Luiz Fernando Onuchic.

A matriz extracelular (MEC) difere substancialmente entre os órgãos devido a variações complexas necessárias a suas estruturas e funções específicas. A MEC modula o comportamento celular e regula interações célula-célula no plano fisiológico, processos amplamente dependentes da modulação de vias de sinalização celular. Perturbações desses mecanismos podem levar a doença. Neste projeto propomos decodificar a composição da MEC, suas interações com diferentes componentes celulares e as vias de sinalização em condições homeostáticas e patológicas de três órgãos que compartilham células individuais com semelhança biológica: cérebro, glândula adrenal e rim. Nossos objetivos incluem: 1) decodificar a composição da MEC na saúde e na doença por análise proteômica, 2) estudar as relações entre a MEC e os componentes celulares, no que diz respeito às vias de sinalização, por abordagem transcriptômica de célula única, 3) avaliar o impacto de alterações da MEC em modelos experimentais 2D, 3D e animal, e 4) identificar novas possibilidades terapêuticas direcionadas a componentes da MEC e vias de sinalização alteradas, por meio da construção de um modelo organotípico 3D em uma plataforma microfluídica para triagem de drogas e da geração de dados estratégicos de ômicas inovadoras. Esperamos identificar diferenças e semelhanças entre a composição da MEC entre humanos e animais experimentais, que permitirão refinar a validade dos modelos animais de laboratório para avaliação de doenças humanas. Esperamos também determinar os principais componentes da MEC com impacto sobre o fenótipo e vias de sinalização celular na saúde e na doença. Espera-se que o uso de modelos organotípicos 3D, incluindo as características desvendadas da MEC, mimetize de perto os órgãos humanos e reduza o número de experimentos com animais em ensaios pré-clínicos.

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) constitui-se na enfermidade humana monogênica com risco de óbito mais comum, com prevalência estimada de 1:1000. Esta doença é essencialmente causada por mutação no gene PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1) ou no gene PKD2. A maior parte dos casos decorre de mutações em PKD1. Embora o fenótipo renal predomine, havendo necessidade de terapia renal substitutiva em 70% dos pacientes até os 70 anos de idade, o envolvimento cardiovascular se inicia precocemente e consiste na principal causa de mortalidade. A DRPAD associa-se a uma maior massa de ventrículo esquerdo e desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada idiopática, porém até recentemente a patogênese deste fenótipo era muito pouco compreendida. Um estudo capital e recente de nosso grupo, entretanto, revelou que camundongos haploinsuficientes para Pkd1, não cisticos e normotensos, apresentaram disfunção sistólica e redução da deformação miocárdica, enquanto camundongos císticos hipertensos deficientes em Pkd1 apresentaram não apenas essas anormalidades, como também disfunção diastólica. Esses resultados apoiam fortemente um papel primário da deficiência de PKD1 na disfunção cardíaca associada à DRPAD, enquanto sugerem que a elevação da pressão arterial possa piorar tal fenótipo com a idade. Em paralelo, estudos realizados nos últimos anos mostraram que alterações celulares metabólicas são centrais na patogênese da doença renal na DRPAD, incluindo consumo aumentado de glicose associado preferencialmente a glicólise aeróbica e alterações da beta-oxidação de ácidos graxos e fosforilação oxidativa. Tais achados se acompanharam de anormalidades mitocondriais em células renais de revestimento cístico. Nesse cenário, formulamos a hipótese de que os cardiomiócitos também possam apresentar alterações metabólicas relevantes na DRPAD, contribuindo para a disfunção cardíaca. Neste projeto, portanto, investigaremos as bases metabólicas celulares potenciais da patogênese dessa disfunção. Para tanto, avaliaremos parâmetros representativos do metabolismo energético cardíaco de diferentes naturezas em um modelo de camundongo homozigoto para um alelo hipomórfico de Pkd1 e severamente cístico, também com disfunção sistólica, tendo animais selvagens como controles. Nossos objetivos específicos incluirão: 1) determinação da razão peso cardíaco/peso corpóreo; 2) mensuração do tamanho de cardiomiócitos; 3) avaliação do perfil de expressão de proteínas potencialmente envolvidas na disfunção metabólica cardíaca associada à DRPAD; 4) análise do perfil de expressão de proteínas potencialmente envolvidas na ciclagem anormal de cálcio no cardiomiócito; 5) avaliação da densidade volumétrica citoplasmática de mitocôndrias em tecido cardíaco; 6) realização de análises morfométricas de mitocôndrias em coração; 7) avaliação do perfil de expressão de proteínas envolvidas em fusão e fissão mitocondrial em tecido cardíaco; 8) realização de ensaio semiquantitativo do número de cópias de DNA mitocondrial normalizado pelo DNA nuclear em tecido cardíaco; 9) avaliação da taxa de consumo de oxigênio de cardiomiócitos frente a diferentes substratos e desafios; e 10) análise do perfil metabolômico e lipidômico de cardiomiócitos. A depender dos resultados, nossos objetivos se estenderão à avaliação do potencial terapêutico de drogas capazes de modular o metabolismo celular do cardiomiócito sobre o fenótipo cardíaco desses animais.

