Enrique Mario Boccardo Pierulivo.

A infecção por tipos de papilomavírus humanos (HPV) de alto risco oncogênico, está etiologicamente associada com quase a totalidade dos cânceres da cérvice uterina, com mais de 50% de outros carcinomas anogenitais e uma proporção importante de tumores da orofaringe. Os HPV de alto risco expressam duas oncoproteínas, E6 e E7, que agem sobre fatores celulares específicos promovendo proliferação celular contínua, resistência à morte por apoptose, resistência a citocinas, evasão do sistema imune e alterações cromossômicas numéricas e estruturais. Além disso, o processo de tumorigênese associado à infecção por HPV é caracterizado por alterações em componentes da matriz extracelular (MEC). A proteína RECK (reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs) apresenta função essencial na remodelação tecidual e na angiogênese tumoral, através da regulação pós-transcricional da atividade das metaloproteinases de matriz MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). Estudos realizados previamente por nosso grupo mostram que a expressão de RECK é baixa em lesões do colo uterino de alto grau e em amostras de câncer cervical, quando comparadas a amostras de pacientes com cervicite. Além disso, mostramos que a expressão de oncogenes de HPV está associada à queda dos níveis de RECK em modelos de cultura celular. Ainda mais, mostramos que a superexpressão de RECK diminuiu o potencial tumorigênico de linhagens celulares derivadas de tumores da cérvice uterina em camundongos nude e que este efeito estava associado a uma clara mudança no perfil do infiltrado inflamatório detectado nos tumores. Recentemente, observamos através de ensaios de gene reporter, que a expressão dos de genes E6E7 de HPV está associada à regulação negativa do promotor do gene RECK. Em conjunto, esses dados sugerem que regulação negativa de RECK pode ser uma peça chave na história natural dos tumores associados ao HPV. O presente estudo visa determinar o papel de RECK no processo de carcinogênese mediado por HPV em modelo de animais imunocompetentes. Para isto analisaremos o efeito da superexpressão de RECK no potencial tumorigênico de células TC-1, um modelo amplamente utilizado no estudo do processo de carcinogênese mediado por HPV. Além disso, pretendemos aprofundar o estudo do envolvimento de proteínas de HPV na regulação da atividade transcricional do promotor de RECK através da análise do padrão de metilação do promotor desse gene. Os resultados desse estudo ajudarão a determinar o papel de RECK no estabelecimento e progressão de tumores associados ao HPV.

As infecções persistentes por HPV (papilomavírus humano) de alto risco oncogênico estão
associadas ao desenvolvimento de câncer cervical e vulva em mulheres, câncer de pênis em
homens, além de tumores de ânus e orofaringe em ambos os sexos. Dentre esse grupo, o HPV-16 é
mundialmente o tipo mais prevalente em carcinomas cervical, seguido por HPV-18. Nas neoplasias
de outros sítios anogenitais e da orofaringe o HPV-16 é detectado na quase totalidade dos tumores
atribuíveis ao HPV. Por outro lado, as verrugas genitais e a rara, mas séria papilomatose respiratória
recorrente (PRR) estão etiologicamente associadas à infecção pelos HPVs de baixo risco
oncogênico 6 e 11. Devido à importância destes quatro vírus, desde 2006 está disponível uma
vacina quadrivalente profilática capaz de prevenir a infecção pelos HPVs 6, 11, 16 e 18.
A variabilidade nucleotídica intra-típica de alguns tipos de HPV tem sido estudada resultando em
importantes achados no que concerne a sua filogenia e evolução. Adicionalmente, estudos
realizados por nós e outros revelaram, que nas mulheres, variantes específicas de HPV-16 estão
associadas ao maior risco de desenvolvimento de tumores e lesões pré-neoplásicas cervicais e anais.
Ao contrário, existe uma lacuna no conhecimento acerca do impacto da variabilidade de HPV-16
sob a persistência da infecção e o desenvolvimento das neoplasias da região anogenital masculina, e
da orofaringe em ambos os sexos. Em relação aos HPVs de baixo risco oncogênico, nós
recentemente demonstramos que, em homens, variantes específicas de HPV-6 estão associadas à
um risco elevado de desenvolvimento de verrugas genitais, enquanto a variabilidade de HPV-11
parece não impactar o desfecho clínico. Estudo semelhante está em andamento no nosso laboratório
em amostras genitais de mulheres participantes de um estudo epidemiológico prospectivo.
Entretanto, devido à PRR ser uma doença rara, os dados referentes à prevalência das variantes dos
HPVs 6 e 11, e ao impacto da heterogeneidade viral sobre as variáveis clínicas desta moléstia estão
limitados a estudos englobando um número restrito de amostras.
A região do genoma de HPV necessária à imortalização de queratinócitos humanos primários foi
mapeada à região viral da LCR-E6-E7. Assim, é razoável supor que alterações nessas regiões
podem afetar a função biológica e consequentemente o desfecho clínico das infecções. A
transcrição e a replicação de HPV são reguladas pela ligação de proteínas celulares e virais à ciselementos na LCR (long control region). Nós observamos que variantes de um mesmo tipo de HPV
apresentam diferenças na atividade transcricional que podem ser atribuídas a diferenças na ligação
de fatores de transcrição (FT), tanto celulares quanto virais, uma vez que a sequência nucleotídica
da LCR difere em até 5% entre variantes de um mesmo tipo viral. Embora esses dados suportem
uma possível implicação da heterogeneidade genética da LCR sobre a patogênese das neoplasias
associadas à infecção por HPV, atualmente, o conhecimento acerca da regulação da expressão
gênica viral é limitado.
Pelo exposto, este projeto visa: (1) caracterizar o impacto da variabilidade genética viral sobre a
persistência da infecção e das doenças associadas ao HPV na região anogenital de homens, e em
sítios extragenitais em ambos os sexos; (2) avaliar o efeito de uma ampla gama de FTs celulares
sobre a expressão gênica dos genes precoces dos HPVs 18, 16, 11 e 6; (3) avaliar dentre os FTs
celulares requeridos para a expressão gênica dos HPVs de alto risco 16 e 18, aqueles que
potencialmente poderiam ser novos alvos de terapias antivirais; (4) avaliar a atividade transcricional
dos promotores precoces dos HPVs de baixo risco 6 e 11 durante a diferenciação celular. Esse
conhecimento é fundamental para melhor compreender a biologia, patogenia, diagnóstico e manejo
clínico dessas doenças.

