimize immunogenicity. PEGylatioon involves covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to camouflage epitopes on the enzyme. However, conformational restrictions imposed by covalent binding of PEG decreases enzyme activity and the immune system also raises antibodies against PEG. This project has the following goals: 1) to optimize culture conditions to produce a chimeric E. coli ASNase in a 3L bioreactor; 2) to purify and N-terminal PEGylate this ASNase; 3) to characterize the structure and function of the enzyme; 4) evaluate in vitro cytotoxicity of the enzyme against different leukaemic cell lines; and 5) evaluate in vivo asparagine and glutamine depletion, and immunogenicity of the PEGylated-chimeric enzyme in mouse models of ALL. These variants are expected to be active, physicochemically stable and less immunogenic than existing E. coli ASNase, providing a platform for future biopharmaceutical development.

L-asparaginase é um dos medicamentos de escolha para o tratamento da Leucemia Linfoblástica aguda, um câncer agressivo do sangue que apresenta maior incidência na infância entre o segundo e quito ano de vida, sendo considerada o tipo mais comum em crianças. Em escala industrial, a enzima L-asparaginase comercializada é de origem bacteriana, produzida a partir de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi.No entanto, observam-se reações adversas e toxicidade importantes associadas ao uso da enzima de origem procariota. Assim, revela-se importante os trabalhos de identificação de fungos filamentosos produtores de L-asparaginase com potencial aplicação farmacêutica. Neste contexto, encaixa-se o estudo de caracterização morfo-molecular do isolado DCFS6 do solo do Cerrado do Centro-Oeste brasileiro e o subsequente estudo da produção heteróloga da enzima L-asparaginase. Ademais, o estudo ?Biobetters?, ou seja, o melhoramento de fármacos através de modificações químicas ou moleculares no produto original, pode reduzir a toxicidade do produto final, reduzir a imunogenicidade e alterar a farmacocinética e a farmacodinâmica, o que é de interesse no caso em estudo.Desta forma esse projeto visa produzir, purificar, caracterizar, estabilizar e liofilizar, por meio do cultivo de E. coli recombinante, a enzima heteróloga, e biofármaco, L-asparaginase clonada do fungo isolado do solo do Cerrado Brasileiro.

Asparaginase (ASNase) é utilizada no tratamento de cânceres do sistema linfático, em especial Leucemia Linfoide Aguda (LLA). A administração de ASNase pode provocar diversos efeitos adversos aos pacientes, incluindo efeitos tóxicos e respostas imunológicas que podem levar a choques anafiláticos. Nestes casos é possível continuar o tratamento com outras formulações de ASNase, porém ainda ocorrem repostas adversas em muitos pacientes e a maioria dos países não disponibiliza todas as formulações para tratamentos pelo alto custo e falta de registro nas agências regulatórias. Portanto, a busca de novas fontes de ASNase e novas variantes das enzimas já utilizadas como medicamento é foco de inúmeras pesquisas em todo o mundo. Além dos problemas apresentados, crises de abastecimento com estes medicamentos têm sido frequentes em vários países do mundo, como é o caso do Brasil. O cenário apresentado demonstra claramente a necessidade de desenvolvimento de ASNases mais eficientes e que atendam mercados que sofrem com abastecimento. Neste projeto PIPE Fase 2 estamos propondo o desenvolvimento do processo produtivo da ASNase de Escherichia coli engenheirada (EcAMUT) conjugada com polietileno glicol (PEG), dando continuidade aos resultados obtidos no PIPE Fase 1. A proposta aqui apresentada terá cinco objetivos complementares: 1) Desenvolvimento de uma linhagem de E. coli para expressão heteróloga de EcAMUT visando a produção industrial da enzima (IP-free); 2) Determinação das condições de cultivo em escala de bancada e em biorreator por sistema descontínuo-alimentado para crescimento celular em alta densidade (>50 g massa seca/ L); 3) Estudos de clarificação e purificação da enzima antes e após a conjugação com PEG; 4) Realização de ensaios de citotoxicidade em linhagens de células leucêmicas e em modelo animal; 5) Análise técnico-econômica do processo de produção. Portanto, esse projeto pretende ao seu final apresentar um processo viável para a produção de PEG-EcAMUT, proporcionando condições para o escalonamento e realização de estudos pré-clínicos. Desta forma, o projeto resultará em uma ASNAse biossuperior para suprir a demanda nacional e representará uma inovação global, pois PEG-EcAMUT possui características diferentes e melhoradas em relação aos seus concorrentes. Adicionalmente, acreditamos que o desenvolvimento do processo de produção de PEG-EcAMUT será de grande importância para o desenvolvimento de processos de produção de biofármacos no Brasil, sobretudo porque é um medicamento biotecnológico injetável..

