Anselmo Sigari Moriscot.

Nesse projeto investigaremos a possivel interacao entre niveis aumentados do miR29c e exercicio resistido no musculo esqueletico de camundongos. Serao feitas medidas morfometricas, moleculares e funcionais.

A atrofia muscular é considerada atualmente como um fator importante para a morbidade e mortalidade de pacientes. Dessa forma, o desenvolvimento de estratégias que melhorem a capacidade muscular e sejam capazes de reduzir sintomas da atrofia, é um dos maiores desafios na área de pesquisa com músculos esqueléticos. Nesse sentido, o nosso laboratório tem investigados os efeitos anti-catabólicos da leucina envolvidos no controle da massa muscular esquelética. A leucina, classificada como uma aminoácido de cadeia ramificada é como um potente agente farmacológico com capacidade de atuar prevenindo o catabolismo em situações de atrofia muscular. Estudos recentes de nosso grupo de pesquisa demonstraram que ratos suplementados diariamente com leucina, apresentaram redução da perda de massa do músculo soleus e também redução da perda da área de secção transversa após 7 dias de imobilização. Esse efeito anti-atrófico da leucina foi atribuído a redução da expressão gênica de componentes chaves do sistema proteolítico Ubiquitina-proteassoma, atrogin-1 e MuRF1. Por outro lado, é possível que outros fatores e vias de sinalização estejam envolvidos no efeito anti-atrófico de leucina. Portanto, o objetivo desse projeto é realizar um estudo prospectivo, utilizando simultaneamente a recente técnica de sequenciamento de mRNA em larga escala. Além disso, apesar de recente, o sequenciamento em larga escala está bem estabelecido como uma ferramenta útil para a identificação de genes, vias e mecanismos responsivos, principalmente porque pode ultrapassar as pistas normalmente advindas do conhecimento adquirido em biologia celular e molecular

A via proteolítica proteassomal é reconhecidamente importante por participar do processo de atrofia muscular atuando em diversos estados de catabolismo muscular, como imobilização e denervação. No entanto, o papel desta via em outros aspectos da plasticidade muscular como a regeneração ainda é pouco conhecido. Dados não publicados de outro projeto em andamento do nosso grupo, mostram que camundongos duplo Knock out para MuRF1 e MuRF2 possuem capacidade regenerativa muscular esquelética extremamente deficiente, com comprometimento de células miogênicas, indicando que MuRFs podem ter um importante papel em proliferação e diferenciação celular. Além disso, nesse outro projeto observamos que músculos em regeneração de camundongos duplo knock out para MuRF1 e MuRF2 possuem figuras histológicas que se parecem com adipócitos brancos, levantando a possibilidade de MuRFs desempenharem um papel importante na diferenciação miogênica. O objetivo principal do presente estudo é compreender o papel de MuRF1 e MuRF2 no perfil de diferenciação das células musculares com potencial miogênico. Também pretendemos avaliar se MuRFs são importantes para manutenção do fenótipo de células musculares. (AU)

The SARCOSI network will investigate how titin- and nebulin-based molecular signaling pathways are in
charge of myocyte health and integrity by sensing the state of the sarcomere. Our studies will include
the analysis of conformational changes titin signalling complexes at atomic resolution (teams#5 and #8).
How stretch signals are transmitted inside cells will be studied by cell biology focused teams
(teams#3,#4,#11 (partner 2), and how signals feed into the regulation of muscle trophicity will be
determined by the teams#1,#7,#11,#12,#13,#14. Sarcomeric signalling in chronic heart failure and
chronic muscle wasting will be addressed by teams#2, 3, 6 together with our teams in the US and in
Brazil (teams#10, #11, #12).
The mechanisms acting in genetic titin- and nebulin based muscle diseases will be investigated. The
SARCOSI network will bring together teams that are leading in basic research titin and nebulin research
(teams#1, #5, #7, #8,#11,#11 (partner 2)) with the leading groups in human genetics of NM and ARVC
(that have already established patients registries, see teams#2, #6, and team#10).
The specific aim of this research on human genetic titin and nebulin-based diseases will be to enhance
our understanding of the pathomechanisms involved. While the Mestroni and Labeit teams have
previously identified mutations in titin and nebulin, the consequences for the myofibril are largely
unclear. Characterization of human muscle tissues in teams#6 and 10 will clarify the consequences that
defects in titin and nebulin have for cardiac and skeletal myocytes (for example how defects in titin and
nebulin can cause muscle weakness).
The impact we seek for human health will be to enhance progress in diagnostics, and to pave the way
to develop novel therapeutic strategies (for more practical details on the human genetic analysis, and
the characterization of human biopsies, and ethical considerations, see section B5).
Finally, the role of titin and nebu

