Deborah Schechtman.

Opioides tem um efeito viciante e seu uso contínuo leva à tolerância e efeitos colaterais indesejáveis. Desta forma, existe uma grande necessidade de se buscar novos analgésicos que os substituam. Nesse sentido compreender as vias de sinalização da dor poderá auxiliar no desenvolvimento de novas classes de analgésicos. A dor inflamatória inicia-se com a liberação do fator de crescimento neural (NGF) e a ativação do seu receptor de alta afinidade, o receptor de tropomiosina quinase A (TrkA) nos neurônios sensoriais periféricos, seguida da despolarização neuronal atingindo o sistema nervoso central (CNS). Pelo fato da TrkA também ser uma quinase chave no desenvolvimento do sistema nervoso sensorial, diversas mutações nesta quinase levam à Analgesia Congênita Com Anidrose (CIPA), que é a falta de dor nociceptiva. A dor crônica envolve o Long-term potentiation (LTP) que é o fortalecimento e a formação de sinapses duradoras, importante para a aprendizagem e memória. Esse processo leva a um remodelamento cerebral, principalmente ao nível do córtex cingulado anterior (ACC), no caso da dor crônica. Uma das principais quinases envolvidas no estabelecimento do LTP é a Proteina quinase C M zetaz (PKMz). Entretanto, o papel dessa quinase neste processo ainda não foi elucidado. Novas estratégias para o desenvolvimento de analgésicos têm a TrkA como alvo no sistema nervoso periférico, e em nível central busca-se inibir o remodelamento do sistema nervoso central. No presente projeto visamos estudar as vias envolvidas na transmissão do sinal da dor inflamatória em nível sensorial pelo NGF e a TrkA e, em nível central, as vias que levam ao estabelecimento do LTP e dor crônica. Para tanto, estudaremos mutações da TrkA, encontrados em pacientes com CIPA, mapearemos as alterações moleculares causadas pelas mutações nas vias de sinalização da dor, e no desenvolvimento do sistema nervoso sensorial (utilizando embriões de galinhas). Identificaremos e caracterizaremos novos moduladores farmacológicos da atividade da TrkA que apresentem um efeito na dor inflamatória. Determinaremos os fatores epigenéticos e vias de sinalização que modulam a expressão da PKMzz e como estes fatores influenciam a expressão da mesma perante a dor crônica. Identificaremos substratos e proteínas parceiras da PKMz e validaremos o seu papel no estabelecimento do LTP, remodelamento cerebral e dor crônica.

A dor física é subdividida em nociceptiva e neuropática. A dor nociceptiva se dá devido à ativação dos receptores nociceptivos e a dor neuropática é causada por uma lesão ou doença do sistema somatosensorial considerada uma dor patológica. Ambos os sistemas podem levar à dor crônica, cujo tratamento ainda é um grande desafio. Dessa forma, torna-se necessário compreender as vias de sinalização que levam à dor para se desenvolver novos medicamentos com maior eficácia e tolerância. O fator de crescimento neural (NGF) tem um papel central nos mecanismos de dor. Trabalhos recentes com antagonistas do NGF ou do seu receptor de alta afinidade, receptor de tropomiosina quinase A (TrkA), um receptor de alta afinidade pelo NGF acoplado a uma tirosina quinase, mostraram ser eficazes em modelos animais de dor aguda e crônica, sem efeitos colaterais. Dessa forma, a TrkA e as vias ativadas por essa quinase tornam-se bons alvo para o desenvolvimento de novas drogas para a dor. Mutações na TrkA no domínio quinase levam ao desenvolvimento da insensibilidade congênita à dor com anidrose (CIPA) e a menor sensibilidade a dor causada por calor ou pimenta do Naked mole rat se deve em parte por uma menor atividade da TrkA. Entretanto como essas mutações afetam a quinase e as vias de sinalização desencadeadas por ela ainda não é bem compreendido. No presente projeto, pretendemos usar nossa expertise em quinases para estudar estruturalmente a TrkA e mutações nesta quinase que levam à CIPA, ou à diminuição da percepção da dor. Também pretendemos identificar substratos e caracterizar a dinâmica das vias de sinalização desencadeadas após ativação da TrkA pelo NGF e desenvolver um ensaio celular para o rastreamento de novos compostos que possam servir de base para o desenvolvimento de novos analgésicos mais específicos, tendo a TrkA como alvo.