Buscar processo utilizando agentes que proporcionem aumento de atividade de enzimas.

Asparaginase (ASNase) é utilizada no tratamento de cânceres do sistema linfático, em especial Leucemia Linfoide Aguda (LLA). A administração de ASNase pode provocar diversos efeitos adversos aos pacientes, incluindo efeitos tóxicos e respostas imunológicas que podem levar a choques anafiláticos. Nestes casos é possível continuar o tratamento com outras formulações de ASNase, porém ainda ocorrem repostas adversas em muitos pacientes e a maioria dos países não disponibiliza todas as formulações para tratamentos pelo alto custo e falta de registro nas agências regulatórias. Portanto, a busca de novas fontes de ASNase e novas variantes das enzimas já utilizadas como medicamento é foco de inúmeras pesquisas em todo o mundo. Além dos problemas apresentados, crises de abastecimento com estes medicamentos têm sido frequentes em vários países do mundo, como é o caso do Brasil. O cenário apresentado demonstra claramente a necessidade de desenvolvimento de ASNases mais eficientes e que atendam mercados que sofrem com abastecimento. Neste projeto PIPE Fase 2 estamos propondo o desenvolvimento do processo produtivo da ASNase de Escherichia coli engenheirada (EcAMUT) conjugada com polietileno glicol (PEG), dando continuidade aos resultados obtidos no PIPE Fase 1. A proposta aqui apresentada terá cinco objetivos complementares: 1) Desenvolvimento de uma linhagem de E. coli para expressão heteróloga de EcAMUT visando a produção industrial da enzima (IP-free); 2) Determinação das condições de cultivo em escala de bancada e em biorreator por sistema descontínuo-alimentado para crescimento celular em alta densidade (>50 g massa seca/ L); 3) Estudos de clarificação e purificação da enzima antes e após a conjugação com PEG; 4) Realização de ensaios de citotoxicidade em linhagens de células leucêmicas e em modelo animal; 5) Análise técnico-econômica do processo de produção. Portanto, esse projeto pretende ao seu final apresentar um processo viável para a produção de PEG-EcAMUT, proporcionando condições para o escalonamento e realização de estudos pré-clínicos. Desta forma, o projeto resultará em uma ASNAse biossuperior para suprir a demanda nacional e representará uma inovação global, pois PEG-EcAMUT possui características diferentes e melhoradas em relação aos seus concorrentes. Adicionalmente, acreditamos que o desenvolvimento do processo de produção de PEG-EcAMUT será de grande importância para o desenvolvimento de processos de produção de biofármacos no Brasil, sobretudo porque é um medicamento biotecnológico injetável.

