Paulo Tambasco de Oliveira.

Resumo. O objetivo desta proposta é obter recursos para a compra de um freezer -70C , sendo que vários laboratórios desta Unidade sempre utilizaram pequenos espaços cedidos pela Profa. Elaine Del-Bel. Entretanto, este equipamento chegou à sua capacidade máxima, obrigando-nos a solicitar esta verba à FAPESP, quando da submissão do Projeto "pai" (Projeto de Pesquisa Regular 2022/12290-2) que não fora outorgado pela FAPESP quando da concessão do Auxílio. Deste modo, sendo que persiste nossa dificuldade para armazenamento de amostras até o processamento, solicitamos o mesmo equipamento por meio desta chamada EMU.

Resumo. O desenvolvimento e aprimoramento dos biomateriais existentes como substitutos mucosos é requisitado, pois possibilita alternativas à utilização de enxertos autógenos. Atualmente, as matrizes colágenas de volume estáveis apresentam resultados promissores quando comparadas ao enxerto de tecido conjuntivo subepitelial. No entanto, este tipo de biomaterial é de origem alogênica (pele humana) ou origem xenógena (derivado suíno). Um substituto mucoso de composição sintética seria uma alternativa vantajosa, pois, associaria os benefícios das propriedades das matrizes já existentes à vantagem de menor imunorreatividade e questões éticas por não se tratar de um derivado de origem animal. Malhas e filamentos de polidioxanona (PDO) figuram como materiais promissores em dermatologia e cirurgias plásticas, como estimuladores de colágeno ou sustentação tecidual. A caracterização biológica desse material (polímero de polidioxanona) permitirá conhecer suas características biológicas para, posteriormente, possibilitar estudos subsequentes investigando a aplicação como substituto mucoso sintético. Além disso, arcabouços 3D parecem propícios à incorporação de bioativos de forma a otimizar o comportamento celular direcionando os mecanismos envolvidos na formação do coágulo, integração tecidual e, consequentemente, processo de regeneração. O objetivo deste estudo é, por meio de análises in vitro, ex vivo e in vivo, caracterizar o comportamento celular e de formação do coágulo fisiológico da polidioxanona e também entender se a biofuncionalição com i-PRF poderia acrescentar ou modular a relação do tecido conjuntivo ao material. Serão cultivadas células fibroblásticas (Fb) da linhagem C57BL/6 de camundongos (SCRC-1008, ATCC, Manassas, VA, EUA) sobre a polidioxanona (PDO+Fb) diretamente ou a polidioxanona funcionalizada com iPRF (PDO+iPRF+Fb), perfazendo 5 dias de cultura, compondo as análises in vitro. Nas análises ex vivo, fibroblastos C57BL/6 serão cultivados sobre a PDO acrescida de coágulo fisiológico de 16h produzido no animal (PDO+PhC+Fb) e PDO funcionalizado com iPRF acrescida de coágulo fisiológico (PDO+PhC+iPRF+Fb). Será analisada a morfologia (microscopia eletrônica de varredura - 24h pós plaqueamento), viabilidade, migração e diferenciação celular (ensaio Live/Dead, 24h e 5 dias pós plaqueamento e ensaio MTT em 5 dias). O ensaio ELISA será realizado para quantificação das glicoproteínas fibronectina e tenascina (análise em 5 dias pós plaqueamento celular). No ensaio in vivo, após 16h do procedimento (implantação da matriz no dorso de camundongo - grupo PDO e grupo PDO+iPRF) será avaliado a morfologia superficial produzida (MEV) e caracterização do coágulo fisiológico formado por citometria de fluxo. Após 7 e 21 dias de implantação da PDO e do PDO+iPRF no dorso de camundongos serão caracterizadas a reação inflamatória (análise histomorfológica das secções coradas em HE), e a deposição colagênica (análise histomorfológica das secções coradas com Picrosirius Red). A angiogênese será avaliada por imunofluorescência indireta verificando o índice percentual médio de vasos neoformados, utilizando anticorpo monoclonal específico anti-VEGF-A, para avaliar o Fator de Crescimento Endotelial Vascular A (VEGF-A). Os dados serão avaliados pelo teste de homoscedasticidade, por testes paramétricos ou não paramétricos, estabelecido o nível de significância (p<0,05). Os resultados serão expressos descritivamente e em gráficos com média ou mediana e desvio padrão (média erro padrão) ou desvio interquartílico (mediana interquartílico).

