Luciana Amaral Haddad.

O efeito combinatório da expressão de genes codificadores em eucariontes compreende etapas distintas. Dentre elas, a regulação da meia-vida do RNAm é um processo importante ao desenvolvimento do sistema nervoso central, incluindo a corticogênese cerebral. O splicing alternativo associado a mecanismos de controle de qualidade e quantidade do RNAm constitui uma forma dessa regulação. Falhas na corticogênese cerebral, incluindo sinaptogênese, podem levar a alterações clínicas como deficiência intelectual e transtornos do comportamento. A síndrome do X frágil e o complexo da esclerose tuberosa (TSC) podem cursar com deficiência intelectual devido a mutações de perda de função respectivamente nos genes FMR1 e TSC1 ou TSC2, envolvidos na corticogênese cerebral. Sob condições fisiológicas, os produtos da expressão desses genes têm sua quantidade finamente controlada por processos ainda não bem compreendidos. Este projeto de pesquisa tem o objetivo de analisar a autorregulação da expressão do gene FMR1 mediada por splicing alternativo do seu transcrito primário. Visa também ao entendimento da regulação do RNAm de TSC1 e TSC2 pela proteína ligante de RNA unkempt, com ação a jusante a mTOR, um regulador central de vários processos celulares. A estratégia experimental inclui análises globais de transcritos do FMR1 e isoformas de FMRP, caracterização de novas formas de splicing alternativo e a relação entre transcritos e fatores em trans. Pretendemos também avaliar algumas proteínas do interactoma da isoforma 1 de FMRP. Esta proposta tem potencial para obter novas informações que ajudarão a compreender aspectos importantes da regulação da expressão desses genes.

A ribonucleoproteína de mensageiro do X frágil (FMRP) atua em vários tipos celulares, notadamente em progenitores neuro-gliais e terminais neuronais pré- e pós-sinápticos. Seu papel mais bem estabelecido é como repressora traducional de RNAm dendríticos, cuja tradução é ativada em resposta ao estímulo sináptico, sobretudo glutamatérgico. Por outro lado, a FMRP vem sendo reconhecida como reguladora de outras funções mediadas por RNA. Diferentes isoformas foram previstas para a FMRP, como produtos de splicing alternativo ou processamento proteolítico limitado, e variações de sua migração em gel foram bem documentadas. Contudo, poucos papéis funcionais foram demonstrados experimentalmente para as isoformas da FMRP. A FMRP relaciona-se também à regulação do transcrito expresso pelo próprio gene FMR1. Temos interesse em conhecer se há regulação diferencial de transcritos variáveis do FMR1 pelas isoformas da FMRP e suas proteínas parceiras. Este projeto tem como objetivo verificar funções não canônicas de transcritos e isoformas da FMRP, dependentes ou não de RNA.

A identificação de proteínas que se associam a conexina-26 (Cx26) fornecem informações sobre sua distribuição subcelular e funções. Neste projeto, empregamos duas abordagens distintas para o entendimento do interactoma da Cx26. Identificaram-se por precipitação por afinidade e pelo ensaio do duplo híbrido de levedura em membrana (baseado no sistema da 'split ubiquitin') 58 proteínas não redundantes na rede de interação proteíca de Cx26, distribuídas sobretudo a duas vias subcelulares, principais: associação entre junções intercelulares e o citoesqueleto, e mitocôndrias.

A lesão traumática da medula espinal apresenta incidência crescente e massivo impacto na vida de seus portadores. O tratamento atual disponível oferece pouco efeito na regeneração dos danos provocados. Cada vez mais, torna-se claro que não haverá uma única terapia que, sozinha, consiga reparar a condução nervosa na medula espinal. O laboratório de estudos do trauma raquimedular e nervos (LETRAN) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo tem larga experiência com o modelo experimental de lesão contusiva moderada da medula espinal de ratos adultos, de forma reprodutiva. Em parceria com nosso grupo de pesquisa, terapia com células-tronco multipotentes do encéfalo de ratos neonatos, na forma de neuroesferas não diferenciadas em Matrigel, melhorou e antecipou significativamente a resposta motora dos animais. Neste projeto de pesquisa, utilizamos este modelo experimental consagrado de lesão traumática aguda em ratos adultos para estudar a regeneração biológica e funcional do sistema nervoso central após transplante de neuroesferas não diferenciadas oriundas de outras fontes biológicas.