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é uma das doenças hereditárias humanas mais comuns, apresentando uma prevalência populacional de 1/400-1000. Esta enfermidade é causada por mutação em um de dois genes: PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1) ou PKD2. A maior parte dos casos (85%) decorre de mutações em PKD1, enquanto mutações em PKD2 respondem por 15% dos mesmos. A DRPAD manifesta-se geralmente na idade adulta, caracterizando-se pelo desenvolvimento bilateral de múltiplos cistos renais. Cerca da metade dos pacientes evoluem para doença renal crônica terminal (DRCt) antes do final da sexta década de vida. Segundo o modelo knudsoniano de dois eventos proposto para a formação cística na DRPAD, a mutação germinativa consiste no primeiro evento, enquanto uma mutação somática no alelo previamente normal representa o segundo golpe. Estudos conduzidos nos últimos anos, contudo, sugerem a necessidade de um terceiro evento para o desenvolvimento rápido e amplo de cistos em rins maduros de camundongos, observação não verificada para o rim em desenvolvimento. Vale notar que o insulto renal por isquemia/reperfusão (IR) pode se comportar como este evento adicional. Entre os fenótipos extra-renais associados à DRPAD, que caracterizam sua natureza sistêmica, destaca-se o cardiovascular, incluindo hipertensão arterial e miocardiopatia. O tabagismo afeta negativamente a função renal, particularmente em indivíduos idosos, e o fenótipo cardiovascular. A fumaça do cigarro possui não apenas várias substâncias tóxicas, muitas das quais cancerígenas, como também a nicotina, associada a aumento de risco de evolução para insuficiência renal crônica (IRC) em nefropatas. Mostrou-se, também, que o tabagismo pode favorecer a deterioração da função renal em indivíduos do sexo masculino com DRPAD. Entre as propriedades celulares da policistina-1, produto do gene PKD1, destacam-se a redução da proliferação e apoptose celular, assim como sua ação pró-diferenciação celular. Além disso, a doença renal da DRPAD se associa a estresse oxidativo, inflamação e fibrose. Substâncias presentes no cigarro, por sua vez, apresentam efeitos potencialmente mutagênicos, proliferativos, inflamatórios, indutores de desbalanço redox, anti-apoptóticos e hemodinâmicos renais adversos, estes possivelmente capazes de limitar o fluxo sanguíneo a áreas específicas do órgão. Nesse cenário, não se sabe se os efeitos adversos do tabagismo sobre a progressão da DRPAD se devem a ações específicas nesta enfermidade ou comuns à evolução das várias nefropatias. Também não se conhece se o tabagismo afeta o fenótipo cardíaco associado a esta enfermidade. Para responder essas questões, utilizaremos um modelo animal cístico ortólogo e fenotipicamente semelhante à DRPAD humana, o camundongo Pkd1cond/cond:Nestincre, expondo-o ao tabagismo desde sua concepção. Os efeitos do tabaco sobre a progressão da doença serão avaliados na idade de 16-18 semanas, comparando-os a animais císticos controle não fumantes. Tais análises incluirão: 1) determinações bioquímicas para análises funcionais renais; 2) quantificação dos volumes renais e císticos; 3) análise funcional cardíaca; 4) avaliação de apoptose, inflamação e fibrose em tecido renal e cardíaco; 5) análise de proliferação celular e do metabolismo redox renal; e 6) avaliação da sobrevida dos animais.

Conclusão da Infraestrutura do Centro de Medicina Celular e Regenerativa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina USP

Observação: A Profa. Irene de Lordes Noronha também é coordenadora do projeto.
 