Resumo. A osteoporose é uma doença multifatorial de alta prevalência na população, sendo que sua patogênese pode resultar de diferentes fatores como uso de medicamentos, consumo de álcool, fatores genéticos, envelhecimento e deficiências hormonais, trazendo um desequilíbrio no sistema de remodelação óssea resultando em maior reabsorção do que sua formação. A associação entre este desequilíbrio com a deficiência estrogênica que ocorre em mulheres na fase da menopausa ainda é muito investigada, sugerindo-se que a redução na produção de estrógeno pelo próprio organismo após a menopausa favoreça o estresse oxidativo com consequente alteração na atividade funcional das células ósseas. Diversos são os tratamentos atuais para a osteoporose, mas os mesmos se caracterizam pela alta incidência de efeitos colaterais indesejáveis, o que leva ao aumento da busca por terapias alternativas que sejam eficazes, mas que, ao mesmo tempo, não tragam tais prejuízos ao organismo. Evidências mostram que os fitoestrógenos, encontrados em abundância no reino vegetal, possam ser usados como alternativas de tratamento para a osteoporose pós-menopausa por sua capacidade de se ligar a receptores de estrógeno no organismo, o que levaria a um aumentando na taxa de deposição e reduzindo a taxa de reabsorção óssea, além de possuir efeito antioxidante, atuando de forma a proteger as células contra os efeitos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas pelo estresse oxidativo nesta condição. Sendo assim, a proposta do presente trabalho é avaliar o efeito de dois fitoestrógenos, Vitex agnus-castus (VAC) (popularmente usado no tratamento de sintomas pré-menstruais) e extrato de pitaya (EPY) (rico em flavonoides e outros compostos com potencial ação como fitoestrógeno) com análises in vivo e in vitro, comparado ao -estradiol (E2), na função osteogênica de células osteoblásticas na presença e ausência de estresse oxidativo e na perda óssea em ratas submetidas a um modelo experimental de osteoporose. Para a análise in vitro, células da linhagem osteoblástica MC3T3-E1 e da medula óssea do fêmur dos animais serão cultivadas e divididas em grupos controle e grupos com indução in vitro de estresse oxidativo. Esses dois grupos, por sua vez, serão subdivididos em quatro grupos: i) Grupo sem tratamento; ii) Grupo com adição de 10-8 mol.L-1 de -estradiol; iii) Grupo com adição de VAC (concentração a ser definida); iv) Grupo com adição de EPY (concentração a ser definida). Os grupos celulares serão submetidos a ensaios bioquímicos e de biologia molecular, como análise da proliferação celular (MTT), detecção e quantificação da enzima fosfatase alcalina e de nódulos mineralizados, além da detecção intracelular de EROs e análise da expressão de genes relacionados à osteogênese e ao estresse oxidativo. As células mesenquimais da medula óssea do fêmur serão utilizadas para testes de mineralização. Para análise in vivo ratas Sprague-Dawley serão divididas em grupo controle (SHAM) e grupo com indução de osteoporose experimental. Esses dois grupos serão subdivididos em quatro grupos: i) Administração de água; ii) Administração de 20 g/mL de -estradiol; iii) Administração de 200 mg/mL VAC; iv) Administração de 200 mg/mL de EPY. Essa administração ocorrerá imediatamente após a ovariectomia por 12 semanas e então será realizada a eutanásia e coleta de material que, por sua vez, será submetido à análise histológica qualitativa e quantitativa do tecido ósseo e conjuntivo, assim como à análise microtomográfica e de histometria dinâmica do tecido ósseo, através de fluorocromos, para estudo da microarquitetura óssea. Os dados obtidos serão analisados estatisticamente pelo software Graph Pad Prism 5.0 com nível de significância de 5.

No processo de regeneração óssea, o sangue é o primeiro componente a entrar em contato com os biomateriais utilizados. Nesta pesquisa objetiva-se ver os efeitos de Aptamers (oligonucleotídeos curtos capazes de se ligarem seletivamente à proteína alvo) anti-fibronectina (FN) adicionados em arcabouços 3D (SCA), na formação do coágulo sanguíneo e, adicionalmente, na formação óssea. MTT testará a viabilidade celular in vitro de células pré-osteoblásticas (OSB) derivadas de rato (linhagem UMR-106) sobre os SCA com e sem Aptamers anti-FN. O coágulo fisiológico (PhC) será então desenvolvido em modelo animal (rato) sobre os SCA com ou sem Aptamers, caracterizando o estudo ex vivo. Ainda, a fenotipagem do PhC será caracterizada por citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura. Em outro passo, OSB será cultivado sobre o substrato (SCA, Aptamers e PhC), objetivando observar o efeito do substrato sobre a formação e acúmulo de cálcio e a morfologia 3D dos OSB e PhC por ensaio de mineralização e microscopia confocal, respectivamente. As interações genéticas desencadeadas pela associação dos SCA, Aptamers e PhC sobre o OSB serão investigadas por análise transcriptômica pelo método RNA-seq. Já no estudo in vivo, verificaremos essa associação na formação óssea em ratas. Os grupos experimentais serão 1) controle negativo (sem biomaterial no defeito ósseo - C), 2) Controle (SCA), 3) SCA funcionalizados com Aptamers-anti-FN (SCA+APTantiFN). Todos serão investigados após 5 e 15 dias para observar a diferenciação osteoblástica e neoformação óssea, respectivamente. Dois defeitos críticos serão realizados na calvária: um destinado à análise da densidade e volume ósseo formado por Micro-CT e o outro para análise transcriptômica e processamento histomorfométrico. O perfil genético e a expressão de Runx2 e fosfatase alcalina serão investigados usando os métodos RNA-seq e imuno-histoquímica, respectivamente. Esses achados serão promissores para observar as sinalizações autócrinas e parácrinas do coágulo formado sobre esse biomaterial enriquecido com Aptamer anti-FN, sendo fundamental para desvendar, tanto in vitro como in vivo, os efeitos dessa associação na osteogênese.