A L-asparaginase (ASNase) é um importante biofármaco utilizado no tratamento de neoplasias do sistema linfático, principalmente a leucemia linfoide aguda. No Brasil este medicamento, obtido por processo biotecnológico, é fornecido pelo SUS. Entretanto o País ainda não possui a tecnologia de produção, sendo totalmente dependente da oferta de empresas internacionais. A crise de desabastecimento da ASNase é discutida desde 2011, mas se agravou recentemente em função de questionamentos sobre o processo de compra e a qualidade da ASNase fornecida. Atualmente sua aquisição é tema de debate entre a sociedade, médicos, acadêmicos e governo, evidenciando a urgência da autonomia do Brasil na produção da ASNase para aplicação farmacêutica. O presente projeto busca o desenvolvimento de um processo nacional e industrialmente viável para produção biotecnológica da ASNase. Para tanto, será utilizada a bactéria E. coli BL21(DE3) capaz de superexpressar uma ASNase resistente a proteases plasmáticas. Serão estudados a os parâmetros nutricionais e operacionais para otimização do processo fermentativo em biorreatores em condições de serem utilizadas para produção em escala ampliada, por meio do cultivo em alta densidade celular, por processo descontinuo-alimentado, e a melhor estratégia de purificação afim de se obter alta produtividade de ASNase. Também serão estudadas as alterações a nível de membrana e pH intracelular durante o processo de produção, com objetivo de compreender mais profundamente os mecanismos de exportação da enzima e a influência das condições de cultivo na fisiologia celular de forma a facilitar e aumentar o rendimento das operações unitárias de purificação. Como suporte ao desenvolvimento do processo, serão realizadas análises proteômica e transcriptômica das células, a fim de monitorar alterações no genótipo e fenótipo celular como resposta às condições de estresse, sobretudo por causa das elevadas concentrações celulares, durante o cultivo em sistema descontínuo-alimentado. Outro parâmetro importante a ser estudado será a viabilidade técnico-econômica do processo a partir dos resultados experimentais de otimização do cultivo e purificação da enzima, cujo objetivo será auxiliar na busca da estratégia de produção do biofármaco com menor custo. Com este projeto espera-se obter resultados fundamentais para o estabelecimento de processo biotecnológico com geração de um biofármaco inovador (L-asparaginase de E. coli recombinante resistente a proteases plasmáticas, com maior meia vida sanguínea), com potencial para exportação (uma vez que apresenta características farmacocinéticas e farmacodinâmicas potencialmente superiores aos biofármacos encontrados no mercado), a ser transferido para produção em condições de desenvolvimento em BPL (Boas Práticas de Laboratório) e de BPF (Boas Práticas de Fabricação), que contribuirão fortemente para o desenvolvimento científico e tecnológico do País. O projeto contribuirá para a implementação de tecnologia nacional inovadora na produção de biofármaco antileucêmico, com potencial para ser transferido ao setor produtivo visando aos mercados nacional e internacional, e geração de importantes conhecimentos científicos e tecnológicos de forma a reduzir a dependência tecnológica do Brasil nesta área do conhecimento, com formação de recursos humanos de alto nível nas diferentes áreas da biotecnologia (do upstream ao downstream). Vale ressaltar que a produção de um biofármaco de grau farmacêutico e injetável pelo Brasil irá abrir caminhos para viabilizar o desenvolvimento e produção de novas biomoléculas de alto valor agregado pelo Brasil.

Biofármacos são medicamentos de origem biológica amplamente utilizados no tratamento de câncer, diabetes, doenças cardiovasculares, entre outras. No Brasil, existe grande carência na produção de biofármacos. De acordo com o Índex da Associação Brasileira da Indústria Farmoquímica e de Insumos Farmacêuticos de 2016, cerca de 4% dos medicamentos adquiridos pelo ministério da saúde são biofármacos; porém, representam aproximadamente 51% dos gastos, provocando um déficit de 2 bilhões de reais na balança comercial do setor farmacêutico nacional. Dentre os biofármacos, grande destaque é dado à enzima Asparaginase (ASNase), amplamente utilizada no tratamento de cânceres do sistema linfático, em especial Leucemia Linfoide Aguda (LLA) desde a década de 70. Existem atualmente no mercado mundial três diferentes formulações de ASNase, produzida por Escherichia coli na forma nativa (EcA nativa) e conjugada com polietileno glicol (PEG-EcA) e produzida por Erwinia chrysanthemi (ErA). A administração de ASNase pode promover uma série de efeitos colaterais, incluindo respostas imunológicas e reações alérgicas que podem levar a choques anafiláticos. Dentre esses feitos, a produção de anticorpos anti-ASNase é diretamente associada ao decaimento da atividade antitumoral das ASNases, além disso, a atividade de proteases e peptidases pode levar a exposição adicional de epítopos, o que aumenta ainda mais a resposta imune. Nestes casos a intercambiabilidade de EcA por EcA peguilada ou ErA representa uma alternativa para esses casos, mas ainda ocorrem repostas adversas em muitos pacientes. Portanto a buscas de novas fontes de ASNase e novas variantes das enzimas já utilizadas como medicamentos é foco de inúmeras pesquisas em todo o mundo. Neste projeto PIPE fase 1 estamos propondo a peguilação da enzima EcAP40S/S206C, a qual possui resistência a degradação proteolítica, e foi obtida no âmbito do projeto Temático da FAPESP "Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico". Nossa prova de conceito será baseada no desenvolvimento de um processo eficiente de peguilação de EcAP40S/S206C. Para tanto serão realizados experimentos de peguilação de tióis e da região N-terminal, sendo selecionada assim a melhor estratégia de conjugação com PEG. Em seguida serão realizados ensaios cinéticos e de citotoxicidade para determinar o potencial de aplicação de PEG-EcAP40S/S206C em terapias. Acreditamos que a obtenção da enzima EcAP40S/S206C conjugada com PEG possui grande potencial para utilização como biofármaco, pois a resistência à proteólise somada a peguilação devem promover o aumento de sua meia vida da enzima na corrente sanguínea e diminuir a imunogenicidade.

