Maria Dulcetti Vibranovski.

A citogenética desempenha um papel fundamental na exploração das complexidades das estruturas cromossômicas e das dinâmicas interações proteicas durante o ciclo celular. O emprego de técnicas de marcação cromossômica por fluorescência, como o FISH (Fluorescence in situ hybridization), é de suma importância nesse contexto. Contudo, a marcação integral de cromossomos que abrigam sequências altamente repetitivas, como os cromossomos Y e neo-sexuais, é um desafio notório. Isso se deve à carência de sondas altamente específicas e à propensão à hibridização não específica. Este projeto tem como objetivo central o desenvolvimento e validação de uma pipeline de bioinformática que será instrumental na criação de sondas oligopaint altamente específicas para as sequências repetitivas singulares encontradas em diferentes cromossomos. Essas sondas oligopaint serão estrategicamente combinadas com oligonucleotídeos de sequência única, possibilitando a marcação abrangente de cromossomos caracterizados por uma alta densidade de sequências repetitivas. Inicialmente, o enfoque se direcionará ao cromossomo Y da espécie Drosophila melanogaster, notável por sua abundância de sequências repetitivas. Posteriormente, a pesquisa se expandirá para os cromossomos neo-sexuais de Drosophila miranda, uma espécie que apresenta cromossomos sexuais de idades evolutivas distintas e, portanto, diferentes níveis de diferenciação de sequências. Este projeto não somente aprimorará a pesquisa genômica, mas também simplificará a realização de estudos citogenéticos em diversas espécies. Ele se baseará em um processo que abrange desde a identificação de sequências genéticas exclusivas até o design de sondas oligopaint personalizadas, incluindo a incorporação de sequências repetitivas e a aplicação criteriosa de filtros para garantir a especificidade das sondas. A eficácia da marcação de cromossomos com sequências repetitivas será confirmada in situ por meio de experimentos laboratoriais. Esse avanço na capacidade de marcar de maneira eficiente cromossomos com sequências repetitivas abrirá novas perspectivas de pesquisa e aprofundará nossa compreensão sobre a organização genômica e a evolução cromossômica, não apenas em Drosophila, mas também em outras espécies, potencialmente transformando a forma como conduzimos estudos citogenéticos e genômicos em nível molecular.

This application will augment our newly established Masters in Biological Data Science program at the School ofMathematical and Natural Sciences (SMNS), Arizona State University (ASU) West, with the implementation of agenomics research component and purposeful recruitment of candidates from under-represented communities. While inthe Training in Genomics Research (TiGeR) Track, students will gain expertise in the computational aspects of genomics,improve their marketability, and meet the demands for genomics-trained bioinformaticians. By recruiting from a diversepopulation of students from the populations surrounding ASU, we will create a diverse and competitive science workforcethat fosters deeper engagement between the biomedical and biosciences sector and the greater Phoenix community.Diversity in college education readies students for life, work, and leadership in a more global economy by fosteringthought leaders who are creative, collaborative, and able to navigate dynamic and multicultural environments skillfully.

Y chromosomes are directly involved with sex-determination and male fertility. Despite theirbiological importance they remain largely uncharacterised in most species because their very highPage 11 of 40content of repetitive DNA poses formidable obstacles to genetic, genomic and evolutionary studies.A significant effort and contribution of my group has been on the development of methods tofacilitate these studies (see Carvalho and Clark Genome Research 2013, and Carvalho, Dupim andGoldstein Genome Research 2016 for two recent examples), which resulted in the identification ofnearly all known Drosophila Y-linked genes (Carvalho and Clark Science 2005; Koerich et al.Nature 2008; Carvalho et al. TIG 2009). Here we propose to apply these methods to obtain Y-linkedmarkers for mosquito species which transmit malaria, dengue, leishmaniosis and other diseases, toimprove the assembly of the highly repetitives Aedes aegypti genome and human segmentalduplications, to investigate Y-chromosome evolution in Diptera, and to further improve theassembly methods of long reads (PacBio and Oxford Nanopore).

Chromosomes are major components of cells, packing the genetic material in a perfect organized structural and functional pattern. However, the chromosomes behavior during cell cycle is subjected to genomic rearrangements producing a wide variety of functional consequences with impact in cell disorders and also generating evolutionary novelties. Although several factors that mediate genomic rearrangements are now known, there are still many unanswered questions. In the light of high throughput era in generation of biological data, chromosome studies have also advanced to a higher level exploring high scale analyses of DNA, RNA, and proteins, and their interactive networks. Therefore, this grant application intend to explore chromosomal polymorphism (associated to B chromosomes and sex chromosomes) as models to investigate the structural and functional nature of chromosomal rearrangements during evolution. In this way, the objective of this project is to analyze chromosome rearrangements in the light of massive molecular data obtained from different biological models, in order to advance in the identification of origin and fate of chromosome changes and to comprehend their evolutionary and disease consequences. Additionally, the project also aims to perform the scientific divulgation of chromosome facts, in the light of an evolutionary and function perspective, in order to enforce a dialog between science and society.