Dado o enorme potencial da terapia celular e a falta no nosso meio de centros estruturados para esta finalidade, é imperativo que uma Universidade de excelência como a Universidade de São Paulo tenha uma infraestrutura específica e robusta para esta ação clínica de vanguarda. Este é o objetivo da presente proposta. Os grupos de pesquisa, a estrutura física, os equipamentos fundamentais e os projetos atuais que amparam o ?Centro de Medicina Celular e Regenerativa do HC-FMUSP? garantem a qualidade e a amplitude de operação esperadas desta iniciativa. Procura-se, com o projeto ora submetido, concluir a infraestrutura de instalação e equipamentos necessária à operação regular e ampliação das ações clínicas do Centro de Medicina Celular e Regenerativa do HC-FMUSP. Tal plano é fundamental para a implantação desta modalidade terapêutica em nosso meio, para a evolução da ciência na área e para que a USP assuma a liderança na área.
A tradução do conhecimento acumulado nos últimos anos para a aplicação clínica deve ser desenvolvida, naturalmente, em ambiente hospitalar. Por esse motivo, o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina USP foi o local eleito para o estabelecimento dessa ação. Estrategicamente, a infraestrutura inicial foi construída em área anexa ao Centro Cirúrgico, facilitando o trânsito de órgãos, tecidos e células do doador e do receptor em condições estéreis. No ?Centro de Medicina Celular e Regenerativa do HC-FMUSP? serão desenvolvidas todas as etapas, incluindo o primeiro nível de isolamento e caracterização de células humanas de diferentes tecidos e órgãos, e preparação de materiais clínicos, com os pertinentes controles de qualidade. As salas de processamento caracterizam-se por ambientes de sala limpa classe 100.000 e fluxo laminar classe 100, além de rigorosos protocolos de análise microbiológica, para garantir os níveis apropriados de esterilização das amostras celulares.
Todos os procedimentos realizados no Centro de Medicina Celular e Regenerativa devem respeitar e estar de acordo com as boas práticas de laboratório (GLP - Good Laboratory Practices) e boas práticas de produção (GMP - Good Manufacturing Practices). O respeito a esses marcos regulatórios sobre os produtos celulares gerados no Centro irão garantir a segurança, pureza e qualidade dos produtos gerados, bem como a viabilidade de seu emprego na aplicação clínica. Finalmente, a discussão, elaboração e execução de ensaios clínicos envolvendo a Terapia Celular fazem parte desta proposta, de modo a esclarecer o impacto futuro da infraestrutura solicitada. De fato, tais projetos explicitam os resultados esperados a serem potencialmente viabilizados pelos recursos solicitados, e demonstram o potencial de formação de pessoal para pesquisa (técnicos especializados, alunos de pós-graduação e pós-doutorados) e de atração de novos talentos que a conclusão da infraestrutura operacional deverá apoiar. 
As ações de intervenção clínica do centro dependem, contudo, do suporte de médio e longo prazo de grupos de pesquisadores e projetos voltados aos aspectos biológicos básicos das CT. Esta realidade encontra-se, naturalmente, contemplada nesta proposta.

Projeto temático
Recent studies and accomplishments on monogenic diseases have served not only to alleviate the dilemma of patients with these disorders, but also have yielded valuable information on biological processes relevant to other more common conditions. However, few centers are prepared to diagnose, follow up, and investigate monogenic developmental diseases in Brazil, the largest Latin American country. The aims of our proposal are to establish large cohorts of phenotypically well-characterized patients and promote long-term follow-ups, as well as to develop a center in which new molecular techniques will allow the generation of massive, faster, more accurate and integrated genetic data, leading to the discovery of novel disease-associated genes and genetic modifiers. Moreover, this strategy will expand and optimize cost effectiveness and shorten the time for molecular diagnosis, promoting dissemination and broadening of molecular-genetic knowledge and diagnosis in medical practice. In addition, using sophisticated in vitro and in vivo genetic-based models, we plan to develop robust platforms for the elucidation of monogenic disease pathogenesis and for the identification of potentially novel therapeutic interventions.