A manutenção da osseointegração de implantes de titânio (Ti) baseia-se na remodelação óssea, que compreende um equilíbrio entre a formação de tecido ósseo por osteoblastos e a atividade de reabsorção desse tecido por osteoclastos. Nosso grupo mostrou que a superfície de Ti com nanotopografia obtida através de condicionamento químico com solução de H2SO4/H2O2 é capaz de induzir a diferenciação osteoblástica tanto em condições osteogênicas como não-osteogênicas. No entanto, o efeito dessa superfície sobre a diferenciação e atividade de osteoclastos, e sobre a interação dos mesmos com células osteoblásticas ainda não foram investigados. Nesse contexto, nós elaboramos a hipótese de que a nanotopografia, além de favorecer a diferenciação osteoblástica, modula a interação osteoblasto/osteoclasto, inibindo a diferenciação osteoclástica. Portanto, o objetivo desse estudo é determinar a influência da superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti usinada (controle), sobre a interação entre células osteoblásticas e osteoclásticas. Para isso, avaliaremos: (1) o efeito da superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a diferenciação osteoblástica e sobre a formação e a atividade osteoclástica em culturas isoladas de células da linhagem MC3T3-E1 e RAW 264.7, respectivamente, crescidas sobre essas superfícies; (2) o efeito de células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 sobre a formação e atividade osteoclástica de células da linhagem RAW 264.7 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, em modelos de co-cultura indireta; (3) o efeito de células osteoclásticas da linhagem RAW 264.7 sobre a diferenciação osteoblástica de células da linhagem MC3T3-E1 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, em modelos de co-cultura indireta; (4) o efeito do meio condicionado por células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a formação e atividade osteoclástica de células da linhagem RAW 264.7, e (5) o efeito do meio condicionado por células osteoclásticas da linhagem RAW 264.7 crescidas sobre a superfície de Ti com nanotopografia, comparada à superfície de Ti controle, sobre a diferenciação osteoblástica de células da linhagem MC3T3-E1.

O osso é um tecido com grande capacidade de regeneração, mas em algumas situações a extensão da injúria impede o reparo do tecido. Nesse cenário, a terapia celular utilizando células-tronco mesenquimais (do Inglês, mesenchymal stem cells - MSCs) tem atraído a atenção de diversos grupos de pesquisa por ser uma alternativa promissora em relação aos tratamentos existentes. No entanto, diversos aspectos moleculares, celulares e teciduais, ainda não abordados na literatura, necessitam ser investigados para tornar essa terapia um tratamento efetivo para a regeneração de defeitos ósseos em pacientes saudáveis ou acometidos por doenças sistêmicas que afetam o processo de reparo ósseo, como a osteoporose, a diabetes mellitus e a hipertensão. Nesse contexto, o presente projeto é composto por três subprojetos, cujos objetivos são: (1) investigar o potencial de MSCs derivadas de medula óssea (do Inglês, bone marrow - BM-MSCs) e de tecido adiposo (do Inglês, adipose tissue - AT-MSCs), tratadas com fator de crescimento do endotélio vascular A (do Inglês, vascular endothelial growth fator A - VEGF-A) e/ou proteína óssea morfogenética 9 (do Inglês, bone morphogenetic protein 9 - BMP-9) para regenerar o tecido ósseo; (2) investigar o potencial dessas MSCs modificadas geneticamente para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9 para regenerar o tecido ósseo e (3) avaliar a influência de BM-MSCs obtidas de ratos saudáveis sobre a diferenciação osteoblástica de BM-MSCs obtidas de ratos osteoporóticos, diabéticos e hipertensos. Para o desenvolvimento dos subprojetos 1 e 2, BM-MSCs e AT-MSCs serão tratadas com VEGF-A e/ou BMP-9 ou modificadas geneticamente utilizando agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente interespaçadas (CRISPR-Cas9) para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9. Essas células serão caracterizadas in vitro quanto ao potencial angiogênico e osteogênico e à expressão gênica e proteica em larga escala. Para a regeneração do tecido ósseo, as BM-MSCs e AT-MSCs associadas ao VEGF-A e/ou BMP-9 ou modificadas para sobre-expressar VEGF-A e/ou BMP-9 serão injetadas diretamente em defeitos criados em calvárias de ratos. Inicialmente, o tempo de permanência das células nos defeitos ósseos será avaliado por luminescência, utilizando a injeção de células transfectadas com luciferase. Por até 4 semanas após a injeção de células, a progressão da formação de vasos sanguíneos e de tecido ósseo será avaliada por microtomografia computadorizada (micro-CT) in vivo. Ao final de 4 semanas, os animais serão eutanasiados e as amostras serão avaliadas por análise histológica. No subprojeto 3, será avaliada a influência de BM-MSCs obtidas de ratos saudáveis sobre a diferenciação osteoblástica de BM-MSCs obtidas de ratos osteoporóticos, diabéticos e hipertensos utilizando um modelo de co-cultura indireta. Trata-se de estudo in vitro, cujos resultados, poderão gerar desdobramentos durante o desenvolvimento do presente projeto, com vistas à aplicação das terapias abordadas nos subprojetos 1 e 2 para a investigação da regeneração óssea nos modelos de patologias abordados no subprojeto 3.

