Maria Carolina Quecine.

Grupo de estudo financiado pela ASM (Sociedade Americana de Microbiologia) onde estudantes de iniciação científica, mestrado e doutorado promovem o estudo e a divulgação de estudos relacionados a microbiologia.

O fósforo (P) é um elemento essencial para o desenvolvimento e crescimento das plantas. Em regiões tropicais, este elemento encontra se fortemente retido à matriz do solo, sendo necessários manejos mais sustentáveis do que a aplicação de altas doses de fertilizantes fosfáticos para suprir as necessidades nutricionais das plantas. Nesse contexto, linhagens de Bacillus spp. têm se destacado como solubilizadoras e mineralizadoras de P. A associação destas bactérias com fungos micorrízicos arbusculares (FMAs), sabidamente relacionados a uma maior eficiência na absorção de P pelas plantas, pode promover uma disponibilidade ainda mais significativa deste nutriente durante a interação Bacillus spp. ? FMA - planta. Entretanto, estudos genéticos do processo de solubilização e mineralização de P são incipientes em Bacillus spp. e o efeito desta atividade na associação com FMAs é pouco conhecida em nível molecular. Diante desse cenário, o presente projeto visa elucidar os mecanismos de solubilização e mineralização de P por Bacillus spp. capazes de interagir com FMAs, contribuindo para o crescimento da cana-de-açúcar e milho. Bioensaios in vitro serão realizados para selecionar linhagens de Bacillus spp. com significativo perfil de solubilização e mineralização de P e que em associação com os FMA Rhizophagus intraradices otimizem a captação de P e estimulem o crescimento da cana-de-açúcar e milho. Também será investigado o efeito da inoculação de Bacillus spp. ? FMA na modulação da comunidade bacteriana e fúngica associadas à cana-de-açúcar e milho, bem como verificado por metataxonômica e espectroscopia de fluorescência de raio-X qual o real efeito da inoculação e da comunidade microbiana nativa na condição de maior acumulação de P nas raízes e na rizosfera dessas culturas. Os genomas das linhagens de Bacillus spp. mais promissoras serão sequenciados visando a obtenção de um portfólio de genes chaves relacionados ao ciclo do P por essas bactérias bem como estudos de genômica comparativa. Os genes identificados como chaves em vias metabólicas da solubilização e mineralização de P serão noucateados por edição gênica utilizando-se o sistema CRISPR-Cas9. Esta etapa visa determinar o real papel desses genes na atividade de solubilização e mineralização por Bacillus spp., assim como na interação com FMAs e com cana-de-açúcar e milho. Destaca-se que, por meio do nocaute do sistema dois componentes PhoP/PhoR, e, a obtenção do transcriptoma de seus respectivos mutantes será possível obter o regulon relacionados à presença de P no ambiente em Bacillus spp. Os resultados obtidos neste trabalho que utilizará uma abordagem polifásica para desvendar o papel de Bacillus spp. no ciclo do P certamente irão permitir uma compreensão inédita dos mecanismos genéticos envolvidos na solubilização e mineralização de P, assim como um melhor entendimento ecológico na interação planta-microrganismo contribuindo assim para desenvolvimento de uma agricultura mais sustentável.

Dentre os organismos vivos, os microrganismos são provavelmente os mais versáteis, participando de processos naturais vitais e também interagindo com uma vasta gama de outros organismos. Destas interações, a complexa relação entre fitopatógenos e plantas tem merecido especial atenção, principalmente devido as enormes perdas econômicas e os impactos ambientais resultantes. Atualmente, na era das ômicas, com o avanço da genômica, transcriptômica e proteômica, a complexa interação patógeno- planta- está começando a ser compreendida com maior detalhamento molecular. Esses estudos são mais relevantes quando são estudados patossistemas de grande importância, e, com informações moleculares incipientes, como é o caso da ferrugem do eucalipto causada pelo fungo biotrófico Puccinia psidii. Esse patógeno, oriundo de mirtáceas da América do Sul, hoje considerado cosmopolita, causa significativas perdas para silvicultura brasileira e mundial, reduzindo em até 60 % a produtividade na cultura de eucalipto. Assim, a partir dos princípios da biologia de sistema, o objetivo do presente projeto de pesquisa é o estudo integrado em nível genômico, transcricional e traducional do fitopatógeno P. psidii durante o processo de infecção em Eucalyptus spp.. Os dados obtidos serão de suma importância para o melhor entendimento da biologia desse interessante patógeno quanto ao sua morfogênese e do seu processo de patogênese. Além disso, com uma abordagem pouco explorada em estudo de interação patógeno - planta, o presente projeto possibilitará o desenvolvimento de um banco de dados de genes, transcritos e proteínas de P. psidii, que poderão ser utilizados por outros grupos de pesquisa, e, possibilitará a partir das inter-relações dessas moléculas, um entendimento holístico nos estudos de interações microrganismo- plantas, aplicando a biologia de sistemas em estudos de interação planta patógeno que é emergente no Brasil.

