Luiz Alberto Beraldo de Moraes.

A importância da química de produtos naturais microbianos como fonte de moléculas bioativas é indiscutível. O isolamento e identificação de metabólitos secundários produzidos por microrganismos é de suma importância para indústria química, farmacêutica e agroquímica. Estudos revelaram que alguns metabólitos secundários microbianos, codificados nos genomas, permanecem a serem descobertos, provavelmente, por que esses genes não são transcritos sob condições laboratoriais. Várias abordagens têm sido realizadas na tentativa de ativação dessas vias biossintéticas crípticas, as quais incluem modificações dos meios de cultivo (OSMAC- do inglês, one strain many compounds), co-cultivo, cultivo misto, entre outros. Da mesma forma, diferentes metodologias analíticas baseadas em LC-MS/MS, tais como desreplicação, molecular networking e MS-imaging, foram desenvolvidas nesta última década com o objetivo de acelerar a anotações ou identificações de metabólitos secundários presentes nos extratos brutos. Porém, poucos estudos são descritos na literatura visando o desenvolvimento de metodologias de preparo de amostras, para isolamento de metabólitos polares produzidos por microrganismos. Por esta razão, este projeto de pesquisa tem como objetivo avaliar diferentes técnicas de preparo de amostras para a identificação de metabólitos secundários polares bioativos. Para isso serão avaliadas novas metodologias de preparo de amostras empregando SPME na forma Coated Blade Spray (CBS) a qual permite um acoplamento direto a fonte de ionização do MS. A CBS é uma das tecnologias mais abrangentes no preparo de amostra. Também serão avaliadas as técnicas de extração liquido-liquido em modo convencional e por "QuEChERs". Para o desenvolvimento desta metodologia serão utilizados metabólitos polares comerciais, tais como, antibióticos amino glicosídeos, fosfonados e sulfonados. A metodologia desenvolvida será aplicada em amostras de processos fermentativos com actinobactérias produtoras de amino glicosídeos e na coleção de microrganismos presentes em nosso laboratório.

Micro-organismos são uma inesgotável e importante fonte de metabolitos secundários bioativos com diferentes modos de ação. As actinobactérias, têm se mostrado eficiente para realizar a biossíntese de uma grande variedade de metabolitos secundários bioativos, em especial de antibióticos. Avanços recentes no sequenciamento do genoma de algumas actinobactérias do gênero Streptomyces, revelaram que essas actinobactérias apresentam potencial para produzir muito mais metabólitos secundários do que aqueles que são identificados usualmente. Assim, muitos agrupamentos de genes microbianos podem estar silenciados "cryptic genes" sob as condições de crescimento padrão em laboratório. Várias estratégias têm sido aplicadas para a ativação de vias crípticas microbianas, como OSMAC, expressão heteróloga e homologa, co-cultivo e engenharia ribossômica. Dentre elas a engenharia ribossômica nos parece mais atraente, devido ao fato de não necessitar do conhecimento global do genoma bacteriano. Neste sentido, este projeto de pesquisa tem como objetivo principal aplicar a engenharia ribossômica para gerar mutantes de três linhagens de actinobactérias (CAAT 1-54, EUCAL 26 e CAAT 2-63), previamente estudadas em nosso laboratório, para avaliar a superprodução dos antibióticos lisolipina, nigericina e actinomicina D, além da identificação de novos metabolitos secundários crípticos através das análises por LC-MS/MS dos mutantes gerados.

