Luis Eduardo Aranha Camargo.

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Genética e genômica aplicadas à identificação dos genes Zym-1 e Zym-2 de resistência do meloeiro a Zucchini yellow mosaic vírus
Processo:	19/13397-2
Linha de fomento:	Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência:	01 de dezembro de 2019 - 30 de novembro de 2021
Área do conhecimento:	Ciências Agrárias - Agronomia - Fitossanidade
Pesquisador responsável:	Luis Eduardo Aranha Camargo
Beneficiário:	Luis Eduardo Aranha Camargo
Instituição-sede:	Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ). Universidade de São Paulo (USP). Piracicaba , SP, Brasil
Pesq. associados:	
Gabriel Rodrigues Alves Margarido ; Jorge Alberto Marques Rezende
Assunto(s):	Genética vegetalMelãoCucumis meloMapeamento genéticoGenomasLoci gênicosResistência genética vegetalVirose vegetalMosaico (doença de planta)
Resumo
O controle do Zucchinni yellow mosaic virus (ZYMV) na cultura do melão se dá por meio do uso de variedades resistentes. O acesso PI414723 é a principal fonte de resistência utilizada em programas de melhoramento e sua resistência é controlada por um locus gênico de efeito fenotípico pronunciado e de herança dominante, denominado Zym-1, que está proximamente ligado ao marcador microssatélite CMAG36 situado no grupo de ligação II. A literatura indica ainda a possibilidade da existência de ao menos mais um locus de resistência neste acesso, denominado de Zym-2, com efeito fenotípico menos pronunciado e com possível interação epistática com alelos de Zym-1. Evidências geradas em nosso laboratório oriundas de análises efetuadas com mapas de ligação de baixa resolução indicam preliminarmente que Zym-2 provavelmente está localizado no grupo de ligação X. A disponibilização da sequência do genoma de melão trouxe a perspectiva de identificar a localização genômica destes dois loci bem como a de identificar os possíveis genes de resistência através da análise de seus contextos gênicos. Desta forma, este projeto objetiva alinhar as sequências dos cromossomos 2 e 10 com os grupos de ligação II e X respectivamente, e analisar a composição e a expressão de genes nos loci Zym-1 e Zym-2 na tentativa de identificar os genes de resistência ao vírus. No caso do segundo locus, no entanto, antes se fará necessária uma análise de ligação com um maior número de marcadores usando uma população F2 de 500 indivíduos oriunda do cruzamento entre `PI414273´ e a variedade suscetível `Védrantais`. Em complementação a estes objetivos, o projeto também caracterizará a natureza da resistência de `PI414273´ relativa à biologia do vírus. Para tanto, uma metodologia de quantificação do ZYMV por qPCR será desenvolvida e aplicada para determinar o efeito dos alelos de resistência nos dois loci sobre a replicação e translocação do vírus. (AU)

Podosphaera xanthii e Zucchini yellow mosaic vírus (ZYMV) estão entre os patógenos mais prejudiciais para a produção de melão no país. Com o objetivo de desenvolver estratégias de controle destes patógenos através de cultivares resistentes, será feita uma análise bioinformática da sequência do cromossomo 2 de melão visando identificar potenciais genes de resistência a estes patógenos. Para avaliar a funcionalidade destes, seus níveis de expressão serão avaliados por meio de PCR quantitativo em plantas do genótipo resistente PI414723 e do suscetível ?Védrantais? em resposta a infecção com o patótipo 0 de ZYMV e as raças 1,3 e 5 de P. xanthii. Ademais, com base na análise bioinformática, novos marcadores de motivos repetidos (microssatélite) e de sequência nucleotídica única (SNPs) serão desenvolvidos e utilizados em análises de ligação aos genes de resistência a P. xanthii (Pmx-3 e Pmx-1,5) e ao gene Zym-1 de resistência ao ZYMV.