Biofármacos são medicamentos de origem biológica amplamente utilizados no tratamento de câncer, diabetes, doenças cardiovasculares, entre outras. No Brasil, existe grande carência na produção de biofármacos. De acordo com o Índex da Associação Brasileira da Indústria Farmoquímica e de Insumos Farmacêuticos de 2016, cerca de 4 dos medicamentos adquiridos pelo ministério da saúde são biofármacos; porém, representam aproximadamente 51 dos gastos, provocando um déficit de 2 bilhões de reais na balança comercial do setor farmacêutico nacional. Dentre os biofármacos, grande destaque é dado à enzima Asparaginase (ASNase), amplamente utilizada no tratamento de cânceres do sistema linfático, em especial Leucemia Linfoide Aguda (LLA) desde a década de 70. Existem atualmente no mercado mundial três diferentes formulações de ASNase, produzida por Escherichia coli na forma nativa (EcA nativa) e conjugada com polietileno glicol (PEG-EcA) e produzida por Erwinia chrysanthemi (ErA). A administração de ASNase pode promover uma série de efeitos colaterais, incluindo respostas imunológicas e reações alérgicas que podem levar a choques anafiláticos. Dentre esses feitos, a produção de anticorpos anti-ASNase é diretamente associada ao decaimento da atividade antitumoral das ASNases, além disso, a atividade de proteases e peptidases pode levar a exposição adicional de epítopos, o que aumenta ainda mais a resposta imune. Nestes casos a intercambiabilidade de EcA por EcA peguilada ou ErA representa uma alternativa para esses casos, mas ainda ocorrem repostas adversas em muitos pacientes. Portanto a buscas de novas fontes de ASNase e novas variantes das enzimas já utilizadas como medicamentos é foco de inúmeras pesquisas em todo o mundo. Neste projeto PIPE fase 1 estamos propondo a peguilação da enzima EcAP40S/S206C, a qual possui resistência a degradação proteolítica, e foi obtida no âmbito do projeto Temático da FAPESP "Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico". Nossa prova de conceito será baseada no desenvolvimento de um processo eficiente de peguilação de EcAP40S/S206C. Para tanto serão realizados experimentos de peguilação de tióis e da região N-terminal, sendo selecionada assim a melhor estratégia de conjugação com PEG. Em seguida serão realizados ensaios cinéticos e de citotoxicidade para determinar o potencial de aplicação de PEG-EcAP40S/S206C em terapias. Acreditamos que a obtenção da enzima EcAP40S/S206C conjugada com PEG possui grande potencial para utilização como biofármaco, pois a resistência à proteólise somada a peguilação devem promover o aumento de sua meia vida da enzima na corrente sanguínea e diminuir a imunogenicidade.

- Definir metodologia confiável de determinação quantitativa de enzimas utilizadas em alimentos. Comparar as metodologias atualmente empregadas na empresa Prozyn com aquelas recomendadas pela IUPAC; Definir metodologia de análise de proteínas totais para auxiliar no cálculo de rendimentos e purezas das enzimas ao longo das avaliações das purificações utilizando metodologias reconhecidas atualmente; Definir metodologias de de qualidade para enzimas utilizadas em alimentos. Avaliar estabilidade de diferentes enzimas em função da temperatura e pH; Avaliar diferentes processos de separação de enzimas em função de suas características previamente determinadas, sobretudo de Tamanho e Estabilidade; avaliar processos de purificação utilizados industrialmente, como Ultrafiltração; Permeação em Gel; Cromatografia de Troca-Iônica; e Precipitação Fracionada. Avaliaremos as diferenças de solubilidade das enzimas.