O setor sucroalcooleiro foi responsável por aproximadamente 2% do PIB nacional e por 31% do PIB da agricultura no Brasil em 2012, tendo empregado cerca de 4,5 milhões de pessoas. O Brasil é o segundo maior produtor de etanol do mundo. No entanto, o monitoramento e o controle de contaminantes da microbiota nas dornas de fermentação são fundamentais para a melhora na eficiência e no rendimento da produção de etanol. A contaminação bacteriana é certamente o principal fator que afeta a fermentação alcoólica. Quando a contaminação bacteriana atinge níveis entre 107 e 108 células/mL de mosto, ocorrem queda significativa no rendimento alcoólico. Sem duvida alguma, o uso de biocidas os quais, em virtude de suas propriedades bactericidas ou bacteriostáticas, funcionam como agentes desinfetantes, reduzindo a contaminação microbiológica da fermentação é o procedimento mais comumente empregado. Os antibióticos comerciais mais utilizados para o controle bacteriano durante a fermentação são o clorafenicol, a tetraciclina, a penicilina e a monensina sódica. Dentre os quais se destaca o antibiótico importado, monensina sódica, que possui grande atividade sobre bactérias Gram-positivas, as principais causas de contaminação no processo de fermentação etanólica. Atualmente, o gasto com antibióticos para a produção de etanol está em torno de R$ 0,02 por litro, sendo assim, a implantação de uma produção local de antibiótico a baixo custo pode ser uma alternativa para a diminuição do custo final na produção de etanol. Se a tecnologia atender toda a produção do Estado de São Paulo, e gerasse uma diminuição de R$ 0,01 por litro de etanol produzido, a economia seria de R$ 99 milhões considerando a safra de 2013/14. A monensina é comercializada por várias empresas do setor, com vendas anuais de 180 toneladas ao preço médio de R$ 220,00/Kg, perfazendo anualmente o valor de R$ 39.600.000,00. A monensina sódica pertence à classe de antibióticos poliéteres ionóforos, produzidos por actinobactérias do gênero Streptomyces cinnamonensis, dentro desta classe de compostos são conhecidas mais de 120 estruturas diferentes, dentre elas a nigericina. Em um trabalho recente, referente à dissertação de mestrado do aluno André Luiz Scridelli Silva, foi avaliado o potencial de produção de nigericina pela actinobactéria EUCAL 26, isolada da rizosfera do eucalipto. Esta actinobactéria apresenta um grande potencial biotecnológico, em virtude de produzir apenas a nigericina como metabolito ativo, ou seja, o extrato bruto é composto única e exclusivamente por nigericina. Outro resultado bastante promissor, foi a produção de nigericina em aproximadamente 500,0 mg/L, empregando uma solução melaço de soja 1% como meio de cultivo. O melaço de soja é um resíduo agroindustrial de baixo custo e com grande potencial para aplicação em processos biotecnológicos. Também foi realizado testes de atividade biológica comparativos entre nigericina e monensina, frente a diferentes linhagens de bactérias, onde a nigericina apresentou maior atividades em menores concentrações. Visto a isso, prevê-se uma diminuição na adição de antibiótico, tornando o processo mais sustentável. Desta forma, o principal objetivo deste projeto PIPE é avaliar a possibilidade de introduzir no mercado um produto sustentável e de baixo custo para ser utilizado no controle de contaminantes do mosto de fermentação para a produção de etanol. Deste modo, a empresa MC DESINFECÇÃO INDUSTRIAL propõe um projeto, que conta com uma colaboração inédita com o Laboratório de Espectrometria de Massas Aplicada a Produtos Naturais (USP - Ribeirão Preto) e com a Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP de Araraquara, visando avaliar o desenvolvimento do potencial de aplicação do antibiótico nigericina para o controle microbiológico do processo de fermentação do etanol produzido pela actinobactéria EUCAL 26, isolado e produzido em

A química de produtos naturais de metabólitos secundários bioativos produzidos por micro-organismos foi no passado e continuam sendo nos dias de hoje, uma poderosa fonte de novos compostos com estruturas moleculares intrínsecas e potentes atividades biológicas. A química de produtos naturais moderna necessita de metodologias rápidas e eficientes para a identificação e caracterização estrutural de compostos bioativos, acelerando o árduo processo de isolamento dessas substancias. Neste sentido, a espectrometria de massas seqüencial aparece como a ferramenta analítica mais eficiente para acelerar o processo de identificação e desreplicação de metabólitos secundários em extratos brutos. O mecanismo de ionização por electrospray, desenvolvido por Fen e colaboradores, revolucionou o modo de introdução de íons em MS. A ionização por electrospray possibilitou o surgimento de outras técnicas de ionização, em especial a ionização ambiente com fonte de dessorção por electrospray (DESI), idealizada por Cooks e colaboradores. Na ionização por DESI os íons produzidos por uma fonte de electrospray são direcionados para a amostra contida em uma superfície. Consequentemente, as gotículas de solvente carregadas dessorvem os analitos da superfície e promovem a ionização, transferindo os íons para o analisador de massas. Nos últimos 5 anos, houve um desenvolvimento exponencial dessas novas fontes de ionização ambiente, devido principalmente a sua simplicidade de aplicação, rapidez e a possibilidade da realização de analise direta de amostras sem a necessidade de preparo prévio das mesmas. O desenvolvimento destas técnicas de ionização ambiente permite o acoplamento.