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) constitui-se na doença renal monogênica mais comum em humanos, acometendo 1 em cada 400 a 1.000 indivíduos e respondendo por 4,4 a 10% dos casos de doença renal crônica terminal. Esta enfermidade é causada por mutações em um de dois genes, PKD1 (polycystic kidney disease 1) ou PKD2, sendo que ~85% dos casos devem-se a mutações em PKD1. A DRPAD felina, de forma similar, consiste na moléstia hereditária mais prevalente em gatos domésticos, estando presente em 35 a 60% dos gatos da raça Persa. Note-se que a inexistência de dados epidemiológicos referentes à DRPAD felina em nosso país torna seu controle um desafio à medicina veterinária no Brasil. Seguindo a natureza sistêmica da DRPAD humana, a DRPAD felina caracteriza-se pelo desenvolvimento de múltiplos cistos em córtex e medula renais e, ocasionalmente, em fígado e pâncreas. Na raça Persa, a grande maior parte dos casos se deve à substituição C>A na posição 138 do éxon 29 do gene ortólogo a PKD1 humano, também denominado PKD1. Esta mutação associa-se à criação de um códon de parada prematura. Diferentes estudos têm mostrado correlação entre essa mutação e achados ultrassonográficos consistentes com DRPAD. Apesar desses avanços, a medicina veterinária ainda enfrenta três problemas maiores quanto ao estabelecimento do diagnóstico dessa enfermidade em felinos: 1) O acesso ao teste molecular diagnóstico é muito precário na prática veterinária; 2) Em uma menor parte de gatos Persa e mestiços com fenótipo presuntivo da doença, a mutação C>A na posição 138 do éxon 29 não é identificada, sugerindo que nesses casos a DRPAD se deva a outras mutações; e 3) O curso temporal do fenótipo cístico renal não é conhecido/caracterizado o suficiente em gatos comprovadamente portadores da doença, o que impede a aplicação segura da técnica ultrassonográfica com propósito diagnóstico em animais relativamente jovens. Nesse cenário, nosso estudo tem como objetivos específicos: 1) Cara

Observação: Os Profs. Luiz Fernando Onuchic e Ana Cláudia Latronico Xavier também são coordenadores deste projeto.
Dentro da perspectiva Institucional, estabelecida pela Diretoria da FMUSP, pela Comissão de Pesquisa e pelos Laboratórios de Investigação Médica (LIMs), foi criado o Programa Rede de Equipamentos Multiusuários (PREMiUM) com o objetivo de estimular a pesquisa e inovação do Sistema FMUSP/HC e a formação de redes internas de expertise clínico, científico e técnico. Pretende-se, com esta realidade, tornar acessíveis diversos núcleos de equipamentos com tecnologia de ponta para diversos tipos de Pesquisa Experimental e Clínica.

Para cumprir esses objetivos, é necessário que o Sistema HC-FMUSP recupere sua capacidade de análises genéticas, hoje centrada no estudo individual de genes, de modo a ingressar no que se denomina análises em high-throughput ou sequenciamento em larga escala.

O projeto foi estruturado compondo uma verdadeira rede interna de expertises clínicos - centrados em perguntas que visem a compreensão das relações sinérgicas entre genes na gênese de doenças complexas (câncer de ovário, mama, bexiga e testículos, infertilidade, mitocondriopatias, cardiomiopatias, transtornos do humor e do crescimento) - e expertise técnico - centrado na operacionalização das plataformas de última geração, criação de bancos de dados e desenvolvimento de softwares de análise customizados.

A rede interna contempla grupos de diversos departamentos e divisões clínicas, com objetivos convergentes na utilização da plataforma de sequenciamento em larga escala, incluindo:

- Câncer e infertilidade masculina: transcriptoma e micro-RNAs testiculares.
- Diagnóstico precoce do câncer de ovário e de endométrio por marcadores moleculares.
- Determinação de mutações somáticas e germinativas em pacientes jovens com câncer de mama.
- Análise de genótipo de suscetibilidade ao desenvolvimento do câncer de bexiga.
- Mitocondriopatias e miopatias metabólicas e inflamatórias
- Identificações de alterações genéticas em miocardiopatias e estudo de transcriptoma em cardiopatias congên