Resumo em InglêsNew genes are frequently formed during evolution in a wide variety of organisms playing a key role in the emergence of novel traits. Recently, studies have shown that new genes can quickly assume critical roles in developmental pathways by producing essential structures. Despite their importance, new genes are still seriously under-characterized in functional studies and inconsistently annotated in large-scale genome projects. Hence, biased estimations of gene gain and loss prevent us to establish how mutational processes and selective forces contribute to the source of new genes. Therefore, determining relations between genotype and phenotype in the emergence of a new gene requires current researches to apply a biological developmental system approach and perspective. Gametogenesis is a system of great importance for survival and evolution of species that varies temporally with the development and has a profound impact on new genes. Spermatogenesis, the male gametogenesis, provides half of the raw genetic material for the next generation and is enriched with new genes expression. The main goal of this project is to study processes and evolutionary forces determinant for evolution and origin of new genes. To achieve this goal, I will: 1- investigate the role of mutation and selective processes in the Drosophila and mammal spermatogenesis impacting new gene evolution; 2: take advantage of gametogenesis gene expression to generate unbiased rates of gene origin in Drosophila; 3- investigate new gene origination associated with sex chromosome evolution. I expect that the systems biology approach in an integrated framework will help understand trajectories of new gene origination and its impact in genome evolution, speciation and phenotypic consequences.

Resumo em Inglês	The Human Genome Research Center (HGRC-CEPID I) was initiated in 2000 with the main goal of increasing our basic knowledge and diagnosis of prevalent genetic diseases in the Brazilian population. The HGRC concentrated largely on Mendelian disorders, mainly neuromuscular, craniofacial, and mental disability. The scope was expanded in 2005 by incorporating stem-cell research, both as a tool to understand gene expression and differentiation in genetic disorders and to evaluate its potential in disease therapy. Our research has allowed us to address questions on the genetic regulation of particular complex disorders such as autism and various neurodegenerative diseases. However, the unanticipated complexity of the transcriptional mechanisms regulating gene expression in humans that emerged from the Human Genome Project, and the modest advances in improving the effectiveness of genetic health care have opened new fields of investigation. In this CEPID 11 application, we have expanded the scientific breadth to include ageing and degeneration and how factors such as genome instability contribute to the aging process; the role of imprinting mechanisms on disease manifestation; which factors determine differences in the rate of brain degeneration between individuals, which constitutes a rapidly increasing health care burdon as the average life-span of the world population rises; what determines phenotypic variability between individuals carrying the same mutation. To address these questions we will use up to date approaches, particularly the use of second generation sequencing and sophisticated cell sorting, incorporate a much broader base of scientific expertise, optimize inter-group synergy as well as national and international research collaboration. The plan also contributes to translational medicine mainly in the application of stem-cells in preclinical studies and therapeutic trials for particular genetic disorders. The great number of patients with different genetic disorders that have been ascertained and registered in our center, the largest one in Latin America, and the ethnic variability of the Brazilian population provides an extremely rich foundation for the proposed studies. We are positive that the knowledge gained from CEPID 11 will have an important impact on genetic health care in Brazil. However, such an ambitious and integrated program can only be expedited by the flexibility and long term security offered by CEPID funding.

In several different taxa, there is indubitable evidence of transcriptional silencing of the X and Y chromosomes in male meiotic cells of spermatogenesis. However, the so called meiotic sex chromosome inactivation (MSCI) has been recently a hot bed for debate in Drosophila melanogaster. There are cytological and genetic observations, data from transgenic constructs with testis-specific promoters, global expression profiles obtained from mutant, wild-type, larvae and adult testes as well as from cells of different stages of spermatogenesis. There is no dispute on that D. melanogaster spermatogenesis presents a down-regulation of X chromosome that does not result from the lack of dosage compensation. However, the issue is currently focused on the level of reduction of X-linked expression, the precise time it occurs and how many genes are affected. The deep examination of data and experiments exposes the limitations intrinsic to the methods of studying MSCI in D. melanogaster. The current methods do not allow us to affirm anything else than the X chromosome down-regulation in meiosis (MSCI). Therefore, conclusion about level, degree or precise timing is inadequate. This project will implement new approaches to know the details of MSCI or other processes involved for D. melanogaster model.

A partir da descoberta dos introns na década de setenta, questões sobre sua origem vêm sendo discutidas (Gilbert 1978). Na verdade, as perguntas principais são: qual a função dos introns, quando e como eles surgiram e porque eles existem em eucariotos e não são encontrados em procariotos. Basicamente duas hipóteses existem para explicar a origem dos introns: "introns-early" e "introns-late". A primeira sugere que introns e exons formavam os primeiros genes e este tipo de organização estrutural permitiria e facilitaria a formação de novos genes através da troca de exons, fenômeno conhecido por "exon-shuffling". Já a hipótese "introns-late" assume que os introns foram adicionados somente em eucariotos e que o fenômeno de "exon-shuffling" surgiu recentemente (Li and Graur 2000). Cada uma destas hipóteses tem predições diferentes quanto a características dos introns e dos exons. Uma delas é a fase de introns, isto é, a posição em que estes estão localizados dentro de um códon. A versão mais simples da hipótese "introns-late" prevê a distribuição igual das fases dos introns devido à inserção aleatória destes em sequências contínuas. Segundo a hipótese "introns-early", se os introns já faziam parte da sequência de DNA dos primeiros genes atuando no processo de "exon-shuffling", espera-se que uma das fases de introns seja mais frequente: a troca de exons entre genes tem mais probabilidade de formar um proteína funcional se seus introns forem de mesma fase para que seja conservado o seu quadro de leitura (Li and Graur 2000; Long et al. 1995)..