Alguns tipos de HPV, conhecidos coletivamente como HPV de alto risco, estão etiologicamente
associadas com quase a totalidade dos cânceres da cérvice uterina e com mais de 50% de outros
carcinomas anogenitais. Os HPV de alto risco expressam duas oncoproteínas, E6 e E7, que agem
sobre fatores celulares específicos promovendo proliferação celular contínua, resistência à morte por
apoptose, resistência a citocinas, evasão do sistema imune e alterações cromossômicas numéricas e
estruturais. Além disso, foi observado que entre os mecanismos de carcinogênese associados ao HPV
incluem-se alterações em componentes da matriz extracelular (MEC), como as metaloproteinases de
matriz (MMP) e alguns de seus reguladores. As MMP são responsáveis pelo remodelamento da MEC
e o aumento de sua expressão exerce um papel chave em vários processos. Estudos realizados
previamente por nosso grupo mostram que células que expressam a oncoproteína E7 de HPV16
apresentam maiores níveis de expressão e atividade de MMP-9. Além disso, a expressão de E7 está
associada à queda os níveis nos reguladores de MMPs, TIMP-2 e RECK. A proteína RECK
(reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs) apresenta função essencial na
remodelação tecidual e na angiogênese tumoral, através da regulação pós-transcricional da atividade
de MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). A expressão de RECK também é baixa em lesões do
colo uterino de alto grau e em amostras de câncer cervical, quando comparadas a amostras de
pacientes com cervicite. Em conjunto, esses dados sugerem que regulação negativa de RECK pode
ser uma peça chave na história natural do câncer cervical. O presente estudo visa determinar o papel
de RECK no processo de carcinogênese mediado por HPV. Para isto analisaremos o efeito da
superexpressão de RECK no potencial tumorigênico de linhagens celulares derivadas de tumores de
cérvice uterina in vitro e in vivo. Além disso, pretendemos verificar o envolvimento de proteínas de
HPV na regulação da atividade transcricional do promotor de RECK. Os resultados desse estudo
ajudarão a determinar o papel de RECK no estabelecimento e progressão de tumores associados ao
HPV.

Analisar o estado da via EGFR/AP-1 e PIR/NF-κB em culturas que expressam oncogenes de HPV16 tratadas com fumo de cigarro.