Dados da literatura sugerem que um dos problemas para se estudar o papel das proteina quinase C (PKC) é o fato de que não existem ferramentas que possam distinguir especificamente as formas inativa das ativas das diferentes isoenzimas das PKCs. Diferentemente de outras quinases como, por exemplo, ERK e JNK em que a ativação das mesmas se da por fosforilações da alça de ativação. As fosforilações sofridas pelas PKCs clássicas em particular, fazem parte do processo de maturação/ enovelamento dessas quinase não se correlacionando com a ativação das mesmas. A ativação completa das cPKCs se da pela ligação a lipídeos ativadores e mudanças conformacionais que expõem os sítios de interação com o substrato e de ligação ao ATP. Com base nas mudanças conformacionais que ocorrem nas cPKCs perante a ativação das mesmas, nosso grupo desenvolveu anticorpos poli e monoclonais que reconhecem especificamente as cPKCs ativas. No presente projeto desejamos continuar a caracterização desses anticorpos e com essas ferramenta inovadoras em mãos nos propomos a estudar a atividade e interação das cPKCs com seus substratos em uma linhagem de câncer de mama positivas para o receptor de estrogênio (ER+) e triplo negativos e em amostras de pacientes com esses sub-tipos de tumores. Também verificaremos a ativação das cPKCs e em outros modelos, utilizando estes anticorpos.

Bolsa de Pesquisa - Exterior FAPESP

No presente estudo propomos identificar as redes sinápticas regulatórias associadas às PKCs que sofrem mudanças significativas durante o vício (a cocaína e morfina), bem como desenvolver moduladores que terão como alvos específicos essas redes e avaliar o efeito dos mesmos no vício.

Nos últimos anos nosso laboratório vem caracterizando o papel das proteínas quinases C (PKC) em células tronco embrionárias (CTE) indiferenciadas. Nossos dados sugerem que a maioria dos substratos da PKC²I em CTE indiferenciadas são proteínas nucleares que regulam a transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Estudos recentes também constataram a presença da PKC²I no núcleo de células de tumor de mama e de próstata. Estes estudos determinaram que a PKC²I regula a fosforilação da Histona H3 nestas células e consequentemente a metilação da mesma que por sua vez controla a expressão de genes envolvidos na proliferação das células tumorais. Juntos, estes dados contribuem para a hipótese de que a PKC²I possa estar envolvida em processos de proliferação e auto-renovação tanto de CTE como de tumores de próstata e mama. Dessa forma, a serina/ treonina quinase, PKC²I pode ser importante para a auto-renovação das CTE bem como um alvo chave para estratégias terapêuticas e de prognóstico de câncer de mama e de próstata. Ainda não se conhecem os mecanismos que levam à translocaçao nuclear da PKC²I bem como proteínas que interagem com esta quinase. Além disso, até o presente poucos alvos da PKC²I foram caracterizados. Dessa forma, acreditamos que a elucidação da função da PKC²I em CTE, ou em células de câncer de mama e próstata permitirá o melhor entendimento do processo de auto-renovaçao nesses tipos celulares. Além disso, tais estudos possibilitará o desenho racional de novos fármacos que tem como alvo a PKC²I. Para tanto, necessitamos desenvolver novas ferramentas para se estudar a estrutura da PKC²I bem como caracterizar as proteínas parceiras dessa quinase. Nesse sentido, no presente projeto visamos desenvolver anticorpos conformacionais que possam ser utilizados para a caracterização estrutural e funcional das PKCs em CTE indiferenciadas, câncer de mama e de próstata.

