Marinilce Fagundes dos Santos.

Utilizando sistemas in vitro e in vivo temos aprofundado os estudos sobre o papel da hiperglicemia crônica presente no Diabetes Mellitus (DM) sobre a migração e função de fibroblastos. A cicatrização deficiente é uma complicação comum do DM e contribui para a formação de feridas crônicas, que diminuem a qualidade de vida dos pacientes e acarretam enormes custos ao sistema público de saúde. Demonstramos efeitos deletérios da glicose elevada sobre a migração destas células, que foram revertidos na presença de um antioxidante. Demonstramos também que a administração sistêmica ou tópica de antioxidantes (como vitaminas C e E, proantocianidinas, mel) acelerou significativamente a cicatrização cutânea em camundongos diabéticos. Utilizando fibroblastos primários e linhagem de fibroblastos NIH-3T3 identificamos um miRNA regulado pela glicose de maneira dependente do estresse oxidativo, capaz de modular alguns aspectos da migração celular: o miR-31. Outro miRNA regulado pela glicose elevada com potenciais efeitos sobre a migração celular é o miR-29c, que também pode modular a composição da matriz extracelular (MEC), alterando o microambiente cicatricial. Como fator estressor, a glicose elevada pode acelerar o envelhecimento de fibroblastos, induzindo um fenótipo associado à senescência (SASP). Fibroblastos SASP, por meio da secreção de citocinas, metaloproteases e fatores de crescimento, podem regular a atividade de outros tipos celulares e modificar o microambiente, favorecendo um envelhecimento de todo o tecido. O papel da glicotoxicidade no envelhecimento de fibroblastos, no entanto, ainda é pouco conhecido; menos ainda se sabe sobre o potencial envolvimento de miRNAs neste processo. Neste projeto pretendemos avaliar, em camundongos normoglicêmicos e hiperglicêmicos, o processo de senescência celular na derme durante a cicatrização de feridas, na presença e ausência de um tratamento com antioxidantes. In vitro, utilizando fibroblastos humanos, pretende-se estudar o papel da glicose elevada e consequente estresse oxidativo sobre a expressão de miR-146b e miR-29c, seu potencial envolvimento na senescência e migração celulares em matrizes de colágeno I (2-D e 3-D). Potenciais alvos serão identificados e validados por meio de ensaios de luciferase. Na derme, processos relacionados à migração celular, produção de MEC e senescência são essenciais para a homeostase tecidual e cicatrização; sendo assim, existe um interesse considerável na compreensão dos efeitos da hiperglicemia sobre estes processos, especialmente em áreas voltadas para a biotecnologia. A identificação de potenciais agentes reguladores, como por exemplo antioxidantes e reguladores da expressão de miRNAs (miR mimics ou antagomiRs) é de grande interesse. Trata-se de uma avaliação importante e pioneira e os resultados obtidos poderão, eventualmente, servir como base para tratamentos senolíticos visando limitar o efeito de células senescentes sobre o envelhecimento do tecido.

Pesquisadora associada no projeto sediado na Universidade Estadual de Campinas e coordenado pelo Prof. Dr. Hernandes F. Carvalho.