Atualmente, existe uma alta demanda mundial na busca de alternativas para produção de
princípios ativos por processos biotecnológicos. Assim como na pesquisa,a produção
industrial de fármacosno Brasil apresenta fraca expressão no cenário mundial.Ainda,
fornecedores internacionais de biofármacos estão perdendo o interesse no mercado
brasileiroe descontinuando a produção de diversos desses, principalmente aqueles
relacionados ao tratamento de doenças onco-hematológicasO presente projeto visa a
produção nacional e em escala industrial de L-Asparaginase, um biofármaco amplamente
utilizado no tratamento de leucemias, por um processo biotecnológico associando as
competências científicas e tecnológicas estabelecidas por grupos de pesquisa brasileiros e
utilizando recursos genéticos e biológicos nacionais.Em triagens previamente realizadas
foram detectados o potencial da linhagem bacteriana Streptomyces caatingaensis
CMAA1322 na produção de L-Asparaginase in vitro, assim como estudos dos grupos
gênicos responsável por sua biossíntese. Nesse contexto, na fase inicial, as estratégias
serão orquestradas em três diferentes frentes, utilizando como scaffold a L-Asparaginase
de S. caatingaensis CMAA1322 Plataforma I (Avaliação do potencial de produção
extracelular em meio líquido, e otimização da produção em larga escala); Plataforma II
(Ensaios de pré-purificação enzimática dos extratos e frações); Plataforma III
(Monitoramento da atividade anticancerígena das enzimas obtidos nas plataformas I e II).
Ao final deste período, objetiva-se confirmar a viabilidade da tecnologia desenvolvida
utilizando a linhagem microbiana na produção da L-Asparaginase, primeiro biofármaco
nacional nesta categoria.Ressaltando que essa medida visa suprir a carência do mercado
nacional para este principio ativo. Pretende-se criar condições de desenvolvimento de
processos e de produção de asparaginases com qualidadeem escala piloto utilizando
métodos simples, baratos e seguros. Espera-se obter resultados promissores do ponto de
vista transferência de tecnologia para indústria e que estejam em consonância ao
atendimento a demanda nacional desse biofármaco para tratamento do câncer

Projetos de pesquisa
2017 - Atual Produção de L-asparaginase por fermentação em estado sólido em diferentes escalas de reatores
Descrição: O uso de biotecnologia na produção de princípios ativos farmacêuticos representa uma indústria estratégica que merece especial destaque em diversos senários como no caso de pesquisas destinadas a produção de L-Asparaginase (ASNase) utilizada no tratamento onco-hematológico e que vem sendo motivo de preocupação pela perda de interesse do mercado internacional na continuidade de fornecimento deste biofármaco que tem importância vital no tratamento de Leucemia Linfóide/Linfoblástica Aguda (LLA) infantil. Uma das possibilidades de redução de custos ASNase representa o uso de fermentação em estado solido (FES) que o que representa uma forma inovadora tratar o problema, pois poucos trabalhos fazem o uso de FES associado a biofármacos e não foi observado literatura do uso especifico de FES associado a produção de ASNase com ênfase a produção econômica de ASNase. O presente projeto visa produzir ASNase de leveduras e fungosor FES utilizando resíduos agroindustriais sólidos e suportes inertes.
Situação: Em andamento Natureza: Projetos de pesquisa
Alunos envolvidos: Mestrado acadêmico (1); Doutorado (1);
Integrantes: Ubirajara Coutinho Filho (Responsável); ; Tais Magalhães Abrantes Pinheiro; Edgar Silveira Campos; Vicelma Luiz Cardoso; Adalberto Pessoa Junior; William Fernando Vieira; Tales Alexandre Costa e Silva
Financiador(es): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais-FAPEMIG

L-asparaginasa (EC 3.5.1.1) es utilizada en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda y enfermedades malignas del sistema linfoide y obtenida de bacterias de origen clínico y ambiental como las especies del género Bacillus, las cuales son muy versátiles y ubicuas. Por ello, el objetivo de la investigación es producir, purificar y caracterizar Lasparaginasa
extracelular de una cepa de Bacillus sp halotolerante. En este contexto, primero se seleccionará una cepa de Bacillus sp. productora de L-asparaginasa a partir de un cepario de bacilos Gram positivos aislados de ambientes salinos peruanos. En seguida, los parámetros óptimos de producción de la enzima serán determinados evaluando independientemente cada factor y por la interacción de factores utilizando la metodología de superficie de respuesta, entre estos se incluyen temperatura, pH, agitación, fuentes de nitrógeno, carbono y tiempo de cultivo. Después, la L-asparaginasa se concentrará por precipitación salina y se purificará mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños y ultrafiltración. Por último, la enzima se caracterizará por técnicas bioquímicas para determinar las condiciones óptimas de reacción y estabilidad, constantes cinéticas, termoestabilidad, citotoxicidad, entre otros. Se espera encontrar una L-asparaginasa extracelular sin actividad glutaminasa, con gran afinidad por L-asparagina que actué a pH 7,0; 37 °C, resistente a proteasas humanas. En Perú, la leucemia se presenta en aproximadamente el 30 % de casos reportados (1) siendo más frecuente la leucemia linfoblástica aguda en niños, para su tratamiento se usa L-asparaginasa (ASNasa) de Escherichia coli o Erwinia chrysanthemi, la cual a pesar de alcanzar respuesta en el 90 % de pacientes (2) presenta alta incidencia de efectos adversos tales como respuesta inmune por la producción de anticuerpos anti-ASNasa que conlleva a resistencia al medicamento (3-6). Asimismo, la actividad glutaminasa de la ASNasa causa neurotoxicidad e hiperamonemia en 25% de pacientes (3,4). En Perú, no existen investigaciones de nuevas fuentes alternativas de Lasparaginasa que disminuyan las reacciones adversas, mejoren su actividad enzimática y faciliten su producción y
purificación; a pesar de ser un país megadiverso con nichos ecológicos como los ambientes salinos con gran diversidad bacteriana que es desaprovechada por falta de conocimiento, inversión y visión de los recursos naturales.