É bem estabelecido na área de remodelamento do músculo esquelético que certas E3
ligases (notadamente Atrogin-1 e MuRF-1) são mediadores importantes da resposta
atrófica. No entanto o papel destas enzimas em outros aspectos como regeneração não foram ainda publicados na literatura especializada. Ocorre que desenvolvemos um projeto em andamento (FAPESP 2012/07018-0) aonde temos dados sólidos mostrando que MuRF- 1 e MuRF-2 são necessários para o processo regenerativo muscular. Camundongos com deleção destes MuRFs possuem regeneração muscular extremamente deficiente, com surgimento do que aparentam ser células adiposas no lugar de fibras musculares regeneradas (fibras musculares regeneradas implicam em prévia miogênese). Essa observação levanta a possibilidade de que MuRFs sejam importantes controladores do processo de miogênese, essa é a principal base para esta solicitação de bolsa de doutorado.
Para compreender o papel de MuRFs no processo de miogênese utilizaremos anticorpos para proteínas marcadoras de adipócitos em camundongos com deleção dos MuRFs. Em resumo faremos na sequencia uma abordagem in vitro aonde avaliaremos a capacidade de diferenciação de células com potencial miogênico, isoladas de camundongos com deleção de MuRFs. Também identificaremos, através de anticorpos específicos, a presença de outros tipos celulares tais como fibroblastos, adipócitos e células ósseas no modelo de cultura celular acima mencionado.

Nos últimos 50 anos os medicamentos a base de glicocorticóides (sintetizados a partir do cortisol) tem sido a droga com efeito antiinflamatório e imunossupressor mais prescrito para o controle de situações inflamatórias. Artrite, asma, doenças vasculares, alergias, doenças de pele, transplantes, entre outras, são doenças tratadas com estes medicamentos. A eficiência da droga é indiscutível, contudo o seu uso crônico leva ao aparecimento de uma série de efeitos colaterais, alguns simples, como a manifestação de acnes, contudo outros mais severos, que afetam de forma significativa a qualidade de vida do indivíduo, acarretando em menor expectativa de vida. Isto ocorre porque o complexo hormônio-receptor, além de estimular substâncias que combatem a inflamação, ativa também uma cadeia de genes causadores dos efeitos colaterais. Por isso, diversos pesquisadores vêm desenvolvendo compostos (análogos dos glicocorticóides), na tentativa de encontrar agentes terapêuticos que mantenham o efeito antiinflamatório e possuam menos efeitos colaterais. Muitos destes compostos já foram desenvolvidos e analisados tanto in vitro, quanto in vivo, mostrando interação com o receptor, contudo ainda apresentando efeitos colaterais em certos tecidos como cartilagem e osso. O músculo esquelético sofre uma clara atrofia com o uso de glicocorticóides e entra na lista de tecidos que ainda não foram avaliados por estes novos compostos. A atrofia muscular esquelética induzida por glicocorticóides apresenta uma forte implicação clínica, visto que é causadora de significativa queda na qualidade de vida do indivíduo. Sendo assim, este projeto visa avaliar o efeito de dois compostos (L5 e L7), análogos do glicocorticóide e derivados do arylpyrazole, sobre a atrofia da musculatura esquelética, comparando-os com o medicamento dexametasona. (AU)