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno sistêmico, com expressividade variável e herança autossômica dominante, causado por mutações nos genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2, que codificam para as proteínas hamartina e tuberina, respectivamente. Estas proteínas interagem fisicamente formando um complexo citosólico, que inibe o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), através da ação ativadora de GTPase da tuberina sobre a pequena GTPase rheb. Desta forma, mutações em TSC1 ou TSC2 que interfiram na formação do dímero proteico hamartina-tuberina causam TSC. Supõe-se que níveis proteicos apropriados de hamartina e tuberina sejam necessários para a homeostase do complexo que regula mTOR. O RNAm de TSC1 tem uma longa região 3' não traduzida (3'-UTR) que se estabelece como plataforma para interação dom RNAs não codificadores e proteínas, regulando a estabilidade e tradução. Neste projeto, avaliamos o transcriptoma de células nocauteadas para TSC1 e/ou TSC2 e identificamos classes gênicas diferencialmente expressas Avaliamos fatores em trans específicos na regulação do transcrito de TSC1.

Mutações de perda de função no gene FMR1 causam a síndrome do X frágil, a etiologia hereditária mais comum de deficiência intelectual entre homens. O FMR1 codifica para FMRP, uma proteína ligante de RNA, importante para o controle sináptico e neurogênese. A corticogênese cerebral é diferencialmente sensível à quantidade de RNAm e proteína expressos pelo FMR1. Mecanismos pós-transcricionais distintos regulam a estabilidade do transcrito do FMR1. Uma vez que o pré-RNAm do FMR1 pode sofrer splicing alternativo, transcritos variáveis fora de fase traducional poderiam potencialmente autorregular o seu RNAm. Mostramos anteriormente que o RNAm total de Fmr1 e as isoformas mais longas da Fmrp têm elevadas quantidades no prosencéfalo do rato entre os dias do desenvolvimento E11-E18 e P2-P7 e seus níveis mais baixos entre E19 e E20 e a partir de P14. O éxon 14 do Fmr1 pode sofrer exclusão alternativa deslocando a fase traducional, e o éxon 15 tem três sítios receptores de splicing. Detectamos anteriormente a exclusão significativa do éxon 14 em E17-E20 no prosencéfalo de rato e redução das mensagens resultantes contendo junções entre os éxons 13 e 15. Neste projeto, avaliamos a via da proteína UPF1sobre a degradação do RNAm do FMR1 com junções entre os éxons 13 e 15 e a regulação global da quantidade de RNAm maduro do FMR1. Não se observaram evidências da via de UPF1 (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) sobre a estabilidade de transcritos sem o éxon 14, mas um aumento da estabilidade de transcritos que utilizam o sítio 15A de splicing do FMR1 quando UPF1 foi reduzido na linhagem celular. Esses dados sugeriram um papel ativador de UPF1 sobre a estabilidade de transcritos específicos de FMR1.

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é importante causa genética de epilepsia refratária, deficiência intelectual e espectro autista. O quadro clínico está associado ao desenvolvimento de hamártias e hamartomas em diversos tecidos, sobretudo no cérebro, rins, coração, pele e pulmões. Mutações nos genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2, são responsáveis pela manifestação do TSC que codificam para as proteínas hamartina e tuberina, respectivamente. Estas proteínas interagem fisicamente formando um complexo citosólico, que inibe o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), através da ação ativadora de GTPase da tuberina sobre a pequena GTPase Rheb. Embora o diagnóstico do TSC seja essencialmente clínico, os testes moleculares são úteis ao aconselhamento genético, em estudos de associação fenótipo-genotípica e clínicos para novos fármacos no tratamento da doença, além da caracterização molecular de mecanismos patogenéticos da formação dos hamartomas e funcional dos produtos gênicos. Neste projeto, identificamos alterações patogênicas em TSC1 ou TSC2 no DNA de 104 dentre 116 pacientes com diagnóstico clínico definitivo de TSC.