Células tronco embrionárias (CTE); proliferam mantendo a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares (auto-renovação). Para o uso eficiente das CTEs na terapia celular é necessário conhecer os processos moleculares específicos da diferenciação e da auto-renovação das CTE. A família das serina/ treonina quinases proteínas quinases C (PKC) vem sendo apontada como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das CTEs. Todavia, a função exata de cada isoforma dessa família composta por 10 isoenzimas ainda não está clara. Nos últimos anos nosso laboratório vem caracterizando o papel das diferentes isoenzimas das PKCs em CTE indiferenciadas. Nossos dados sugerem que dentre as PKCs expressas em CTE, formas de peso molecular menor da PKCβI são expressas no núcleo das CTE murinas. Além disso, estudos de fosfoproteômica indicam que a maioria dos substratos da PKCβI em CTE indiferenciadas são proteínas nucleares que regulam a transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Constatamos também que durante a diferenciação ocorre uma mudança de localização sub-celular da PKCβI que passa a ser expressa no citoplasma de várias células diferenciadas, e que algumas células diferenciadas deixam de expressar a PKCβI. Juntos, estes dados contribuem para a hipótese de que a PKCβI possa estar envolvida em processos importantes das CTE indiferenciadas, como por exemplo, a manutenção do seu estado indiferenciado. Desta forma, o presente projeto visa estudar a função da PKCβI por meio da identificação e modulação da interação da PKCcom as suas proteínas parceiras em CTE murinas indiferenciadas, o que poderá ser fundamental para a elucidação das cascatas de sinalização que levam à auto-renovação das CTE. Como a auto-renovação é um dos processos fundamentais na carcinogênese, estes resultados poderão ser utilizados posteriormente para o estudo de vias de sinalização com m

Células tronco embrionárias (CTE) proliferam indefinidamente mantendo a
capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares (auto-renovação). Para o uso
eficiente das CTEs na terapia celular necessita-se ainda desvendar os processos
moleculares específicos da diferenciação e auto-renovação das CTE. Nos últimos
anos, nosso laboratório vem caracterizando o papel das diferentes isoenzimas das
Proteínas Quinases C (PKCs) em CTE indiferenciadas. Vimos que dentre as
isoenzimas das PKCs expressas em CTE, formas de peso molecular menor da
isofoenzima βI (possivelmente cataliticamente ativas) são expressas no núcleo das
CTE murinas. Adicionalmente, observamos que durante a diferenciação das CTE
ocorre uma mudança de localização sub-celular da PKCBeta I que passa a ser expressa no citoplasma de várias células diferenciadas, dentre as quais algumas células deixam de expressar a PKCbeta 1. Além disso, nossos estudos de fosfoproteômica indicam que a maioria dos substratos da PKCbeta 1 em CTE indiferenciadas são proteínas nucleares que regulam a transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Juntos, estes dados contribuem para a hipótese de que a PKCbeta 1 possa
estar envolvida em processos importantes das CTE indiferenciadas, como por exemplo,
na manutenção do seu estado indiferenciado. Vimos também que a PKCdelta está
envolvida na proliferação das CTE indiferenciadas via a ativação da via das MAPK, e
que a PKCdelta articipam de processos de remodelamento do citoesqueleto e
possivelmente de processos de adesão célula/ célula das CTE indiferenciadas. Desta
forma o presente projeto visa dar continuidade aos nossos estudos anteriores
caracterizando as vias de sinalização da PKCzeta e lambda e a importância destas
isoenzimas para a auto-renovação e eventos inicias de diferenciação das CTE murinas

O tecido cardíaco é composto dentre outras células, de cardiomiócitos terminalmente diferenciados, cuja perda decorrente de lesões, quase sempre é irreparável. Idealmente substituiríamos cardiomiócitos danificados, por células novas. Entretanto, como cardiomiócitos não replicam em cultura isto não é possível. Uma alternativa para o reparo do tecido cardíaco danificado é a reposição celular por meio do uso de células tronco. Células tronco embrionárias (CTE) proliferarem indefinidamente, mantendo a capacidade de se diferenciarem em vários tipos celulares (auto-renovação). Para o uso eficiente das CTE na terapia celular necessitamos desvendar processos específicos da diferenciação das CTE bem como os mecanismos que mantém as CTE indiferenciadas. Uma estratégia para a identificação das cascatas de sinalização que levam à proliferação e auto-renovação das CTE é a interferência seletiva sobre vias específicas. A família das proteínas cinases C (PKC) vem sendo apontada como serina/ treonina cinases chaves dos processos de proliferação e diferenciação das CTE. Porém, o papel exato destas enzimas ainda não está claro. Desenvolvemos moduladores específicos para as diferentes isoenzimas das PKCs, com eles é possível desvendar o papel específico destas cinases. Neste projeto propomos identificar e caracterizar substratos (diretos e/ou indiretos) para as diferentes isoenzimas das PKCs utilizando peptídeos moduladores específicos para estas enzimas acoplado a técnicas de proteômica. A identificação e caracterização de substratos das PKCs nos ajudará a desvendar cascatas de sinalização das CTE nos auxiliando a entender processos de proliferação e auto-renovação destas células. Estes estudos servem de base para futuros estudos que visam a aplicação clínica destas células na terapia celular.