O objetivo do presente projeto de pesquisa é o estudo da expressão gênica de Puccinia psidii Winter, agente causal da ferrugem em Eucalyptus spp., visando a identificação e descrição de novos genes relacionados a sua patogenicidade. Além disso, será o presente projeto possibilitará o desenvolvimento de um banco de dados de transcritos para P. psidii. Destaca-se que o estudo dos genes diferencialmente expressos pelo patógeno colaborará para o entendimento da biologia do fungo uma vez que estudos básicos relacionados aos mecanismos de patogenicidade são incipientes no Brasil e no mundo. Para tanto, será realizada a inoculação de E. grandis, clone S4, caracterizado previamente como susceptível ao patógeno, com esporos do isolado de P. psidii, sendo amostrados diferentes tempos durante o processo de infecção para sequencimento de RNA (RNAseq) utilizando a plataforma Illumina. Os dados serão avaliados por meio do programa CLC bio e R Studio e a anotação dos transcritos diferencialmente expressos utilizando o programa Blast2GO. A validação dos dados será realizada por meio da técnica de RT-qPCR. O estudo do transcriptoma desse importante patógeno durante o processo de infecção de E. grandis corroborará substancialmente para o entendimento dos mecanismos envolvidos na sua patogenicidade, além de permitirem avanços nos programas de melhoramento genético, bem como no desenvolvimento de estratégias de controle do patógeno.

Rust fungi (Pucciniales) cause some of the most devastating plant diseases and are comprised of more than 7,000 species in over 100 genera. The genus Puccinia is the largest in the Pucciniales and is considered to be the most economically destructive genera of biotrophic fungi. The eucalyptus rust, caused by P. psidii, is responsible by loses up to 60% in Eucalyptus young plants. Thus our current research project aim to evaluate the pathogenicity approaches at transcriptional and pos-transduction level of this pathogen.

A cana-de-açúcar é uma das mais importantes culturas para o Brasil e vem recebendo significativa atenção devido à crescente substituição de combustíveis fósseis por fontes renováveis e menos poluentes de energia como o etanol. Consequentemente, os aspectos fitossanitários da cultura são de suma importância para o aumento da produtividade e redução dos custos da produção. Assim, os objetivos do projeto de pesquisa é o desenvolvimento de uma metodologia eficiente de transformação de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), agente causal do raquitismo da soqueira em cana-de-açúcar e estudos de colonização de variedades de cana-de-açúcar resistentes e susceptíveis ao patógeno marcado. O desenvolvimento de uma metodologia de transformação do patógeno será realizado mediante a utilização de vários plasmídios replicativos e integrativos e diversos parâmetros de eletroporação. O estudo da colonização de cana-de-açúcar por Lxx será realizada por meio de re-isolamento e observações por microscopia de fluorescência mediante marcação do patógeno com o gene da GFP. Para tanto, plasmidios integrativos e replicativos serão construídos para expressão de GFP em Lxx. Variedades resistentes e susceptíveis de cana-de-açúcar serão utilizadas nos ensaios de colonização. Paralelamente aos experimentos com Lxx, uma linhagem de Leifsonia xyli subsp. cynodontis (Lxc) será utilizada como bactéria modelo nos ensaios de transformação e colonização. Apesar de muito similar esta subespécie apresenta um crescimento relativamente rápido e também é capaz de colonizar endofiticamente cana-de-açúcar sem causar sintomas de doença. A transformação de Lxx será de suma importância para ensaios futuros de genômica funcional do patógeno, além de permitir a marcação do patógeno e consequentemente o monitoramento detalhado da colonização de variedades resistentes e susceptíveis de cana-de-açúcar pelas linhagens de Lxx e Lxc. Os dados obtidos colaborarão de forma imprescindível para a compreensão da biologia do patóg

Secondary metabolite production is a striking characteristic of Pseudomonas spp., and the current availability of genomic sequence data further highlights the capacity for secondary metabolite production in this group of bacteria. At least 6% of the genome of Pseudomonas fluorescens Pf-5, a rhizosphere bacterium that suppresses plant diseases, is devoted to secondary metabolism, with gene clusters for the biosynthesis of two siderophores, hydrogen cyanide, and several antibiotics (pyrrolnitrin, 2,4-diacetylphloroglucinol, and pyoluteorin) distributed throughout the genome. In addition to the secondary metabolites known to be produced by Pf-5 prior to genomic sequencing, three orphan gene clusters were identified in the genome of this bacterium. Two of these orphan gene clusters have now been shown to encode for two antifungal metabolites and an insect toxin.