O estudo de corantes naturais obtidos por processo fermentativo de micro-organismos aparece como uma alternativa para a substituição de corantes sintéticos, os quais apresentam comprovados danos à saúde humana. Apesar de vários compostos coloridos produzidos por micro-organismos já terem sido descritos na literatura, poucos estudos sobre sua estabilidade e viabilidade para utilização industrial tem sido realizados. Neste sentido, o presente projeto tem o intuito de isolar e caracterizar os compostos coloridos produzidos por micro-organismos e estudar sua potencialidade na aplicação industrial. Também é objetivo de estudo avaliar a estabilidade deste compostos frente a condições adversas de temperatura, pH, oxidação e aeração e seus efeitos citotóxicos e mutagênicos. Os resultados preliminares obtidos em nosso grupo de pesquisa onde foram isolados dois corantes vermelhos da classe das antraquinonas, um deles com um rendimento excepcional de 3,0 g/L, confirma nossas expectativas de futuro para esta área tão promissora. Outro fato que nos enche de esperança foi a consulta formal da empresa Natura, sobre a possibilidade de aplicação destes corantes na produção de cosméticos em geral. Vale a pena ressaltar que há um grande interesse industrial nesta área e poucos grupos de pesquisa no Brasil tem explorado o potencial dos micro-organismos para a produção de corantes naturais. Sendo assim, este projeto contribuirá fundamentalmente para o desenvolvimento de fontes alternativas de corantes naturais, como também para a formação de não de obra capacitada, uma vez que o tema é multidisciplinar.

Os insetos são os organismos conhecidos de maior abundância, sendo responsáveis por mais da metade de toda a diversidade biológica conhecida. A riqueza de espécies e a diversidade biológica apresentada por este grupo de organismos é resultado de uma série de características próprias reunidas ao longo da evolução, mas a diversificação do modo de vida destes organismos foi extremamente influenciada pela sua associação a microrganismos simbiontes. Esses simbiontes permitiram a 1) utilização de fontes nutricionais inadequadas (via ementação nutricional) e de alimentos de baixa digestibilidade (celulose, pelos), 2) ciclagem de nitrogênio, 3) a degração de compostos secundários de defesa da planta hospedeira, além de 4) fornecerem proteção com a invasão de patógenos nocivos ou entomopatógenos. Os simbiontes podem estar associados a estruturas celulares específicas do hospedeiro, os chamados bacteriócitos, como podem habitar o lúmen do trato digestivo, células de outros tecidos do inseto ou estar associados ao tegumento do inseto. A diversidade de relações existentes nas interações insetos-simbiontes aponta para um sistema com elevada diversidade microbiana e para a existência de mecanismos de interação fundamentais ao entendimento de processos bioecológicos de insetos, como desenvolvimento, crescimento e reprodução, exploração hospedeira, utilização de substratos alimentares e proteção contra microrganismos invasores e parasitoides. Assim, dado o grande número de interações possíveis, a microbiota associada a insetos se apresenta como uma fonte praticamente inexplorada de biomoléculas com potencial biotecnológico, assim como indicado em pesquisas recentes por nós realizadas. Dessa forma, este projeto tem por objetivo determinar a diversidade da bacteriofauna simbionte associada a insetos de importância agrícola, assim estudar alguns aspectos ecológicos da interação inseto-simbionte e verificar o potencial dessas bactérias como fonte de biomoléculas para exploração no combate a insetos-pragas e patógenos, além de identificar enzimas/bactérias que possam ser utilizadas nos processos de biorremediação ou degradação da celulose para a produção de biocombustíveis.