O carcinoma de células de Merkel (CCM) é uma neoplasia rara, muito agressiva que afeta principalmente indivíduos maiores de 50 anos e com o sistema imunológico comprometido. Este tumor ocorre mais frequentemente em homens, caucasianos e em sítios anatômicos mais expostos à luz solar. O acrônimo AEIOU é usado para caracterizar essa patologia, onde: falta de sintomas - Asymptomatic; rápido crescimento - Expanding rapidly; imuno compromentimento - Immunosupression; idade maior que 50 anos - Older than 50; regiões expostas ao Sol - UV exposed site, descrevem-na. Em 2008 foi identificado um poliomavírus em amostras de carcinoma de células de Merkel através da técnica de subtração digital de transcriptoma. Esse foi o quinto vírus a ser descrito, de um grupo de doze agentes pertencentes à família Poliomaviridae que infectam humanos. O vírus recebeu o nome de poliomavírus de células de Merkel (MCPyV) por seu envolvimento com o CCM, e atualmente é considerado um carcinógeno de tipo 2A (provavelmente carcinogênico em humanos) pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC). Na pele humana ocorre também, muito frequentemente, a presença de outros vírus envolvidos com a carcinogênese cutânea, como por exemplo, os papilomavírus do gênero Beta. Os objetivos deste estudo são: i) determinar a prevalência destes dois tipos virais em amostras de CCM do Brasil; ii) analisar a sequência de regiões virais específicas do MCPyV e gerar árvores filogenéticas por alinhamento com sequências já disponíveis de outras regiões geográficas e iii) analisar o efeito da infecção viral no padrão de expressão de proteínas envolvidas na manutenção da polaridade celular e da transição epitélio mesênquima.

Alguns tipos de papilovírus humanos (HPV), conhecidos coletivamente como HPV de alto risco, estão etiologicamente associadas com quase a totalidade dos cânceres da cérvice uterina e com mais de 50% de outros cânceres anogenitais. A infecção por estes tipos de vírus tem sido associada à presença de alterações no padrão de proliferação celular em tecidos, aumento da relação núcleo citoplasma nas células dos epitélios infectado e ao aumento de alterações genômicas. Estas características são comuns à maioria dos cânceres humanos. Os HPV de alto risco expressam duas oncoproteínas, E6 e E7, que agem sobre fatores celulares específicos promovendo proliferação celular, favorecendo a perda de polaridade celular e a transição epitélio-meséquima. Diversos estudos de nossos laboratórios mostram que vários alvos celulares da proteína E6 estão envolvidos na manutenção da polaridade celular, entre eles a proteína humana homóloga ao supressor de tumores de Drosophila, Disc large (DLG1). Esta proteína se localiza nas uniões aderentes entre células desenvolvendo funções estruturais e de transdução de sinais. A proteína E6 de HPV de alto risco se liga à proteína DLG1 induzindo sua degradação pela via de proteólise dependente de ubiquitina. De fato, a perda de expressão de DLG1 tem sido observada em lesões de alto grau e carcinomas associados ao HPV. Além disso, outras proteínas de adesão celular tem sido descritas como alvos da proteína E6 de HPV de alto risco, por exemplo, Scribble [uniões aderentes], a Membrane-associated guanylate kinase with inverted domain structure-1 (MAGI-1) e Partitioning-defective 3 (Par-3) [uniões tipos tight]. No entanto, o padrão de alterações na expressão de proteínas de adesão celular durante a progressão das lesões associadas ao HPV é desconhecido. Portanto, pretendemos analisar as alterações na expressão destas proteína em culturas organotípicas que expressam genes de HPV. Este sistema recapitula o programa de diferenciação dos epitélios e constitui uma ferramenta fundamental para o estudo dos mecanismos de transformação celular associados ao HPV. Esta abordagem poderá contribuir a determinar a importância das moléculas de adesão no processo de transformação celular mediado por HPV abrindo possibilidades para seu uso no diagnóstico e na terapia de lesões associadas a este vírus.