A introdução de novas técnicas de Biologia Molecular e a necessidade do aumento
da produção de alimentos resultaram no desenvolvimento de organismos geneticamente
modificados (OGMs) pela presença de genes bacterianos, virais, fúngicos entre outros.
Estes transgenes conferem a estes organismos maior resistência a doenças e pragas, bem como aumento na produção de moléculas de interesse. Estudos recentes têm mostrado que estes organismos são, na maioria dos casos, seguros para o ambiente, mas estudos envolvendo o seu impacto em países tropicais têm sido incipientes e ainda incompletos. i) avaliar os efeitos de plantas geneticamente modificadas sobre a diversidade genética e fisiológica de populações bacterianas; ii) avaliar os efeitos da transgenia sobre expressão de genes de bactérias associadas endofiticamente à planta hospedeira; iii) avaliar in vitro e in vivo a transferência de DNA de PGM para bactérias do ambiente. Este trabalho espera realizar um amplo estudo a respeito da interação de plantas geneticamente modificadas com bactérias, permitindo uma avaliação dos efeitos destas plantas sobre estas populações, e o seu impacto sobre a diversidade microbiana, além de iniciar no Brasil um estudo mais aprofundado das interações PGM e bactérias. Além disso, este projeto propõe a introdução da técnica de PCR quantitativo no Departamento de Genética da ESALQ e genômica funcional, aumentando o entendimento das interações PGMs e comunidades microbianas, possibilitando no futuro a sua aplicação ao melhoramento vegetal.

Endophytic bacteria and fungi are defined as organisms that live in association with plants for most if not all of their life cycles. They live within the intercellular spaces and may confer benefits to the plant, and the benefits may be reciprocal, resulting in an enhanced symbiotic system for specific plant characteristics. Therefore, the use of endophytic bacteria and fungi opens up new areas of biothechnological exploitations, which drive the necessity to isolate and culture these organisms. The biochemical versatility and diversity of endophytes represent an enornous variety of genes that are still unknown. More and more useful gene functions are being discovered, particularly for environmental remediation and industrial processes. This project pruposses to study the biological diversity of endophytic microorganisms from important plant species growing in São Paulo State, such as: maize, soybeans, citros, coffee, cassava, Brachiaria and Dicksonia (xaxim); to study the molecular diversity (molecular systematics); to determine the chemical diversity, mainly of secondary metabolites-"antibiotics"; to assess the potential of endophytes in the biological control of most important pathogens of the host plants. Also, it is objective of this project to study best methods of preserving representative general and specific groups.

In this study, we intend to use two different approaches to examine the role of xanthan gum in the expression of virulence of X. fastidiosa. The first is to generate mutants of selected genes responsible for the production of xanthan gum in X. fastidiosa and evaluate these mutants with respect to the establishment of initial cell populations following their inoculation in the xylem of vinca and citrus plants. The second approach involves exposing X. fastidiosa to an in planta, xanthan gum-degrading environment. This will be accomplished by the production and secretion of xanthan gum-degrading enzymes into the plant xylem by endophytic microorganisms. To understand the role of this xanthan gum in the pathogenicity, mutants deficient for xanthan gum production or showing differential expression of the genes that encoding this polysaccharide are desirable. For this, we have worked in collaboration with Dr. Patrícia B. Monteiro (Fundecitrus, Araraquara, SP) for disruption of X. fastidiosa xanthan gum genes. Therefore, the objectives of this research were i) to construct a gene replacement cassette for gumB, gumD and gumF gene; ii) to construct a cassette for disruption of gumB, gumD and gumF genes by single crossing over; iii) to disrupt gumB, gumD and gumF genes and iv) to characterize the gum mutants of X. fastidiosa. The other aspect of this work were to (i) evaluate the colonization of citrus plants by Methylobacterium spp.; (ii) study the pectinase and celulase production by Methylobacterium spp.; (iii) study nitrogen fixation by Methylobacterium spp.; (iii) study siderophore production by Methylobacterium spp. and (iv) analyze in vitro the interaction between endophytic bacteria and X. fastidiosa. .