Nas duas últimas décadas, diversos grupos de excelência em biologia/genética molecular e celular se desenvolveram na Universidade de São Paulo. Apesar de bem sucedidos, uma análise mais detalhada revela que suas ações científicas poderiam ser ampliadas e otimizadas. Com este enfoque, estamos propondo a constituição do Núcleo de Estudos e Terapia Celular e Molecular (NETCEM), voltado à agregação de grupos com competência estabelecida nas áreas celular e/ou molecular, pertencentes à Faculdade de Medicina (FM-USP), Instituto de Química (IQ-USP), Instituto de Ciências Biomédicas (ICB-USP), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ-USP), e Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina (HC-FMUSP). Nossa proposta direciona-se à integração entre as ciências básica e clínica, com claro enfoque translacional. As estruturas de apoio a este núcleo compreendem os laboratórios de pesquisa dos 23 investigadores principais, o prédio em fase final de construção do Núcleo de Terapia Celular e Molecular (NUCEL), a Unidade de Terapia Celular e Engenharia de Tecidos (UTCET) do HC-FMUSP, o Centro de Estudos Pré-Clínicos (CEPC) da FMVZ-USP e o Centro de Bioterismo da FMUSP (CB-FMUSP).

A possibilidade atual de integrar informações advindas da caracterização de modelos animais geneticamente manipulados, estudos envolvendo a tecnologia de células tronco (CT), resultados gerados por sequenciamento de DNA em larga escala e caracterização de fenótipos clínicos, laboratoriais e de imagem proporcionam, hoje, um ambiente ímpar de caracterização e entendimento progressivo da patogênese de doenças humanas. Nos próximos anos, a estratégia de sequenciamento de DNA em larga escala, incluindo análises de exoma ou genoma completos, deverá desempenhar um papel crucial nesse processo. Nesse contexto, tal abordagem receberá atenção especial no NETCEM. Com a esperada compreensão gradual das vias moleculares que regem a diferenciação de CTs, antecipamos também o surgimento de novas alternativas

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é a doença renal monogênica mais comum, com uma prevalência estimada de 1:400-1000. Aproximadamente a metade dos pacientes evoluem para doença renal crônica terminal até o final da sexta década de vida. A doença decorre de mutações em um de dois genes, PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1) ou PKD2, sendo que 85% dos casos devem-se a mutações em PKD1. Embora apresente uma transmissão genética dominante, várias evidências apóiam um modelo de dois eventos para a formação cística na DRPAD, incluindo a mutação germinativa como primeiro golpe e uma mutação somática no alelo previamente normal como o segundo evento. Estudos mais recentes, por sua vez, sugerem que um terceiro golpe seja necessário para a formação rápida de cistos no rim adulto. A patogênese das manifestações não císticas da DRPAD, contudo, ainda não é bem compreendida. Nesse contexto, as relações entre déficit de concentração renal, disfunções tubulares, declínio da taxa de filtração glomerular (TFG), hipertensão arterial sistêmica e disfunção do sistema óxido nítrico (NO), fenótipos associados à DRPAD, e a haploinsuficiência de Pkd1 e/ou o fenótipo cístico renal ainda são incertas. Neste projeto estudaremos as bases moleculares e celulares dessas alterações utilizando dois modelos animais de deficiência de Pkd1: uma linhagem de camundongos haploinsuficientes para Pkd1 (Pkd1+/-), sem desenvolvimento de formações císticas, e um modelo de camundongo também geneticamente modificado que reproduz fenotipicamente a doença humana, com cistos renais difusos bilateralmente, lesões conseqüentes ao mecanismo de dois (ou três) golpes (Pkd1cond/cond:Balcre). Nossos objetivos específicos incluem, portanto: 1) Analisar a capacidade de concentração renal e o curso da TFG em camundongos Pkd1cond/cond e Pkd1cond/cond:Balcre e em camundongos Pkd1+/+ e Pkd1+/- nas idades de 10-13 semanas e 18-21 semanas; 2) Avaliar a reabsorção tubular de Na+ e K+ nesses animais, nas faixas