A necessidade de identificar novos antígenos tumorais, que possam ser utilizados no tratamento e diagnóstico do câncer, tem levado ao desenvolvimento de técnicas eficientes para essa finalidade. Antígenos de diferentes categorias foram identificados e caracterizados e, entre eles, os antígenos cancer-testis (CT) e os antígenos de diferenciação (CD) são os de maior importância clínica dado seu restrito padrão de expressão. Utilizando alinhamentos entre seqüências expressas e a seqüência do genoma humano, identificamos um novo gene localizado no cromossomo 21, denominado CTSP-1. Este gene apresenta alta similaridade com o antígeno tumoral NY-BR-1, o qual codifica um fator de transcrição tecido específico e é alvo potencial para imunoterapia de câncer. Para verificar se o gene CTSP-1 realmente corresponde a um novo antígeno tumoral, nós realizamos a completa caracterização do mesmo.

Muito poucos genes do cromossomo Y de Drosophila melanogaster foram identificados até o momento, diferentemente da grande quantidade de genes já conhecidos no restante do seu genoma. Contudo, sabe-se que este cromossomo possui seis fatores responsáveis pela fertilidade dos machos. Mesmo depois do sequenciamento, poucos genes haviam sido identificados (kl-2, kl-3, kl-5, PRY, Pp1-Y1, Pp1-Y2, PPr-Y, ORY, CCY). Oito destes genes foram identificados através de uma abordagem que usa as seqüências não mapeadas do genoma de Drosophila ("armU"), seqüências expressas em testículo e proteínas conhecidas, incluindo métodos computacionais e testes experimentais para procura de novos genes. Neste trabalho estendemos essa análise computacional às novas seqüências de proteínas e ESTs disponíveis, identificando três novos genes (EF-Y, ARY e L7RY). Além disso, esclarecemos uma questão importante sobre dois genes já descritos: comparações filogenéticas permitiram mostrar que as proteínas fosfatases catalíticas (Pp1-Y1, Pp1-Y2) resultaram de duas transposições independentes para o cromossomo Y, e não de uma duplicação ocorrida após a transposição. Além da identificação desses três novos genes, discutimos suas características (homologia, função e expressão) dentro do padrão já encontrado do restante do Y: um cromossomo com genes de função macho específica e homólogos a seqüências autossômicas. Posteriormente, expandimos nossas procuras a genes heterocromáticos em geral de Drosophila, usando principalmente as seqüências expressas (ESTs) em diversos órgãos e tecidos. Esses resultados demonstram a importação do uso da bioinformática para os estudos em genética, possibilitando neste caso a identificação, em seqüências já disponíveis, de genes novos em um cromossomo ainda tão desconhecido como o Y de Drosophila.

Em Drosophila mediopunctata e em algumas outras espécies desse gênero existe um caráter chamado sex ratio que acarreta na alteração da proporção sexual da prole (Gersheson, 1928; James & Jaenike, 1990; Carvalho et al., 1989). Machos portadores de determinado cromossomo X (chamado de SR) produzem proles com excesso de fêmeas devido a degeneração dos espermatozóides Y (impulso meiótico) (Policansky & Ellison, 1970; Hauschteck-Jungen & Maurer, 1976). Em Drosophila mediopunctata, os cromossomos SR possuem o arranjo gênico X:21 ou X:2 (Figura 1; Carvalho et al.,, 1989). Em populações naturais, em geral, estes cromossomos coexistem com cromossomos X "normais", chamados genericamente de "ST" (Standard). O cromossomo SR possui uma vantagem de transmissão em relação ao cromossomo ST: machos SR/Y produzem um proporção maior de espermatozóides SR, enquanto machos ST/Y produzem espermatozóides ST e Y em igual quantidade. Devido a essa vantagem de transmissão, não é difícil prever um rápido aumento do número de indivíduos portadores de SR e, consequentemente, da proporção de fêmeas na população. Por causa desse desvio da proporção sexual, teoricamente a população ou até a espécie pode se extinguir devido a ausência de machos (Figura 2) (Hamilton, 1967). Entretanto, Drosophila mediopunctata não é uma espécie extinta. A presença de supressores podem diminuir a vantagem do cromossomo SR. Nesta espécie (como em algumas outras) existem genes supressores no Y e nos autossomos (Carvalho e Klaczko, 1993; Carvalho e Klaczko, 1994; Stalker, 1961; Voelker, 1972). Machos SR/Y com genes supressores no Y ou nos autossomos produzem proles normais ( 50% de machos). Assim sendo, este conjunto de genes (SR e seus supressores) estão envolvidos em um importante fenômeno biológico: a evolução da proporção sexual.