O objetivo específico de inovação refere-se à modulação da resposta tecidual durante a cicatrização fisiológica de implantes ósseos. A resposta tecidual à implantação de biomateriais é ainda um processo não totalmente elucidado e relacionado a frequentes complicações, como a perda tardia de implantes dentários, a ocorrência de ossificações heterotópicas, fibrose e infecções associadas a implantes ortopédicos e vertebrais. Diferentes superfícies de implantes foram desenvolvidas para se obter rápida neoformação óssea na região interfacial. No entanto, estudos recentes mostram que aceleração da osseointegração pode estar associada a uma exacerbação do processo inflamatório. Assim, as pesquisas com biomateriais para implantação óssea devem ter seu foco voltado para a promoção da cicatrização fisiológica, com o que o projeto NAT 4MORE deverá contribuir. Espera-se desenvolver implantes osseointegráveis com superfícies nanotexturizadas, funcionalizadas com biomoléculas naturais capazes de modular a resposta biológica. Ligas de titânio, vidros bioativos e hidroxiapatita serão selecionados como substratos-modelo por se constituírem em biomateriais clássicos, cuja comparação permitirá decifrar diferentes fenômenos aplicáveis aos implantes osseointegráveis. O consórcio NAT4MORE possui experiência em nanotexturização de superfícies como estratégia para estimular a adesão e a diferenciação celulares, limitando a adesão de micro-organismos. A funcionalização de superfície será realizada seguindo abordagem bioinspirada, com moléculas naturais com ação no controle da inflamação e osteogenicidade: polifenóis derivados do bagaço da uva e derivados de quitina do exoesqueleto de camarões, com efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios, antibacterianos e osteogênicos. O projeto terá impacto sobre: 1) O conhecimento das reações na interface biomaterial-tecido, sobretudo inflamação e reação de corpo estranho; 2) Produtos futuros: biomateriais para osso com melhor desempenho clínico; 3) Ambiente: biomoléculas de alto valor agregado, obtidas de detritos amplamente disponíveis da indústria de alimentos e vinho; o NAT4MORE contribuirá com o potencial econômico de produtividade da UE local a partir de fontes naturais abundantes.

A superfície de titânio (Ti) com nanotopografia, obtida por condicionamento com solução de H2SO4/H2O2, tem grande potencial osteogênico por modular vias de sinalização envolvidas na diferenciação osteoblástica, como por exemplo as vias de integrinas e proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs). Considerando a participação importante de vias de Wingless-Type mouse mammary tumor vírus [MMTV] Integration Site (Wnt) no processo de osteogênese, nós elaboramos a hipótese de que essas vias estão, ao menos em parte, envolvidas no potencial osteogênico da superfície de Ti com nanotopografia. Para testar essa hipótese, células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 serão cultivadas sobre discos de Ti com nanotopografia e usinados (controle) e será avaliada a expressão gênica, por PCR em tempo real, de marcadores das vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+. A partir dos resultados de expressão gênica, serão selecionados um gene-alvo da via de sinalização de Wnt canônica e um da via não-canônica regulados de forma mais intensa pela superfície de Ti com nanotopografia para a aquisição de agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente interespaçadas (CRISPR-Cas9/gRNA) que serão utilizados para o silenciamento dos dois genes-alvos de interesse. A eficácia do silenciamento dos CRISPR-Cas9/gRNA será avaliada por PCR em tempo real e Western blot para determinar a expressão gênica e proteica, respectivamente, dos dois genes-alvos. Em seguida, células da linhagem MC3T3-E1 serão transduzidas com os CRISPR-Cas9/gRNA relacionados às vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+ previamente selecionados, na concentração pré-determinada. As transduções serão feitas da seguinte forma: (1) CRISPR-Cas9/gRNA para a via de Wnt canônica, (2) CRISPR-Cas9/gRNA para a via não-canônica Wnt/Ca2+, (3) CRISPR-Cas9/gRNA para as vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+ ou (4) controle (CRISPR-Cas9 sem gRNA). As células transduzidas, e consequentemente com as vias de Wnt canônica e/ou não-canônica silenciadas, serão cultivadas sobre as superfícies de Ti com nanotopografia e controle para a avaliação de: (1) expressão de genes relacionados às vias de sinalização de Wnt canônica e não-canônica e dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix (OSX), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC), por PCR em tempo real, (2) expressão proteica de RUNX2, por Western blot, e (3) atividade de ALP. Os dados quantitativos serão obtidos em quintuplicata (n=5) e submetidos ao teste de aderência à curva normal e homegeneidade de variâncias. Caso seja detectada normalidade dos dados, será aplicado o teste-t ou ANOVA (para comparação de 2 grupos e comparações múltiplas, respectivamente) ou se não, o teste Mann Whitney ou Kruskal-Wallis serão aplicados. O nível de significância adotado será de 5%.