A cicatrização deficiente em indivíduos diabéticos é uma das complicações mais comuns da hiperglicemia (HG) e está associada à microangiopatia, neuropatia e alterações funcionais de fibroblastos. Estes constituem o principal tipo celular do tecido conjuntivo, sendo responsáveis pela síntese, organização e renovação da matriz extracelular (MEC). Alguns estudos utilizando fibroblastos obtidos de pacientes diabéticos, ou fibroblastos cultivados em condições que simulam a HG, demonstraram alterações na proliferação celular e síntese de proteínas da MEC. Poucos estudos, no entanto, abordaram os efeitos da HG sobre o comportamento migratório destas células, sobre as propriedades físicas da MEC e sobre a sua renovação, aspectos essenciais para a cicatrização tecidual. Estudos prévios deste grupo mostraram que fibroblastos derivados da derme de ratos diabéticos ou expostos in vitro a uma elevada concentração de glicose migram menos sobre substratos bidimensionais (2-D) constituídos por fibronectina ou colágeno I. Nestas condições as células apresentam velocidade e direcionalidade reduzidas, maior número de protrusões celulares simultâneas e não produtivas (retráteis) e menor amadurecimento das adesões celulares junto à MEC. Estes efeitos foram revertidos na presença do antioxidante N-acetilcisteína (NAC). Não estão suficientemente esclarecidos, no entanto, os efeitos da HG sobre a migração de fibroblastos em ambientes tridimensionais (3-D), que simulam melhor uma condição in vivo, assim como seus efeitos sobre a síntese de MEC, o que altera, por sua vez, a migração destas células. Recentemente, microRNAs (miRs) foram demonstrados como importantes moduladores da migração celular (miR-31, p.ex.) e da síntese de MEC (miR-196a e miR-29b, p.ex.). MicroRNAs são reguladores pós-transcricionais da expressão gênica, promovendo a degradação de mRNAs alvo, ou bloqueando sua tradução. Nós demonstramos previamente que a expressão de miR-31 aumentou cerca de 3 vezes em fibroblastos obtidos de animais diabéticos, quando comparados com fibroblastos de animais controle. Em fibroblastos NIH-3T3, a HG aumentou a expressão de miR-31 em 50 após 3 dias de exposição. Nestas células, o tratamento com o antioxidante NAC preveniu o aumento do miR-31, mantendo-o em níveis normais, e evitando o aumento no número de protrusões não efetivas. Uma hipótese deste projeto é que a glicose elevada regula a expressão de miR-31 através da geração de espécies reativas de oxigênio. Este miR, por sua vez, regula negativamente a expressão de proteínas importantes para o processo de migração celular. Outros miRs potencialmente relevantes que regulam a MEC, como miR-196a e miR-29b, alterados durante a fase final de remodelação da MEC na cicatrização cutânea de diabéticos, também podem ser menos expressos em fibroblastos, alterando a proporção colágeno III/colágeno I e fibronectina.

Independentemente de sua etiologia, o Diabetes Mellitus (DM) é uma doença caracterizada pela hiperglicemia crônica. Os principais mecanismos envolvidos nas complicações de longo prazo do DM são o estresse oxidativo e a glicação de moléculas. Uma das complicações mais comuns é a deficiência na cicatrização de feridas, que reduz significativamente a qualidade de vida dos pacientes, por contribuir para a formação de feridas crônicas. Na cicatrização tecidual, proliferação e migração de fibroblastos são processos essenciais. Poucos estudos têm demonstrado o papel da hiperglicemia sobre a função de fibroblastos, especialmente sobre sua atividade migratória. Estudos deste laboratório mostraram que a hiperglicemia afeta negativamente a migração de fibroblastos, com redução da velocidade e direcionalidade celulares, tanto em matrizes bidimensionais quanto em matrizes tridimensionais. A maturação das adesões junto ao substrato também foi reduzida pela glicose elevada, um processo que depende da contratiidade celular. Adicionalmente, a expressão de algumas integrinas na superfície celular estava reduzida. Na migração celular, o arranjo do citoesqueleto de actina e microtúbulos são dependentes de um grupo de GTPases pertencentes à família Rho. Além da migração celular, estas proteínas regulam também outros processos como a apoptose, proliferação celular e expressão gênica. GTPases Rho podem ser ativadas por uma variedade de estímulos e exercem suas funções por intermédio de diferentes proteínas efetoras, cuja expressão pode ser tecido-específica. A regulação destas proteínas é bastante complexa; esta complexidade, no entanto, aumentou muito após a descoberta dos microRNAs (miRs) e seu potencial papel regulatório sobre a migração celular. Ainda é escassa a informação sobre a regulação de GTPases Rho por miRs, assim como sobre a regulação de miRs pela hiperglicemia. Este projeto pretende avaliar, pioneiramente, os efeitos da hiperglicemia sobre a expressão de miR-31 e miR-146b em fibroblastos derivados de ratos normoglicêmicos e diabéticos, assim como o papel destes miRs sobre a migração celular, arranjo do citoesqueleto e expressão de seus alvos potenciais. O papel dos miRs sobre a migração será avaliado por meio de sua supressão ou superexpressão em fibroblastos. A escolha destes miRs baseou-se no fato de que ambos regulam a contratilidade celular via GTPases Rho, de maneiras distintas, e o miR-31 pode, potencialmente também regular a expressão de integrinas na superfície celular. Espera-se que os resultados obtidos no atual projeto possam contribuir para o desenvolvimento de terapias que acelerem a cicatrização tecidual, especialmente em diabéticos.