O hormônio tiroideano (T3) atua em diversos aspectos da manutenção da homeostase, incluindo efeitos sobre a diferenciação e metabolismo. Todos os tecidos musculares possuem receptores para o T3 em diferentes proporções e existem dados sólidos na literatura a respeito do impacto biológico deste hormônio nos tecidos musculares. No músculo cardíaco o T3 exerce profunda influência sobre o trofismo e contratilidade cardíaca. Apesar de se conhecerem relativamente bem os efeitos estruturais/funcionais do T3 sobre os tecidos musculares, as possíveis vias intracelulares moduladas pelo referido hormônio ainda são pouco conhecidas. Dentre as vias intracelulares envolvidas no processo de hipertrofia cardíaca induzida pelo T3, a via da Wnt é uma boa candidata, pois está fortemente envolvida no processo de hipertrofia cardíaca em certos modelos experimentais. Esta via tem como principal mediador a ß-catenina, uma proteína multifuncional capaz de exercer um importante papel estrutural no tecido cardíaco, bem como atuando como fator de transcrição, modulando a expressão de diversos genes envolvidos no processo de hipertrofia cardíaca. Dessa maneira, este projeto se propõe a contribuir para o avanço do conhecimento acerca dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na modulação dos níveis de ß-catenina pelo T3 no tecido cardíaco através do estudo sistemático desta via de sinalização no modelo de hipertiroidismo experimental in vivo e in vitro. Ainda, utilizaremos a técnica de RNA de interferência, para verificar se os efeitos celulares provocados pelo T3 são minimizados pela inibição/ bloqueio da via Wnt. (AU)

O músculo esquelético possui notável capacidade de se adaptar a situações de aumento de tensão ativa e passiva. Em ambas as situações o músculo sofre hipertrofia (levando ao aumento do número de sarcômeros), entretanto há situações de aumento de tensão muscular como a distração gradual osteogênica (DGO) e recuperação muscular após longos períodos de imobilização em que ocorrem efeitos deletérios como atrofia e fraqueza muscular e perda de amplitude de movimento. Considerando-se o destacável papel das células tronco como recurso terapêutico, o objetivo deste projeto é investigar o efeito da aplicação in situ de células tronco mesenquimais em músculos esqueléticos de ratos submetidos à DOO e recuperação após imobilização. Serão determinados: peso corporal; peso (úmido e seco) e comprimento muscular; número e comprimento de sarcômeros em série nas fibras musculares; percentual e área dos diferentes tipos (I, II e intermediárias) de fibras musculares; estrutura histológica muscular; perfil de expressão gênica e protéica de alguns elementos das vias AKT/mTOR e calcineurina; análise do tecido conjuntivo; imunodetecção de MHCn (marcador de regeneração); identificação e localização dos núcleos das células tronco mesenquimais. (AU)

Os tecidos musculares são especializados na geração de tensão ativa, propriedade esta que garante a eles participação em vários processos fisiológicos, tais como: 1) posicionamento e deslocamento do esqueleto; 2) propulsão do sangue pelo sistema circulatório, garantindo assim a perfusão tecidual; 3) retorno venoso; 4) controle da resistência vascular periférica; 5) movimento visceral e 6) movimentação do globo ocular, entre outros. Os tecidos musculares são altamente plásticos, sendo capazes de responder rapidamente a mudanças na demanda funcional, por exemplo, lesões e estímulos hormonais. O funcionamento inadequado dos tecidos musculares também evidencia sua importância no controle da homeostase, como se observa nos exemplos que se seguem: 1) a maior causa de morte nas populações de Países desenvolvidos e em desenvolvimento é a insuficiência cardíaca, e esta, na maioria das vezes, está diretamente associada ao desenvolvimento de patologias vasculares, entre as quais merecem destaque aquelas que envolvem a musculatura lisa e o endotélio dos vasos; 2) a perda de massa muscular esquelética que ocorre no envelhecimento é um componente importante da síndrome de fragilidade senil, onde se nota menor capacidade de manter as funções vitais e a menor resposta imunológica, levando à mortalidade precoce; 3) a perda acentuada da massa muscular esquelética (culminando em caquexia) no curso da insuficiência cardíaca pode acelerar a progressão da síndrome, por se instalar um quadro catabólico generalizado acompanhado de astenia, saciedade prematura e anorexia. Além disso, a caquexia em portadores de IC é considerada um preditor independente de mortalidade. Sendo assim, a melhor compreensão da Biologia celular e molecular dos tecidos musculares (especialmente os processos voltados para adaptação da massa muscular à demanda funcional) é de suma importância para que novas estratégias terapêuticas possam ser definidas, visando a manutenção da função muscular, com conseqüente melhoria da qualidade de vida. Dessa maneira, este projeto se propõe a contribuir para o avanço do conhecimento acerca de mecanismos celulares e moleculares envolvidos com a plasticidade muscular. No subprojeto 1 serão avaliados efeitos celulares e moleculares deflagrados em conseqüência de determinados estímulos mecânicos, tendo como foco principal o melhor entendimento do papel da via Akt/mTOR no trofismo muscular esquelético. No segundo subprojeto, a proposta é investigar como a massa muscular aumentada, independentemente da demanda mecânica, pode interferir com o controle do balanço energético. Isto será feito utilizando camundongos transgênicos para IGF-1, o qual, neste modelo animal é hiperexpresso especificamente no músculo esquelético. Nos subprojetos subseqüentes, avançaremos nossos conhecimentos a respeito dos efeitos celulares e moleculares de hormônios extremamente importantes para a homeostase dos tecidos musculares: o hormônio tireoidiano (T3) e as catecolaminas. Neste sentido, o aumento de catecolaminas está envolvido com o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, a qual, por sua vez, deflagra alterações marcantes nos tecidos musculares. Em alguns destes subprojetos, será feita uma análise não apenas da ação do T3 propriamente dito, mas também será avaliada a interação endócrina uma vez que esta interação parece deflagrar processos celulares diretamente envolvidos no trofismo desses músculos (subprojetos 3 e 4). Ainda em relação ao T3, em outro subprojeto será avaliado o efeito proteolítico do T3 no músculo esquelético (subprojeto 5). Nos subprojetos 6 e 7, será analisado o estado de ativação das vias hipertróficas Akt/mTOR e calcineurina nos músculos esquelético e cardíaco em um modelo genético de insuficiência cardíaca induzida por elevação de catecolaminas circulantes. Por fim, no subprojeto 8 será analisado o efeito de GC 24 (um agonista seletivo do T3 q