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) constitui-se na doença renal monogênica mais comum, acometendo 1 em cada 400 a 1.000 indivíduos e consistindo numa importante causa de doença renal crônica terminal. A doença é causada por mutações em um de dois genes, PKD1 (polycystic kidney disease 1) ou PKD2, sendo que ~85% dos casos devem-se a mutações em PKD1. Várias evidências sustentam um modelo de dois golpes para a formação cística focal na DRPAD, onde a mutação de linhagem germinativa configura-se no primeiro evento e uma mutação somática no alelo previamente normal no segundo golpe. Estudos recentes, contudo, sugerem fortemente a necessidade de um terceiro golpe para a formação rápida de cistos no rim adulto. Insultos por isquemia/reperfusão (IR), por sua vez, constituem-se numa causa freqüente de lesão renal aguda, incluindo pacientes com DRPAD. Em um artigo recente (Bastos et al, 2009), mostramos que camundongos haploinsuficientes para Pkd1, o gene ortólogo a PKD1 neste animal, apresentam lesão renal mais severa que camundongos selvagens e formação de microcistos quando submetidos a IR renal. Este estudo sugere que a capacidade de regeneração renal pós-IR possa estar prejudicada em camundongos Pkd1+/- e em pacientes com DRPAD. Sugere, ainda, que a lesão por IR possa atuar como um golpe adicional no rim maduro haploinsuficiente, contribuindo para a aceleração da cistogênese e da doença renal neste modelo animal e, provavelmente, em pacientes com DRPAD. Neste projeto investigaremos essas questões utilizando uma estratégia baseada em administração de células tronco mesenquimais (CTMs) exógenas com e sem expressão de Pkd1, em camundongos selvagens e deficientes em Pkd1 submetidos a insulto por IR. Para tanto, nossos objetivos específicos incluirão: 1) Analisar e comparar as lesões por IR em camundongos Pkd1+/+ submetidos à administração de CTMs Pkd1+/+ ou Pkd1-/-; 2) Caracterizar e comparar as lesões por IR em camundongos Pkd1+/- e Pkd1+/+ submetidos

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é a doença humana monogênica potencialmente letal mais prevalente, constituindo-se numa das principais causas de doença renal crônica terminal (DRCT). Esta enfermidade é causada por mutações em um de dois genes, PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1) ou PKD2, sendo que ~85% dos casos devem-se a mutações em PKD1. Várias evidências apóiam um modelo de dois eventos para a formação focal de cistos na DRPAD, incluindo a mutação germinativa como o primeiro golpe e uma mutação somática no alelo previamente normal como o segundo evento. Estudos recentes, por sua vez, sugerem a necessidade de um terceiro golpe para a formação rápida de cistos no rim maduro. A lesão induzida por isquemia/reperfusão (IR) é uma causa freqüente de lesão renal aguda, decorrendo de anormalidades hemodinâmicas, celulares e moleculares. Recentemente demonstramos que camundongos haploinsuficientes para Pkd1, o gene ortólogo a PKD1 neste animal, apresentam lesão renal mais severa que animais selvagens e formação de microcistos quando submetidos a insulto por IR. É provável, portanto, que a capacidade de regeneração renal pós-isquemia esteja prejudicada em camundongos Pkd1+/- e em pacientes com DRPAD e que este tipo de insulto possa contribuir para a aceleração da doença renal. Além disso, é fundamental entender o papel da isquemia como um terceiro golpe potencial, possivelmente envolvido na cistogênese tardia de animais deficientes em policistina-1 e em pacientes com DRPAD. Neste projeto, pretendemos analisar essas questões por meio de uma abordagem baseada em administração de células tronco hematopoiéticas (CTHs) com e sem expressão de Pkd1, em camundongos submetidos a insulto por IR. Para tanto, utilizaremos dois modelos animais geneticamente modificados: um modelo não cístico de haploinsuficiência (Pkd1+/-), e camundongos com alelos nulos condicionais de Pkd1, um modelo que reproduz fenotipicamente a doença humana (Pkd1cond/cond:Balcre). Nesse co

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é a doença humana monogênica potencialmente letal mais comum, com uma prevalência populacional de 1:400-1000. Seu impacto médico, social e econômico é muito grande, uma vez que apenas a metade dos pacientes atingem os 58 anos de idade sem evoluir para doença renal crônica terminal. A doença é causada por mutações em um de dois genes, PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1) ou PKD2, sendo que 85% dos casos devem-se a mutações em PKD1. Apesar de apresentar uma transmissão genética dominante, várias evidências apóiam um modelo de dois eventos para a formação cística na DRPAD, incluindo a mutação germinativa como primeiro golpe e uma mutação somática no alelo previamente normal como o segundo evento. Estudos recentes, por sua vez, sugerem que um terceiro golpe seja necessário para a formação rápida de cistos no rim maduro. O mecanismo patogenético de manifestações não císticas da DRPAD, contudo, ainda não é bem compreendido. Nesse cenário, as relações entre déficit de concentração renal, declínio da taxa de filtração glomerular (TFG), disfunções tubulares, hipertensão arterial sistêmica e disfunção do sistema óxido nítrico (NO), fenótipos associados à DRPAD, e a haploinsuficiência de Pkd1 e/ou o fenótipo cístico renal ainda são incertas. Neste projeto investigaremos as bases moleculares e celulares dessas disfunções por meio de estudos conduzidos em dois modelos animais de deficiência de Pkd1: uma linhagem de camundongos haploinsuficientes para Pkd1 (Pkd1+/-), sem desenvolvimento de formações císticas, e um modelo de camundongo também geneticamente modificado que reproduz fenotipicamente a doença humana (Pkd1cond/cond:Balcre), com cistos renais difusos bilateralmente, lesões decorrentes do mecanismo de dois (ou três) eventos. Nossos objetivos específicos compreendem, portanto: 1) Analisar a capacidade de concentração renal em camundongos Pkd1cond/cond e Pkd1cond/cond:Balcre e em camundongos Pkd1+/+ e Pkd1+/- nas idades