Projeto Multiusuário aprovado pela FAPESP para uso compartilhado.

Proteases representam um dos três maiores grupos de enzimas industriais e são responsáveis por
cerca de 60% das vendas mundiais de enzimas. Apesar das enzimas proteolíticas poderem ser obtidas
a partir de animais e plantas, os micro-organismos são a fonte preferida para aplicações industriais em
Página 1 de 4vista das vantagens econômicas e científicas. Entre os vários grupos de micro-organismos, os
psicrófilos são os candidatos ideais para a produção de proteínas tendo em mente que suas enzimas
são ativas a uma temperatura baixa e estáveis sob diferentes condições como em meios alcalinos e na
presença de oxidantes e detergentes. Na atualidade, essas enzimas têm grandes demandas como
aditivo de detergentes, e também são úteis na biorremediação ambiental, biologia molecular e
engenheira dos alimentos. Por outro lado, o isolamento de produtos biológicos em grande escala
necessita de técnicas eficientes que possam preservar as propriedades dos bioprodutos, a um custo
relativamente baixo. O sistema de duas fases aquosas (SDFA) superou essas demandas e emergiu
como um método poderoso para o processo de purificação de bioprodutos. Para os produtos que
requerem elevado grau de pureza, a extração em SDFA não é suficiente e, nestes casos, será seguido
por um ou mais passos de cromatografia. Este projeto visa à purificação da protease secretada pela
levedura psicrotrófica Rhodoturola mucilagionosa por sistemas de duas fases aquosas PEG/NaPA e
processos cromatográficos, para obter proteases mais robustas de importância industrial e biotecnológica. Proteases representam um dos três maiores grupos de enzimas industriais e são responsáveis por
cerca de 60% das vendas mundiais de enzimas. Apesar das enzimas proteolíticas poderem ser obtidas
a partir de animais e plantas, os micro-organismos são a fonte preferida para aplicações industriais em
Página 1 de 4vista das vantagens econômicas e científicas. Entre os vários grupos de micro-organismos, os
psicrófilos são os candidatos ideais para a produção de proteínas tendo em mente que suas enzimas
são ativas a uma temperatura baixa e estáveis sob diferentes condições como em meios alcalinos e na
presença de oxidantes e detergentes. Na atualidade, essas enzimas têm grandes demandas como
aditivo de detergentes, e também são úteis na biorremediação ambiental, biologia molecular e
engenheira dos alimentos. Por outro lado, o isolamento de produtos biológicos em grande escala
necessita de técnicas eficientes que possam preservar as propriedades dos bioprodutos, a um custo
relativamente baixo. O sistema de duas fases aquosas (SDFA) superou essas demandas e emergiu
como um método poderoso para o processo de purificação de bioprodutos. Para os produtos que
requerem elevado grau de pureza, a extração em SDFA não é suficiente e, nestes casos, será seguido
por um ou mais passos de cromatografia. Este projeto visa à purificação da protease secretada pela
levedura psicrotrófica Rhodoturola mucilagionosa por sistemas de duas fases aquosas PEG/NaPA e
processos cromatográficos, para obter proteases mais robustas de importância industrial e

O presente projeto possui 2 (dois) principais objetivos, sendo que o primeiro pretende-se melhorar a qualidade dos vinhos elaborados, empregando enzimas endógenas que possam facilitar certas etapas da vinificação, além de revelar compostos aromáticos ou permitir uma maior extração de matéria colorante, no caso dos vinhos tintos. Enquanto o segundo, diz respeito à minimização do impacto ambiental e volume de resíduos gerados pelas indústrias vitivinícolas, utilizando tais resíduos para obtenção de tais enzimas que podem ser empregadas no próprio setor vitivinícolas durante a elaboração do vinho.