Os efeitos estruturais e funcionais do T3 são bem conhecidos e tem sido amplamente caracterizados em vários sítios do organismo. Sabe-se que a grande maioria destes efeitos deve ser desencadeada por meio da modulação da expressão gênica e vias intracelulares. No entanto os genes caracterizados como alvos do T3 ainda são relativamente escassos, considerando a grande variedade de efeitos biológicos que o T3 exerce. Essa tônica também se aplica para os tecidos musculares, aonde a maioria dos genes alvo para o T3 bem caracterizados foram identificados por meio de pistas fisiológicas. Sendo assim, a utilização de microarray e detecção de vias intracelulares ampliará muito nosso conhecimento a respeito de genes e eventos bioquímicos responsivos ao T3 nos tecidos musculares. (AU)

Nesse projeto investigaremos o papel das HSPs no desenvolvimento de atrofia e recuperação do músculo esquelético e o possível papel do radicicol como agente terapêutico na minimização da perda de massa muscular, abordando aspectos imunohistoquímicos e moleculares da atrofia e recuperação de músculos esqueléticos de camundongos tratados com adicicol, submetidos à imobilização (7 dias) e recuperados durantes diferentes períodos após imobilização (5, 10 e 14 dias). Nossos objetivos específicos serão: 1) estudar o papel das HSPs na regulação do número de células satélites durante a atrofia e recuperação de músculos esqueléticos e 2) estudar o papel das HSPs na modulação da expressão de genes guiadores do trofismo muscular (atrogina-1, MURF-1 e miostatina) durante a atrofia e recuperação de músculos esqueléticos. Serão realizados western blot para HSP70i e medidas de peso muscular úmido e seco e área de secção transversal das fibras musculares. Além disto determinaremos a expressão pênica de atrogina-1, MURF-1 e miostatina. (AU)

A ciclosporina (CsA) é uma droga imunossupressora amplamente utilizada em pacientes transplantados e portadores de doenças reumáticas. Além disto, essa droga tem sido utilizada como ferramenta farmacológica para promover inibição de uma via intracelular dependente de Ca++/calmodulina envolvida na regulação do trofismo/fenótipo muscular (via da calcineurina). Estudos anteriores têm demonstrado que CsA também exerce ação protetora no sistema nervoso submetido à isquemia, através do bloqueio da produção de óxido nítrico (NO; Snyder et al., 1998). Visto que no músculo esquelético existe produção de NO e a via da calcineurina (CnA) está presente, nós formulamos a hipótese de que a CsA também poderia ser capaz de atenuar lesões musculares esqueléticas. Portanto, o objetivo deste estudo será analisar o efeito da CsA em músculos esqueléticos submetidos à lesão química por crotoxina, uma miotoxina extraída do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus. (AU)