A ribonucleoproteína de mensageiro do X Frágil (FMRP), produto da expressão do gene FMR1, tem habilidade para ligação a RNA e expressão significativa no sistema nervoso central (SNC), principalmente no córtex cerebral, hipocampo e cerebelo. Os transcritos do FMR1 sofrem splicing alternativo resultando em até 20 isoformas possíveis e não redundantes da FMRP. O segundo domínio KH (KH-2) da FMRP foi implicado na ligação da proteína a ribossomos. Sua alça variável é a mais longa já identificada entre proteínas humanas com domínios KH. A expressão do éxon 12 do FMR1 pode ainda acrescentar 21 resíduos de aminoácidos, em fase, a esta alça. Demonstramos anteriormente que a expressão do éxon 12 em transcritos do Fmr1 de rato é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal. Desenvolvemos um anticorpo (3460) que detecta o segmento codificado pelo éxon 12 em isoformas endógenas da FMRP (FMRP+12ISO). Análises com o 3460 indicaram que estas isoformas têm, no córtex cerebral frontal, um pico de expressão que precede a maturação sináptica. Desconhece-se, entretanto, a relevância funcional e o mecanismo dessa regulação nesse segmento do SNC nesse período do desenvolvimento. É possível que os complexos ribonucleoprotéicos, contendo as FMRP+12ISO, permitam novas interações com proteínas ou RNA através da longa alça variável do domínio KH-2 da FMRP, trazendo um ganho funcional à proteína. Além disso, buscando entender como essa forma de splicing do Fmr1 é regulada positivamente, desenvolvemos um mini-gene com o segmento genômico parcial do Fmr1. 
Neste projeto, analisamos (i) a composição dos complexos moleculares contendo as FMRP+12ISO no córtex cerebral frontal, através de ensaios de co-imunoprecipitação e filtração em gel e identificação protéica por espectrometria de massas; e (ii) a distribuição das FMRP+12ISO em fases mais precoces do desenvolvimento embrionário do cérebro.

A síndrome do cromossomo X frágil é a causa hereditária mais frequente de deficiência intelectual entre homens, ocorrendo por mutações que abolem a expressão do gene de ribonucleoproteína d emensageiro do X frágil (FMR1). O gene FMR1 codifica para a ribonucleoproteína de mensageiro do X frágil (FMRP), que inibe seletivamente a tradução de RNAm. O gene FMR1 sofre splicing alternativo dos éxons 12, 14, 15 e 17, produzindo até vinte isoformas diferentes com funções reguladoras do desenvolvimento de espinhas dendríticas, relacionado à função sináptica, em neurônios glutamatérgicos. O splicing alternativo é um importante mecanismo gerador de diversidade funcional gênica, podendo ser regulado por sequências curtas, intrônicas ou exônicas. O objetivo deste projeto foi o estudo da diversidade funcional do gene FMR1 e compreendeu (i) a identificação de elementos regulatórios do splicing alternativo dos éxons 12 e 14 do FMR1 e (ii) a análise da expressão e trânsito neuronal, subcelular da FMRP. Demonstrou-se que a expressão do éxon 12 em transcritos do Fmr1 de rato é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal. Foram gerados anticorpos que identificam isoformas específicas da FMRP.

A síndrome do X frágil é a causa hereditária mais frequente de deficiência intelectual, sendo causada pela inibição da expressão do gene FMR1 (do inglês, Fragile Messenger Ribonucleoprotein 1), em virtude de grandes expansões de trinucleotídeos pCCG, normalmente polimórficos, na sua região 5', e metilação de suas citosinas. O produto da expressão do gene FMR1, a proteína FMRP (do inglês, Fragile Messenger Ribonucleoprotein 1), tem um peso molecular, observado em géis de poliacrilamida desnaturantes, entre 70 e 80 kDa, devido a diferentes isoformas oriundas do splicing alternativo de vários exons. A diversidade de expressão dos transcritos do gene FMR1 foi estudada ao nível do RNAm, mas não se sabe ainda qual a função de distintas isoformas da FMRP em diferentes tecidos e tipos celulares. 
A FMRP circula entre o núcleo e o citoplasma celular e faz parte de um complexo de proteínas que se ligam, de maneira seletiva, ao RNAm. Em neurônios, entretanto, ela apresenta-se predominantemente no citoplasma e nos terminais dendríticos. Camundongos knockout, sem expressão do gene FMR1, apresentam anormalidades das espinhos dendríticos, sugerindo que a FMRP deva ter uma função na maturação e/ou eliminação sináptica. Em condições fisiológicas, estrógenos, AMP cíclico (AMPc) e fatores de crescimento como o BDNF (do inglês, Brain-Derived Neurotrophic Factor) e a neurotrofina 3 (NT-3) são fatores envolvidos na regulação morfológica das espinhas sinápticas. Recentemente, sugeriu-se que a FMRP tenha uma função, específica e seletiva, na inibição da tradução de algumas proteínas. A identificação das proteínas cuja expressão seja inibida pela FMRP é de fundamental importância. Neste projeto, testou-se a ação de BDNF sobre espinhos dendríticos em cultura primária de neurônio cortical de ratos. Observou-se uma redução do número de espinhos dendríticos em neurônios tratados in vitro por 24 horas com BDNF, acompanhado de um enriquecimento de FMRP no soma neuronal.