O osso é um tecido com grande capacidade de regeneração, mas em algumas situações a extensão da injúria impede o reparo do tecido. Nesse cenário, a terapia celular tem atraído a atenção de diversos grupos de pesquisa por ser uma alternativa promissora em relação aos tratamentos existentes. No entanto, diversos aspectos moleculares, celulares e teciduais, ainda não abordados na literatura, necessitam ser investigados para tornar essa terapia um tratamento efetivo para a regeneração de defeitos ósseos. Sendo assim, os objetivos desse estudo são comparar as assinaturas moleculares e o potencial para regenerar o tecido ósseo de células-tronco mesenquimais (CTMs) e de osteoblastos. Para isso, CTMs serão obtidas de medula óssea (CTMs-MO) e de tecido adiposo (CTMs-TA) de ratos, expandidas in vitro e mantidas com características de CTMs ou diferenciadas em osteoblastos (OBs-MO e OBs-TA, respectivamente). As CTMs serão identificadas por imunofenotipagem por citometria de fluxo para os marcadores CD29, CD31, CD34, CD45, CD90 e CD106. A diferenciação osteoblástica será confirmada por avaliação da expressão gênica de Runx2, fosfatase alcalina e osteocalcina por PCR em tempo real. As assinaturas moleculares de CTMs-MO, CTMs-TA, OBs-MO e OBs-TA serão avaliada por análises em larga escala das expressões gênica (microarray) e proteica (proteômica). Para a regeneração do tecido ósseo, as células serão injetadas (injeção única x injeções repetidas) diretamente em defeitos criados em calvárias de ratos duas semanas antes da primeira injeção para mimetizar defeito ósseo sem capacidade de auto-regeneração. Inicialmente, o tempo de permanência de CTMs-MO, CTMs-TA, OBs-MO e OBs-TA nos defeitos ósseos será avaliado por bioluminescência utilizando a injeção de células transfectadas com luciferase. Dessa forma, será possível determinar o intervalo entre as injeções repetidas. Duas semanas após a criação dos defeitos ósseos, será realizada a primeira injeção de células e as injeções adicionais serão aplicadas no intervalo determinado no experimento anterior. Defeitos ósseos tratados com uma única injeção de células e com o veículo utilizado (solução salina tamponada com fosfato) sem células serão também avaliados. Seis semanas após a primeira injeção, os animais serão mortos e o tecido ósseo neoformado será avaliado por microtomografia computadorizada, análise histológica, PCR em tempo real e análise do módulo de elasticidade e da dureza. Os dados serão submetidos ao teste de aderência à curva normal para determinar o teste estatístico adequado. Os resultados desse estudo poderão estabelecer novos parâmetros com relação às características de células candidatas ao uso em terapia celular e à injeção de células para regenerar tecido ósseo, visto que, até o momento, não há na literatura estudos avaliando o efeito de injeções repetidas. http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/93236/celulas-tronco-mesenquimais-e-osteoblastos-avaliacao-das-assinaturas-moleculares-e-do-potencial-par/

Processo 2013.1.9419.1.7&#10;Recursos concedidos: R$ 10.000,00

A engenharia de tecidos é uma ciência interdisciplinar baseada na combinação de arcabouços, células e fatores de crescimento com o objetivo de desenvolver novos tecidos. Estratégias envolvendo engenharia de tecidos como terapia para o tratamento de defeitos ósseos produzidos por trauma, processo infeccioso ou patológico são de grande interesse nas áreas de cirurgia buco-maxilo facial e ortopedia. Resultados preliminares mostraram o alto potencial osteogênico do Bio-sca, um arcabouço poroso desenvolvido a partir do Biosilicato®, sugerindo que esse biomaterial pode ser adequado para o uso em engenharia de tecido ósseo. Assim, os objetivos do nosso estudo são: (1) avaliar in vitro as respostas de células-tronco mesenquimais (CTM) e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação crescidos sobre o Bio-sca e (2) avaliar in vivo o efeito da associação entre CTM ou osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação e o Bio-sca sobre o reparo de defeitos ósseos criados em calvárias de ratos. Para isso, CTM e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação obtidos de medula óssea de ratos serão caracterizados quanto à expressão de marcadores de superfície (CD13, CD29, CD31, CD44, CD73, CD90, CD105 e CD166, CD14, CD34, CD45) por citometria de fluxo e à expressão de um painel de genes indicativos da diferenciação osteoblástica, fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osterix (OSX) colágeno do tipo I (COL I), proteína morfogenética óssea tipo 2 (BMP-2), sialoproteína óssea (BSP), osteopontina (OPN) e osteocalcina (OC) será por PCR em tempo real. Em seguida, serão avaliadas a proliferação celular, atividade de ALP, formação de matriz mineralizada e expressão das proteínas Runx2 e ALP e a expressão dos mesmos genes citados acima das CTM e osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação, crescidos sobre Bio-sca e Bioglass® 45S5 (controle). Para as avaliações in vivo, defeitos ósseos criados em calvária de ratos receberão quatro tipos de tratamento, Bio-sca carreado com CTM, Bio-sca carreado com osteoblastos em estágios iniciais de diferenciação, Bio-sca sem células e sem tratamento, e as amostras serão submetidas a análises tomográfica e histomorfométrica. Nossos resultados contribuirão para um avanço em termos de pesquisa translacional em engenharia de tecido ósseo e poderão estabelecer novos tratamentos para o reparo de defeitos ósseos. http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/58270/engenharia-de-tecidos-efeito-da-associacao-entre-celulas-e-bio-sca-sobre-o-reparo-de-defeitos-osseo/

Estudos iniciais de nosso grupo de pesquisa mostraram que a simples adsorção de GDF-5 sobre nanotopografias de titânio (Ti), obtidas por condicionamento com ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio, altera parâmetros importantes do desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro, resultando em aumento da atividade de fosfatase alcalina (ALP) e em acúmulos maiores de cálcio em formações de matriz mineralizada de culturas primárias de células osteoblásticas. Visando aprofundar os conhecimentos sobre a relevância da funcionalização de GDF-5 sobre nanotopografia de Ti, o presente projeto tem como objetivos: 1) avaliar os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em nanotopografia de Ti com GDF-5 disponibilizado por simples adsorção, sobre a mineralização de culturas primárias de células osteogênicas; 2) considerando que o processo de adsorção resulta em formação de filme inomogêneo de GDF-5 sobre nanotopografias de Ti, avaliar a resposta de culturas primárias de células osteogênicas quando crescidas sobre filmes finos, homogêneos, de GDF-5 obtidos pelo método layer-by-layer, em comparação àqueles obtidos por simples adsorção, em relação à expressão de marcadores da diferenciação osteoblástica por reação em cadeia da polimerase em tempo real (real time PCR), atividade de ALP e formação de matriz mineralizada; 3) baseados nos resultados obtidos nos experimentos in vitro, avaliar, em tíbia de coelhos, a formação óssea adjacente a implantes de Ti com superfície nanoestruturada e funcionalizada com GDF-5.