Alguns tipos de HPV, conhecidos coletivamente como HPV de alto risco, estão etiologicamente associadas com quase a totalidade dos cânceres da cérvice uterina e com mais de 50% de outros cânceres anogenitais. A infecção por estes tipos de vírus tem sido associada à presença de instabilidade genômica, uma característica comum à maioria dos cânceres humanos. Os HPV de alto risco expressam duas oncoproteínas, E6 e E7, que agem sobre fatores celulares específicos promovendo proliferação celular. Estas proteínas são capazes de induzir alterações cromossômicas numéricas e estruturais. Além disso, podem modular a resposta da célula à presença de dano no DNA. A letalidade sintética descreve uma condição celular na que duas (ou mais) mutações não alélicas e não essencias, que não são letais individualmente, tornan-se mortais quando presentes na mesma célula. Células transformadas por HPV de alto risco constituem modelos de particular interesse para o estudo de letalidade sintética, uma vez que as oncoproteínas E6 e E7 agem em várias vias de transdução de sinal, como por exemplo, as reguladas por p53 e pRb. No presente projeto propomos inibir sistematicamente genes envolvidos nos sistemas de reparo de dano ao DNA e genes supressores de tumor utilizando bibliotecas de lentivírus que expressam shRNA específicos. Esta abordagem poderá contribuir à identificação de genes essências para a sobrevivência de células transformadas por HPV. Mais ainda, além de abrir possibilidades para desenvolver novas estratégias para o tratamento de lesões associadas a este vírus, as bibliotecas de lentivírus e a informação gerada nesse projeto poderão ser aplicadas ao estudo de outros tumores de etiologia viral ou não.

Este projeto visa identificar alvos moleculares nas diferentes populações celulares que compõem os tumores da cérvice uterina. Isto poderá contribuir à caracterização de novos alvos terapêuticos.

Os carcinomas são tumores malignos de estrutura complexa compostos por células malignas de origem epitelial. Além disso, outros tipos celulares que compõem o estroma tumoral, como fibroblastos, células endoteliais, pericitos, adipócitos e leucócitos podem ser identificados no tumor e ao redor do mesmo. Além disso, a matriz extracelular e a presença de diferentes fatores solúveis como citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, secretados pelos vários tipos celulares presentes, aumentam a complexidade destas estruturas. Essa combinação cria um microambiente tumoral único que pode modificar as propriedades das células neoplásicas. As proteínas E6 e E7 dos papilomavírus humanos (HPV) são pleiotrópicas e exercem diversos efeitos na célula hospedeira. As mesmas, são capazes de imortalizar queratinócitos humanos normais, alterar o ciclo e o programa de diferenciação destas células, promovendo o acúmulo de defeitos mitóticos. E6 e E7 também promovem vários mecanismos de evasão da resposta imune, ainda assim, na maioria das mulheres a resposta imune celular é capaz de promover a regressão das lesões associadas ao HPV e eliminar a infecção. Por outro lado, mulheres com câncer apresentam tolerância aos antígenos do HPV que tem sido associada à presença de células T regulatórias (Treg), e com menor evidência a macrófagos infiltrantes. Finalmente, vários estudos mostram que as oncoproteínas de HPV de alto risco induzem a síntese de VEGF em queratinócitos. O aumento da angiogênese é um processo fundamental na progressão tumoral que pode ser favorecido não apenas pelas células malignas, mas por macrófagos e células mielóides infiltrantes, ou pela presença células endoteliais e pericitos no local. Desta maneira, o estudo das interações entre as células que expressam oncogenes de HPV e os demais elementos celulares e acelulares que compoem e regulam o ambiente tumoral contribuirá ao melhor entendimento dos processos patológicos associados à infecção por estes vírus.

O projeto visa estudar o efeito do TNF na expressão de genes associados à proliferação celular em culturas organotípicas de queratinócitos normais ou tranduzidos com o gene E7 de HPV- 16 (normal e vários mutantes em diferentes regiões funcionalmente importantes do gene) utilizando cDNA arrays.

As infecções por HPVs de alto risco são responsáveis por quase a totalidade dos cânceres da cérvix uterina, uma das principais causas de morte de mulheres no mundo inteiro. No entanto, o caráter transitório da maioria das infecções por HPV indica a importância da presença de um sistema eficiente de imunidade celular para o controle das mesmas. A resposta imune mediada por células é coordenada por varias citocinas inflamatórias. O TNF desempenha um papel importante na eliminação de células tumorais por macrófagos ativados e linfócitos citotóxicos como mecanismo precoce de ação anti-tumoral. Por este motivo, a resistência das células tumorais à citotoxicidade do TNF poderia constituir um passo fundamental para o desenvolvimento de tumores in vivo. Interessantemente, observamos que a expressão da proteína E7 de HPVs de alto risco em queratinócitos pode induzir resistência aos efeitos antiproliferativos do TNF (Boccardo et al., 2004). Todavia, as vias celulares de sinalização envolvidas no efeito antiproliferativo do TNF em queratinócitos não tem sido identificadas. O presente projeto visa à compreensão dos mecanismos genéticos que modulam os efeitos do TNF em queratinócitos, assim como o estudo do papel da oncoproteína E7 na aquisição da resistência a esta citocina.