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é uma hamartomatose devida a mutações nos genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2, que codificam respectivamente para as proteínas hamartina e tuberina. Estas formam um complexo macromolecular, citosólico, que regula a proliferação, diferenciação, crescimento e migração celular, aspectos deficientes nos hamartomas de pacientes com TSC. Embora estes possam acometer qualquer órgão, mais alta morbidade está relacionada a lesões cerebrais, renais ou pulmonares. As lesões epiteliais renais podem ser císticas, bilaterais, numerosas e decorrentes de desorientação na polarização, adesão e migração celulares. Estabeleceu-se em nosso laboratório condições para o cultivo tridimensional (3D) em colágeno tipo I de células de ductos coletores renais, com alta expressão endógena de hamartina e tuberina. A linhagem imortalizada, utilizada, IMCD, é de origem murina e sua proliferação in vitro, em colágeno, forma túbulos de epitélio simples. Foi relatado que algumas condições de cultivo levam à formação in vitro de cistos ao invés de túbulos. Neste projeto, os padrões estruturais 3D formados pela IMCD serão analisados por imunofluorescência, buscando-se por tubulogênese ou cistogênese, pela substituição do colágeno pelo composto Matrigel ou acréscimo de fatores tróficos como o derivado de hepatócito, envolvido na tubulogênese in vivo e in vitro. Compararemos (i) a expressão da hamartina e tuberina em células IMCD nas várias condições; e (ii) as interações entre elas e outras proteínas que sabidamente a elas se associam, como ezrina, reguladora de filamentos de actina, e a pequena GTPase Rheb que regula o alvo da rapamicina (mTOR).

Temos por objetivo, neste projeto, analisar a relação entre a policistina-1 e a lesão isquemia/reperfusão, utilizando camundongos heterozigotos para mutação nula em Pkd1 e camundongos Pkd1cond/cond:Balcre. Nossas avaliações incluirão análises de função renal, função tubular, histologia renal, proliferação celular e apoptose. Procuraremos ainda comparar a capacidade de regeneração renal associada a células tronco hematopoiéticas Pkd1-/-, comparada à de células Pkd1+/+. Por fim, investigaremos o potencial de indução de cistogênese relacionado à administração de células tronco após injúria isquemia/reperfusão.

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) constitui-se na doença monogênica renal mais comum, afetando 1 em cada 400 a 1.000 indivíduos. Ela representa um problema de saúde de grande impacto médico, social e econômico no Brasil e no mundo, sendo responsável por 4 a 5% dos pacientes em diálise crônica nos EUA. Embora as manifestações renais sejam as mais comuns, a DRPAD consiste numa enfermidade sistêmica, podendo acompanhar-se de cistos hepáticos, aneurismas intracranianos e alterações valvares cardíacas. A doença é causada por mutações no gene PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1) ou no gene PKD2, em decorrência da perda de função de seus respectivos produtos, policistina-1 (PC1) e policistina-2 (PC2). PC1 consiste numa proteína integral de membrana com função putativa de receptor/mecanossensor, com uma complexa combinação de domínios em sua porção extracelular, aparentemente envolvidos em interações proteína-proteína e/ou proteína/carboidrato. PC2, por sua vez, funciona como um canal de cátions com condutância a Ca++. Estas duas proteínas formam um complexo heterodimérico, envolvido na transdução de sinais do extra para o intracelular através de transientes intracelulares de Ca++. Nesse processo, os domínios C-terminais citosólicos de PC1 e PC2 desempenham papéis chave, uma vez que a interação física entre PC1 e PC2 ocorre através dessas dessas porções. De maneira análoga, PC2 e o receptor de inositol-1,4,5-trifosfato tipo I (IP3R) também formam um complexo, por meio da interação física entre seus domínios citoplasmáticos C-terminais. Esta interação também media a homeostase intracelular de Ca++, modulando a liberação deste íon das reservas do retículo endoplasmático para o citoplasma. PC1, PC2 e IP3R, por sua vez, são proteínas envolvidas em vários processos de sinalização intracelular, relacionados a crescimento celular, diferenciação, proliferação, polarização, morfogênese e apoptose. Embora enormes avanços tenham sido obtidos nesta área nos últimos

A doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR) é uma forma hereditária e severa de doença renal cística que acomete os rins e o trato biliar. Todas as formas típicas da doença se devem a mutações num único locus, PKHD1. Este gene foi recentemente identificado por este pesquisador e colaboradores, que demonstraram tratar-se de um gene grande e associado a um complexo padrão de splicing. A compreensão e a caracterização dos perfis de splicing de PKHD1 e Pkhd1, seu ortólogo de camundongo, são provavelmente fundamentais à elucidação de seus papéis na organogênese renal e biliar e nos correspondentes tecidos maduros, e ao entendimento da patogênese da DRPAR. Neste projeto faremos uma análise global e integrada deste processo de splicing, um problema de difícil abordagem, utilizando tecnologias de microarrays que nos permitam investigar relações splicing-expressão-função. Nossa estratégia incluirá estudos subseqüentes baseados em phage display, de modo a permitir a integração transcrição-tradução. A construção de microarrays estratégicos, a preparação de cDNAs e de extratos proteicos a partir de tecidos humanos e de tecidos de camundongo em diferentes estágios de desenvolvimento deverão esclarecer aspectos cruciais do mecanismo de splicing e caracterizar os perfis fundamentais de expressão diferencial gênica e proteica. Os transcritos e produtos traduzidos de maior expressão, por sua vez, serão confirmados por RT-PCR e western blot. Os resultados de expressão gênica e proteica de PKHD1 e de Pkhd1 serão constantemente integrados, de forma a permitir a proposição de um modelo básico funcional que envolva a ação integrada de diferentes isoformas.

Realizaremos uma análise mutacional ampla no gene PKHD1 em 35 pacientes brasileiros não-relacionados com doença renal policística autossômica recessiva. Os amplicons incluirão todos os éxons codificadores do quadro de leitura aberta mais longo do gene. Utilizaremos a técnica de DHPLC, seguida de seqüenciamento dos produtos com propriedades de eluição alteradas. De posse dos resultados encontrados e dos dados clínicos, procuraremos estabelecer correlações genótipo-fenótipo.

A doença de rim policístico autossômica recessiva (DRPAR) é uma das doenças císticas renais hereditárias mais comuns em crianças, envolvendo os rins e o trato biliar. A doença, aparentemente, é geneticamente homogênea, com ambas as formas perinatal severa e mais branda mapeando-se ao mesmo locus localizado em 6p21.1-p12. Trabalhando dentro do Consórcio Internacional da DRPAR, participei das várias etapas até então realizadas do processo de clonagem posicional deste gene, denominado PKHD1 (polycystic kidney and hepatic disease 1). Nossos objetivos agora incluem: a) refinar progressivamente o mapa genético da DRPAR, identificando novos marcadores polimórficos e usando-os em famílias recombinantes chaves, identificando novos recombinantes e analisando populações geneticamente homogêneas; b) completar o mapa de transcrição do intervalo crítico; c) selecionar genes candidatos e submetê-los a análises de mutações; d) após a identificação do gene PKHD1, estudar sua organização genômica; e) caracterizar a natureza das mutações em PKHD1 e analisar a relação entre genótipo e fenótipo na DRPAR; e f) gerar anticorpos à proteína codificada pelo gene PKHD1 e caracterizar seu padrão de expressão.

O objetivo central deste projeto é analisar os efeitos da haploinsuficiência do gene Pkd1 sobre a função e a estrutura renais. Para tanto, analisaremos o clerance de inulina, a capacidade de concentração renal, a excreção urinária de metabólitos do NO, a pressão arterial, o número de glomérulos e a morfologia glomerular de camundongos heterozigotos para mutação nula de Pkd1.