Estudos de biomateriais têm resultado no desenvolvimento de um grande número de materiais compostos com propriedades mecânicas e biológicas adequadas para substituir o tecido ósseo. Uma das estratégias utilizadas é a de desenvolver implantes ósseos constituídos de matriz cerâmica bioinerte com resistência mecânica adequada, recoberta com material cerâmico bioativo que promova a formação óssea na região interfacial e sua forte união com a superfície do implante. A zircônia (ZrO2), por suas excelentes propriedades mecânicas, é um dos materiais cerâmicos ideais como substrato bioinerte, enquanto que a fluorapatita [Ca10(PO4)6F2] exibe biocompatibilidade semelhante à da hidroxiapatita, um material cerâmico à base de fosfato de cálcio com bioatividade óssea. O objetivo deste projeto de cooperação USP-CETMIC é desenvolver técnicas e processos de produção de materiais compostos de ZrO2 e fluorapatita e avaliar suas propriedades estruturais, mecânicas e biológicas. Ao nosso grupo de pesquisa na USP caberá a avaliação da biocompatibilidade dos materiais desenvolvidos. Culturas primárias de células osteogênicas e células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 serão plaqueadas sobre discos do compósito de ZrO2 e fluorapatita, para avaliação dos seguintes parâmetros: 1) adesão celular em 4 e 24 h, por contagem de células pelo hemocitômetro; 2) viabilidade celular pelo método MTT, em 1, 3, 7 e 10 dias; 3) morfologia celular por fluorescência direta para detecção do citoesqueleto de actina e núcleos celulares, em 1, 3, 7 e 10 dias; 4) diferenciação osteoblástica por PCR Array em 7 e 10 dias e pela mineralização das culturas em 14 ou 21 dias, por coloração com vermelho de Alizarina.

Processo 2012.12.1.100033.1.0&#10;Recursos concedidos: R$ 6.000,00

O carcinoma espinocelular (CEC) representa a neoplasia maligna mais prevalente das estruturas bucais, podendo invadir e destruir o tecido ósseo devido ao aumento da atividade osteoclástica. A expressão da proteína matricelular osteopontina (OPN) tem sido relacionada à maior agressividade de neoplasias por favorecer fenômenos celulares de adesão, proliferação e invasão. No tecido ósseo, a OPN representa a proteína mais abundante da matriz não colágena, concentrada nas interfaces ósseas (linhas de cimentação e lâminas limitantes), sendo essencial para a adesão e atividades de osteoblastos e osteoclastos. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão de osteopontina em sistemas de coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas humanas e seus efeitos sobre o fenótipo neoplásico e ativação osteoclástica. Serão avaliados: 1) perfil de expressão de OPN em coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas humanas; 2) efeito da OPN de culturas osteoblásticas sobre o genótipo e fenótipo de células epiteliais neoplásicas humanas e 3) o efeito da OPN secretada em coculturas sobre a ativação osteoclástica. Auxílio à Pesquisa Regular - Processo FAPESP 2012/07531-9. Recursos concedidos: R$ 84.138,09 e US$ 80.353,95. Início: 01/09/2012. Duração: 24-30 meses.

As proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) são citocinas pertencentes à família do fator de crescimento transformante beta (TGF-beta) e estão envolvidas em diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação osteoblástica e a formação óssea, eventos diretamente relacionados ao processo de osseointegração de implantes de titânio (Ti). Sabe-se que superfícies de Ti com nanotopografia favorecem a mineralização da matriz extracelular; no entanto, os mecanismos celulares envolvidos não são completamente entendidos. Neste contexto, nós elaboramos a hipótese de que as BMPs endógenas, especificamente as BMP-2/4, sabidamente osteogênicas, exercem função importante nas respostas de osteoblastos a superfícies de Ti nanoestruturadas. Previamente ao teste da hipótese, células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 serão cultivadas para avaliar: (1) a expressão gênica e proteica das BMP-2/4 em culturas crescidas sobre poliestireno, por Real-time PCR e ELISA; (2) a eficácia dos silenciadores (shRNA) para BMPR1A, Smad-4, Smad-6, Smurf-1 e Smurf 2 em silenciar a expressão das respectivas proteínas, todas envolvidas nas vias de sinalização das BMP-2/4, em culturas crescidas sobre poliestireno, por Western blot; e (3) o efeito dos silenciadores sobre as vias de sinalização das BMP-2/4 e sobre a expressão do fenótipo osteoblástico em culturas crescidas sobre poliestireno, por PCR-array e Western blot. Em seguida a hipótese será testada por avaliar: (1) o efeito da nanotopografia de superfície de Ti, comparada à superfície de Ti com microtopografia (controle), sobre a síntese de BMP-2/4 em culturas crescidas sobre essas superfícies, por Real-time PCR e ELISA; e (2) o efeito dos silenciadores sobre as vias de sinalização das BMP-2/4 e sobre a expressão do fenótipo osteoblástico em culturas crescidas sobre superfície de Ti com nanotopografia comparada à superfície de Ti controle, por PCR-array e Western blot. Os resultados desse estudo podem contribuir para o entendimento dos mecanismos intracelulares envolvidos nas respostas de osteoblastos a superfícies de Ti e, consequentemente, para o desenvolvimento de novas estratégias envolvendo BMPs e nanotopografia de superfície que favoreçam os eventos relacionados ao processo de osseointegração. http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/56294/participacao-das-proteinas-osseas-morfogeneticas-2-e-4-endogenas-na-expressao-do-fenotipo-osteoblast/

Processo 2011.11.1.17541.1.0&#10;Recursos concedidos: R$ 4.000,00.