O tecido cardíaco é composto dentre outras células, de cardiomiócitos terminalmente diferenciados e componentes vasculares, ambos de origem mesodérmica, que são imprescindíveis para o órgão desempenhar suas funções ao longo da vida de um indivíduo. A falta de qualquer destes componentes contribui para a perda de eficiência do coração como bomba. Em um primeiro momento isto pode ser remediado graças a uma tremenda capacidade de reserva funcional que se manifesta pela ativação de um conjunto orquestado de mecanismos compensatórios. A medida que esta capacidade se esgota, entretanto,o organismo torna-se refém de um quadro progressivo associado a um aumento importante da morbi-mortalidade, cuja expressão social decorre da alta prevalência das doenças cardiovasculares na população mundial e da insuficiência cardíaca ser uma via final comum de vários acometimentos cardíacos. Ao longo das últimas quatro décadas várias descobertas, incluindo o desenvolvimento de fármacos, a implantação da cirurgia de revascularização e mais recentemente os procedimentos hemodinâmicos caracterizados pela dilatação das obstruções vasculares e colocação de stents recobertos com drogas, impactaram favoravelmente na diminuição deste problema de saúde mas, infelizmente, continuam insuficientes para atender ao crescente número de indivíduos acometidos. O transplante cardíaco, que representaria uma alternativa, não passa de uma curiosidade médica quando se considera o número daqueles que se beneficiam frente a demanda. O reconhecimento de que células embrionárias e adultas tem o potencial de se diferenciar em células especializadas como cardiomiócitos e componentes vasculares abre perspectivas para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas baseadas na reparação cardíaca biológica que venham somar aos procedimentos disponíveis.

No tecido cardíaco encontramos cardiomiócitos terminalmente diferenciados, cuja perda, quase sempre é irreparável. Idealmente cardiomiócitos danificados, seriam substituídos por células novas. Como cardiomiócitos não se replicam em cultura não é possível implantarmos cardiomiócitos adultos substitundo os danificados. Uma alternativa seria a reposição celular por meio do uso de células tronco. Células tronco embrionárias (CTE) além de proliferarem indefinidamente, se diferenciam em vários tipos celulares (auto-renovação). O controle da diferenciação das CTE para tecidos específicos constitui-se hoje em um grande desafio. Uma estratégia para a identificação de mecanismos que levam à proliferação e diferenciação das CTE é a interferência seletiva sobre vias de sinalização. A proteína kinase C (PKC) é uma enzima chave nos processos de proliferação e diferenciação das CTE. Porém, o papel exato destas enzimas nestes processos ainda não está claro, em parte porque as PKCs são dez isoenzimas; e, somente recentemente desenvolveu-se inibidores e ativadores específicos para as diversas isoenzimas. Neste projeto temos como objetivo identificar: a) as isoenzimas específicas da PKC envolvidas na proliferação; auto-renovação e diferenciação das CTE para cardiomiócitos e b) proteínas e substratos que se ligam especificamente as diferentes isoenzimas da PKC. Utilizaremos métodos de proteômica, bem como moduladores específicos para as diferentes isoenzimas de PKC para dissecar vias de sinalização que levam à proliferação, auto-renovação e diferenciação das CTE para cardiomiócitos. Possibilitando o estabelecimento de métodos de cultivo que permitam a reprodução perpétua e a capacidade de auto-renovação das CTE bem como a identificação de fatores que levam à diferenciação das CTE para cardiomiócitos nos ajudando a atingir o nosso objetivo final, que é o uso eficaz das CTE diferenciadas em cardiomiócitos para o reparo de lesões no tecido cardíaco.