Pesquisadora colaboradora neste projeto coordenado pelo Prof. Dr. Hugo Aguirre Harmelin no Instituto Butantan

A migração celular é um processo essencial para o desenvolvimento, homeostasia tecidual, para o sistema de defesa, durante a cicatrização e também no desenvolvimento e progressão de diversas patologias, como por exemplo, no câncer. A invasividade tumoral está diretamente relacionada à capacidade das células tumorais de migrar e invadir tecidos vizinhos, disseminando-se via circulação sanguínea e linfática. Na cicatrização tecidual, proliferação e migração de fibroblastos são processos essenciais. O arranjo do citoesqueleto de actina e microtúbulos e o comportamento migratório celular são dependentes de um grupo de proteínas sinalizadoras de baixo peso molecular com atividade GTPásica pertencentes à família Rho. Além da migração celular, estas proteínas regulam também outros processos como a apoptose, proliferação celular e expressão gênica. GTPases Rho podem ser ativadas por uma variedade de estímulos e exercem suas funções por intermédio de diferentes proteínas efetoras, cuja expressão pode ser tecido-específica. A regulação destas proteínas é bastante complexa; esta complexidade, no entanto, aumentou significativamente após a descoberta dos microRNAs (miRNAs) e seu potencial papel regulatório sobre a migração celular. Em diversos tipos de câncer, por exemplo, a alteração da expressão de miRNAs tem sido relacionada ao comportamento invasivo. Ainda é escassa a informação sobre a regulação de GTPases Rho por miRNAs. Da mesma forma, no Diabetes Mellitus sabe-se que a cicatrização é deficiente, em parte devido a uma deficiência na migração e proliferação de fibroblastos. No entanto, os mecanismos envolvidos na inibição da migração ainda não estão esclarecidos; não é conhecido o papel dos miRNAs na migração destas células, e menos ainda o potencial efeito regulatório da hiperglicemia sobre a expressão de miRNAs. Este projeto consiste de dois subprojetos que pretendem avaliar, pioneiramente, o papel de diferentes miRNAs sobre a atividade de GTPases Rho e comportamento m

O projeto é coordenado pela Profa. Dra. Edna Kimura e envolve pesquisadores de diferentes Instituições de ensino e pesquisa. O objetivo é estudar o papel de microRNAs em diferentes sistemas e organismos. Nossa parte é o estudo da regulação de vias de sinalização envolvidas na migração e adesão celulares por microRNAs. Neste projeto estudamos a regulação da migração e invasão de células tumorais e também os efeitos do diabetes mellitus sobre a expressão de microRNAs que regulam a migração de fibroblastos periodontais.