A implantação de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos representa estratégia terapêutica importante para se promover a formação de matriz extracelular mineralizada em defeitos ósseos críticos. Quando expostos a fluidos biológicos, vidros e vitrocerâmicas bioativos exibem alterações químicas e topográficas de superfície que afetam as interações de células com a superfície desses biomateriais, reduzindo o espraiamento celular e alterando o padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto e de integrinas. O presente projeto tem como objetivo avaliar se as alterações no padrão de marcação para actina e tubulina, duas das principais proteínas citoesqueléticas, observadas in vitro em células osteogênicas sobre superfícies do vidro Bioglass® 45S5 e da vitrocerâmica Biosilicato®, são decorrentes de redução quantitativa na expressão do RNAm e das proteínas correspondentes. Nos períodos de 3 e 7 dias de culturas primárias de células osteogênicas, os níveis de RNAm para actina e tubulina serão quantificados por PCR em tempo real, enquanto que a expressão de actina e tubulina será determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA). Vigência: 01/09/2011 a 31/08/2013. Auxílio à Pesquisa Regular - FAPESP - 2011/01852-5 - Valor total: R$ 124.507,53.

MicroRNAs (miRs) são pequenos RNAs funcionais, com aproximadamente 22 nucleotídeos, que não codificam proteínas e estão envolvidos em diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação osteoblástica in vitro e a formação óssea in vivo, eventos diretamente relacionados ao processo de osseointegração de implantes de titânio (Ti). Sabe-se que superfícies de Ti com nanotopografia favorecem a mineralização da matriz extracelular; no entanto, os mecanismos celulares envolvidos não são completamente entendidos. Nesse sentido, é possível especular que miRs fazem parte da maquinaria celular que regula a interação entre osteoblastos e superfícies de Ti. O objetivo do presente projeto é analisar a expressão em larga escala de miRs em células osteoblásticas crescidas sobre superfícies de Ti com nanotopografia. Células osteoblásticas diferenciadas a partir de células mesenquimais derivadas de medula óssea de humanos serão cultivadas sobre discos de Ti com e sem nanotopografia e serão avaliados os seguintes parâmetros: proliferação e viabilidade celulares; expressão gênica (RNA mensageiro - RNAm), por Real-time PCR, e proteica, por Western blot, de Runx2, fator de transcrição essencial para o estabelecimento do fenótipo osteoblástico; formação de matriz mineralizada e expressão de miRs por Microarray. Por fim, miRs que apresentarem alterações significativas de expressão na análise por Microarray, redução ou aumento de cinco vezes, quando comparadas as superfícies de Ti com e sem nanotopografia, serão submetidos à análise por Real-time PCR para a validação dos dados. http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/30613/analise-em-larga-escala-da-expressao-de-micrornas-em-celulas-osteoblasticas-crescidas-sobre-titanio/

A regeneração de defeitos ósseos resultantes de traumas ou processos patológicos ainda constitui um grande desafio nas áreas da Odontologia e Medicina. A utilização de células tem sido considerada bastante promissora para a regeneração do tecido ósseo e dentre os diversos tipos celulares que podem ser utilizados, as células-tronco mesenquimais, também chamadas de multipotentes estromais, têm sido as mais estudadas. Resultados bastante promissores foram relatados para o tratamento de não união crônica de fraturas e de doenças ósseas metabólicas, tais como, osteogênese imperfeita e hipofosfatasia. Várias observações têm sugerido que essas células atuariam por serem capazes de se diferenciar em diversos tipos celulares e também como um sistema de liberação de fatores de crescimento nos sítios de injúria. A partir disso, formulamos a hipótese de que a terapia celular que fizesse uso de uma associação de células indiferenciadas, como fonte de fatores de crescimento, e de osteoblastos, como formadores da matriz mineralizada, poderia ser mais eficaz para o reparo do tecido ósseo do que essas células isoladamente. Para tanto, estamos propondo avaliar: 1) in vitro os efeitos das células-tronco mesenquimais da medula óssea sobre osteoblastos diferenciados a partir dessas mesmas células; e 2) in vivo o efeito da terapia celular pela associação de células-tronco mesenquimais e osteoblastos sobre o reparo de defeitos ósseos. http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/31638/efeitos-da-terapia-celular-com-a-associacao-de-celulas-tronco-mesenquimais-e-osteoblastos-no-reparo/

Linha de fomento: Auxílio à Pesquisa - Programa Equipamentos Multiusuários, Processo FAPESP 2009/54142-5. Vigência: 01 de outubro de 2010 a 30 de setembro de 2012. Recursos concedidos: Material Permanente - R$ 508.389,45; Reserva Técnica - R$ 36.871,18.