O estado tráfico do músculo é modulado por diversos fatores, destacando-se o seu grau de atividade. Modelos experimentais descritos na literatura como a imobilização, exposição à ambientes de micro-gravidade e suspensão são vastamente associados a alterações na plasticidade do músculo esquelético. Evidências obtidas através de experimentos in vitro, (MUSARO et al, 1999; SEMSARIAN et al., 1999) descreveram o envolvimento da Calcineurina na via hipertrófica do músculo esquelético. Atualmente, a literatura apresenta resultados controversos sobre o papel da calcineurina sobre a regulação do processo de hipertrofia in vivo. Desta forma, o presente projeto visa verificar a influência da Calcineurina, tanto durante a imobilização de membros inferiores como no período de recuperação, sobre o trofismo da musculatura esquelética. O objetivo deste projeto é avaliar parâmetros macroscópicos, histológicos da perda e recuperação de massa muscular esquelética de ratos tratados com CsA e submetidos a um modelo de hipocinesia (imobilização). (AU)

O hormônio tireoidiano (T3) possui ações como diminuição dos níveis plasmáticos de colesterol e diminuição da massa gorda, tornando-o seu uso como agente terapêutico tentador. Entretanto, este mesmo hormônio possui efeitos indesejáveis tais como comprometimento da função cardíaca, diminuição da massa óssea e conversão de fibras musculares tipo I em tipo II. Desta forma, a caracterização de análogos que possam reproduzir somente os efeitos desejáveis do T3 podem ser de grande valia para o tratamento de dislipidemias e até obesidade. O GC-24 é um agonista com a maior afinidade pelo TRbeta que se conhece até o momento, além disto nenhum estudo ainda foi feito utilizando o referido análogo. Além do aspecto terapêutico, a caracterização da ação do GC-24 no músculo esquelético também contribui para o melhor entendimento do papel funcional dos TRs na fibra muscular esquelética. O presente projeto visa determinar aspectos moleculares e histológicos do músculo esquelético de animais submetidos ao tratamento com GC-24. (AU)

O coração é um importante órgão alvo do hormônio tireoidiano (T3). Vários estudos têm verificado que o T3 induz grandes alterações fisiológicas e moleculares no miocárdio. Apesar destes avanços, estudos sistemáticos sobre os efeitos ultra-estruturais que o T3 desencadeia no miocárdio ainda são escassos. Os dados até o momento se limitam a descrever um aumento do número e eletro densidade de mitocôndrias e desarranjos miofibrilares com tratamento crônico de T4 (ao roedor de 1 mês). Estas modificações, especialmente o desarranjo miofibrilar, são provavelmente eventos finais e ainda não está claro se outras modificações são detectáveis mais precocemente. Além disto, a evolução temporal das modificações ultra-estruturares induzidas pelo T4 ainda não são claras. Diante deste quadro, nosso objetivo é investigar alterações ultra-estruturares no miocárdio de ratos tratados com T4 por tempos crescentes: 24, 48, 72h e 1 semana nas doses de 25ug/100g pc e 100uq/100g pc. (AU)

O T3 (hormônio Tireoidiano) exerce múltiplas funções no metabolismo, diferenciação e crescimento do organismo. No coração, o T3 provoca modificações marcantes como hipertrofia cardíaca, aumento da força e velocidade de contração do miocárdio, além de um aumento da velocidade de relaxamento. Estes efeitos tem sido atribuídos, em parte, ao aumento da expressão dos genes codificadores das miosinas pesadas (MHC) e da Ca++ APTase de retículo sarcoplasmático (SERCA-2). No entanto, a caracterização destes genes, ainda não contempla a complexidade das ações do T3 neste órgão. O objetivo deste projeto é identificar novos genes diferencialmente expressos no miocárdio de ratos hipotiróideos tratados com T3. Esta abordagem será realizada por meio do método SSH (supressive subtractive hybridization). Animais hipotiróideos receberão T3 por 12 e 24 horas e serão sacrificados por decapitação. Após o emprego da técnica, os cDNA serão seqüenciados e utilizados como sondas para confirmação da responsividade ao T3 in vivo. (AU)

Neste projeto estudaremos a regulação dos gene da Serca-Z (Sarcoplasmic enndoplasmic Retilicum Ca+2 ATPoise) pelo hormônio tiroideano (T3), e a interação do T3 com fatores de transcrição. Além disto estudaremos como o T3 interage com sinais gerados na membrana celular, em particular o sistema L Adrenérgico, na regulação da expressão do referido gene. (AU)