Avanços recentes em instrumentação, principalmente nos modos de ionização e nos analisadores de massas tornaram o espectrômetro de massas um dos equipamentos mais versáteis para o desenvolvimento de métodos analíticos em ciências. A descoberta e desenvolvimento da fonte de ionização por electrospray (ESI) revolucionaram a espectrometria de massas permitindo a ionização de moléculas termo instáveis como, proteínas, carboidratos, complexos inorgânicos e compostos glicosilados dentre outros, impossíveis de serem analisados pelos modos de ionização por elétron. Esta proposta tem como principal objetivo a solicitação de um espectrômetro de massas com fonte de ionização por eletrospray para estruturar a central analítica existente no Departamento de Química da Faculdade de Filosofia Ciência e Letras de Ribeirão Preto da ¬Universidade de São Paulo, o qual não possui nenhum equipamento desta magnitude. Esta proposta conta com a participação de 29 pesquisadores de diferentes instituições e mais de 90 alunos de pós-graduação, que atuam em diferentes áreas do conhecimento como síntese orgânica e inorgânica, química de produtos naturais, ciências de materiais, caracterização de metabólitos secundários bioativos, degradação de fármacos e pesticidas, biotransformação de fármacos e cromatografia de afinidade e multidimensional. A versatilidade analítica do espectrômetro de massas solicitado deverá suprir as necessidades analíticas básicas apontadas pelos diferentes grupos de pesquisas, bem como propiciar uma rapidez no entendimento dos processos envolvidos, acelerando a pesquisa dos grupos envolvidos na proposta e de outros grupos que por ventura utilizarão das instalações da central analítica. Vale a pena ressaltar que a central analítica do Departamento de Química conta com toda a infraestrutura necessária para instalação e operacionalização imediata do espectrômetro de massas solicitado. Contando com uma sala de 35 m2, uma central de nitrogênio líquido, com um técnico de nível superior e principalmente com um professor especialista no desenvolvimento de métodos analíticos empregando a espectrometria de massas. Esses fatores garantem o pleno funcionamento e uma perfeita exploração de todo o potencial analítico propiciado. (AU)

Compostos produzidos por microrganismos constituem uma linha de pesquisa extremamente interessante para a química de produtos naturais. A diversidade farmacológica é bastante ampla podendo ser aplicada nas mais variadas áreas como farmacêuticas, alimentícia e agrícola. Os herbicidas derivados de microrganismos (micoherbicidas), especialmente os metabólitos secundários desses microrganismos, são novos tipos de herbicidas naturais para combater ervas daninhas e, têm chamado maior atenção de pesquisadores por serem fitotoxinas naturais que possuem um alvo específico além de apresentarem como uma poderosa fonte de novos compostos com estruturas relativamente simples. Esses bioherbicidas apresentam uma grande vantagem sobre os herbicidas sintéticos por serem biodegradáveis e de servirem como modelo para o desenvolvimento de novos herbicidas sintéticos menos agressivos ao meio ambiente. Apesar do grande potencial dos processos biotecnológicos de fermentação de microrganismos, pouco grupos de pesquisas tem direcionados seus esforços para o isolamento e identificação desses princípios ativos. Neste projeto serão utilizadas técnicas hifenadas CLAE/UV, CLAE/EM on-line, bem como técnicas espectroscópicas off-line UV, IV, EM e RMN de 13C e 1H, para descoberta de metabólitos secundários bioativos oriundos de processos de fermentação de actinobactérias, como a implementação de estratégias de screening, isolamento e identificação de estruturas bioativas de uma forma eficiente e rápida. Também será realizada a derreplicação de extratos brutos de microrganismos, a fim de acelerar o processo de purificação dos compostos.

Desenvolvimento de metodologias analitcas por LC-MS/MS para acelerar o processo de identificação de principios ativos produzidos por actinobacterias

Desenvolvimento da tecnica MIMS para o monitoramento de processo de biotransformação microbiana