A cirurgia de elevação do seio maxilar é uma alternativa eficaz no tratamento da altura óssea insuficiente para colocação de implantes na região posterior da maxila atrófica. A capacidade proliferativa e de diferenciação osteoblástica das células contidas no enxerto são, em grande parte, responsáveis pelo sucesso das cirurgias de elevação do seio maxilar, mas não se conhece os tipos de alteração fenotípica que podem ocorrer nessas células após sua inserção no leito receptor. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão do fenótipo osteoblástico de células cultivadas a partir de fragmentos ósseos de áreas doadoras no momento da enxertia e 6 meses após a enxertia do seio maxilar. A cirurgia de elevação do seio maxilar será realizada utilizando enxerto autógeno inlay derivado da região de túber ou ramo da mandíbula. Após 6 meses, durante a intervenção cirúrgica para colocação dos implantes de titânio, biópsias serão retiradas das áreas de enxerto por meio de uma broca trefina. O fragmentos ósseos dos enxertos e das biópsias serão submetidos à digestão enzimática para obtenção das células as quais serão cultivadas em meio osteogênico até a subconfluência. Em seguida, as células serão subcultivadas para avaliar: 1) a proliferação celular aos 3, 7 e 10 dias; 2) o conteúdo da proteína total e atividade da fosfatase alcalina (ALP) aos 7, 10 e 14 dias; 3) a expressão dos genes marcadores do fenótipo osteoblástico (COL, ALP, BSP, OPN, OSC e RUNX2) aos 14 dias; 4) a formação da matriz mineralizada aos 17 dias. Os dados serão comparados pelo teste t de Student ou análise de variância. http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/25894/caracterizacao-do-fenotipo-osteoblastico-de-celulas-derivadas-de-enxerto-osseo-autogeno-do-seio-maxi/

Estudos iniciais demonstraram aumento na imunodetecção de osteopontina (OPN) citoplasmática e extracelular e aceleração e/ou aumento de formações nodulares de matriz mineralizada em culturas osteogênicas sobre titânio (Ti) com nanotopografia. Visando aprofundar os conhecimentos em relação a esses achados, os objetivos do presente projeto são: verificar se as evidências de imunomarcação mais intensa para OPN em culturas osteogênicas sobre nanotopografia estão relacionadas ao aumento no nível de expressão de RNAm e de proteína, em diferentes tempos experimentais e verificar o efeito da inibição da expressão de OPN sobre o processo de mineralização da matriz extracelular (MEC). As células serão obtidas por digestão enzimática de calvária de ratos recém-nascidos e cultivadas em superfícies de titânio com nanotopografia ou usinadas. Nos tempos de 4, 7 e 10 dias pós-plaqueamento serão avaliados e comparados os seguintes parâmetros: 1) Quantificação da expressão de RNAm para OPN por PCR em tempo real, 2) Quantificação da expressão de OPN por ELISA e 3) Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta. O silenciamento da OPN será realizado no tempo de 6 horas pós-plaqueamento, por RNA de interferência e seu efeito sobre a mineralização da MEC será avaliado nos tempos de 10 e 14 dias. Auxílio à Pesquisa Regular - FAPESP - 2010/50925-4 - Valor total: R$ 111.546,97.

Apesar de materiais vítreos bioativos poderem ser usados como substitutos ósseos, sua aplicação em engenharia de tecido ósseo é limitada, em virtude de suas propriedades mecânicas inadequadas. Uma das estratégias para contornar essa limitação é o desenvolvimento de novos materiais vitrocerâmicos, obtidos pela cristalização controlada de vidros bioativos. Estudo recente de nosso grupo mostrou que a progressão de culturas osteogênicas sobre substratos bidimensionais de vitrocerâmica 100% cristalina e altamente bioativa (Biosilicato), do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, desenvolvida pelo Laboratório de Materiais Vítreos da Universidade Federal de São Carlos, resulta em um aumento expressivo de áreas de mineralização da matriz extracelular (MOURA et al., 2007). Como o potencial osteogênico de culturas celulares está diretamente ligado ao processo de diferenciação osteoblástica que ocorre in vitro, o objetivo do presente projeto é avaliar, por PCR Array, a expressão de genes relacionados à osteogênese ao final da fase proliferativa de culturas osteogênicas crescidas sobre substratos vítreos e vitrocerâmicos bioativos. Serão também avaliados os aspectos morfológicos das culturas, com marcadores do início da diferenciação osteoblástica (fosfatase alcalina e sialoproteína óssea). Auxílio à Pesquisa Regular - Processo FAPESP 2010/16943-3. Valor total: R$ 113.741,27.

O agregado de trióxido mineral (MTA) tem-se demonstrado aplicável em diversas situações na Endodontia. Contudo, desvantagens relacionadas ao seu elevado custo, propriedades físico-químicas e dificuldade de manuseio têm limitado sua utilização. Neste sentido, um novo cimento de aluminato de cálcio, composto de Al2O3, CaO e aditivos, foi desenvolvido para superar algumas características negativas do MTA, mantendo, no entanto, suas propriedades satisfatórias. O objetivo deste estudo será avaliar diferentes aspectos da progressão de culturas de células osteogênicas primárias e de células indiferenciadas da polpa dental (linhagem OD-21), expostas a diferentes preparações do cimento de aluminato de cálcio, utilizando MTA como controle. Serão avaliados os seguintes parâmetros: 1) dissolução do elemento cálcio no meio de cultura, aos 3 dias; 2) morfologia celular, em 1 e 3 dias; 3) viabilidade celular, índice de proliferação e número total de células, em 1, 3, 7 e 10 dias; 4) imunolocalização de proteínas da matriz extracelular, em 1, 3 e 7 dias; 5) expressão de RNAm para genes relacionados a diferenciação osteoblástica e odontoblástica, em 7 e 10 dias; 6) atividade de fosfatase alcalina, em 3, 7 e 10 dias; 7) proporção de células em apoptose, em 10 dias; 8) formação de matriz mineralizada, aos 14 dias. Auxílio à Pesquisa Regular - Processo FAPESP 2010/50936-4 - Valor total: R$ 158.375,31.