Diabetes Mellitus (DM) é uma doença crônica que acomete mais de 150 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que o Brasil encontra-se entre os dez países com maior incidência desta patologia. O Sistema Hiperdia aponta cerca de 1.940.192 portadores de DM cadastrados e acompanhados na rede básica do SUS, sendo 469.783 no estado de São Paulo. Estima-se que o número real de portadores seja ainda maior, considerando-se indivíduos não diagnosticados e não cadastrados. Independentemente de sua etiologia, o DM é definido pela OMS como um grupo de desordens metabólicas caracterizadas por hiperglicemia crônica. Esta hiperglicemia causa complicações variadas, dentre elas uma deficiência no processo cicatricial que leva ao aparecimento de feridas cutâneas crônicas. Esta complicação, de etiologia multifatorial e ainda pouco esclarecida, ocorre em cerca de 15% dos pacientes, reduz significativamente sua qualidade de vida e acarreta enormes despesas para o sistema público de saúde. Demonstramos recentemente, pela primeira vez, que elevadas concentrações de glicose suprimem a migração de diversos tipos celulares, inclusive fibroblastos, células que exercem um papel central na fisiologia da derme e no processo de cicatrização (Lamers et al., submetido). Este efeito da glicose é, em grande parte, dependente de espécies reativas de oxigênio geradas a partir de vias metabólicas alteradas no estado hiperglicêmico. Neste projeto pretendemos avaliar a eficácia do tratamento sistêmico e tópico com anti-oxidantes (vitaminas C e E) sobre a cicatrização cutânea em animais diabéticos. O tratamento tópico será realizado com lipossomos, que permitem penetração dérmica mais eficiente e liberação sustentada, protegendo as vitaminas de fotodegradação. Serão avaliados a cinética de cicatrização, presença de miofibroblastos, alterações de matriz extracelular e expressão de diversas metaloproteinases (MMPs), sabidamente alteradas em feridas crônicas. In vitro, fibroblastos derivados de culturas primá

A hiperglicemia crônica, presente no diabetes mellitus, pode ser causada por uma deficiência na produção de insulina pelo pâncreas, na resposta das células à ação da insulina, ou ambos. A hiperglicemia pode, por exemplo, modificar proteínas intra e extracelulares através de glicação em suas porções amina, alterar o metabolismo celular pela formação de radicais livres e causar uma expressão aberrante de diferentes fatores de crescimento. Estes, atuando provavelmente em combinação, são responsáveis pelo desenvolvimento de complicações crônicas importantes, inclusive na microvasculatura (Chiarelli et al., 2000). Entre as estruturas mais susceptíveis à ação da hiperglicemia estão os vasos sangüíneos (arterioesclerose, microangiopatia) e neurônios (neuropatia). Adicionalmente, diversos órgãos são afetados pelo diabetes de maneira diferenciada, como p. ex. os rins e a retina, podendo chegar à falência funcional. Dentre as complicações mais comuns e relevantes da hiperglicemia encontra-se a cicatrização deficiente. Feridas crônicas e seu tratamento são um enorme fardo para o sistema público de saúde, tanto em termos de custo quanto da intensidade do cuidado requerido. O custo geral para a sociedade e para os indivíduos, principalmente, é perda de produtividade e de qualidade de vida. No centro deste processo encontra-se o fibroblasto, principal célula do tecido conjuntivo, responsável pela síntese e organização da matriz extracelular, dentre outras funções. Alguns estudos utilizando fibroblastos obtidos de pacientes diabéticos, ou fibroblastos cultivados em condições que simulam a hiperglicemia, demonstraram alterações na proliferação celular e síntese de proteínas de matriz. Poucos estudos, no entanto, abordaram os efeitos da hiperglicemia sobre o comportamento migratório destas células, um aspecto essencial no processo de cicatrização tecidual. Nosso laboratório possui experiência em estudos de migração celular, e ao longo dos últimos anos tem estudado a regulação da mi

Estudo com ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina

Equipamentos de micromanipulação

Setor de biologia molecular do departamento de Histologia e Embriologia

Adequação da infra-estrutura de laboratórios de pesquisa e de setor multiusuários

Melhoria qualitativa da infra-estrutura de laboratórios do Departamento de Histologia e Embriologia, ICB/USP

Melhoria da infra-estrutura de laboratórios de docentes e de laboratórios de uso comum do Departamento de Histologia e Embriologia, ICB/USP