A interação planta-microorganismos representa um dos processos de fundamental relevância para o funcionamento de ecossistemas naturais, bem como agrícolas. A compreensão de seus componentes e dos processos que controlam essa interação biológica tem potencial de melhorar a produtividade das culturas e monitorar a qualidade ambiental. Este projeto pretende contribuir na elucidação deste sistema complexo através da utilização de ferramentas moleculares e de bioinformática dos genomas para descobrir os principais genes que controlam e / ou medeiam a interação de cana de açúcar com três patógenos (Leifsonia xyli subsp xyli;. Xanthomonas albilineans; Sporisorium scitamineum) e uma bactéria fixadora de nitrogênio (Gluconacetobacter) considerada promotora de crescimento para a cana. Esses organismos têm uma interação biotrófica/hemibiotrófica com cana de açúcar e os aspectos moleculares sob estas condições são geralmente menos compreendidas. O nosso objetivo é comparar e contrastar respostas moleculares através das interações individuais tanto de cana de açúcar quanto dos microrganismos envolvidos. Especificamente, (i) analisaremos padrões de expressão de um conjunto de genes previamente identificados análogos a genes de resistência (RGA), espécies reativas de oxigênio (ROS), metabolismo de carboidratos, síntese de hormônios e seu controle, elementos de transposição, e uma família de genes relacionados com a edição de genes em organelas e conhecido por ter membros que estão envolvidos na regulação das defesas de plantas via Na-siRNA (pentatricopeptide) bem como de genes envolvidos em respostas metabólicas específicas dos microrganismos; (ii) avaliar e comparar entre espécies de microrganismos os padrões de expressão de genes microbianos com um foco particular em moléculas secretadas entre os quais esperamos encontrar moléculas efetoras; (iii) avaliar e comparar as mudanças nos padrões de expressão durante duas infecções mistas, e (iv) avaliar e comparar as mudanças no microbioma do hospedeiro, como resultado da interação com os micróbios mencionados. Como um produto de extensão, esperamos fornecer informações moleculares sobre a biologia da cana ao interagir com vários micróbios almejando o desenvolvimento de um kit de diagnóstico para monitorar canaviais e construir um banco de dados "phytobiome" de cana que seja abrangente e que poderia ser usado em estudos comparativos com outras Poaceae. (AU)

O objetivo de nosso grupo de pesquisa é o de entender a gênese do raquitismo das soqueiras (RSD) da cana-de-açúcar, uma doença causada pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). Análises recentes do transcritoma de plantas jovens infectadas por Lxx (Projeto Temático 2008/56296-2) sugeriram que a expressão diferencial durante o desenvolvimento da planta de genes envolvidos na regulação do ciclo celular e na produção de hormônios esteja intimamente associada aos sintomas do RSD. Todavia, como nossas análises foram realizadas com plântulas e os sintomas se manifestam somente em plantas adultas de soqueira, não foi possível correlacionar a expressão diferencial destes genes com as alterações morfológicas decorrentes doença. Presentemente, também não sabemos como estas alterações em expressão se traduzem em alterações metabólicas na planta. Além disto, por consideramos Lxx um organismo endofítico de cana que apresenta um relacionamento dual (parasítico/mutualístico) em relação ao seu hospedeiro, trabalhamos com a hipótese de que algumas destas alterações metabólicas podem também estimular o crescimento da bactéria e, para que isto aconteça, o patógeno deve ser capaz de reagir a estresses comumente impostos pelo hospedeiro. Desta forma, os objetivos desta proposta são o de comparar tanto os perfis metabólicos de folha e de seiva de xilema de plantas infectadas de duas variedades de cana contrastantes para o nível de multiplicação da bactéria em seus tecidos, como a anatomia de células meristemáticas de plantas infectadas. Além disto, a proposta contempla a análise funcional in vitro de genes de Lxx similares a genes bacterianos de resposta a estresse oxidativo e osmótico.

A importância econômica da cultura do meloeiro para o país pode ser expressa pelo valor de exportação do fruto in natura alcançado em 2010, que achegou a 177 mil toneladas e gerou aproximadamente U$ 122 milhões de dólares em divisas. (IBRAF, 2011). A maior parte da produção está centrada nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. O controle de enfermidades que acometem o meloeiro reveste-se de grande importância, já que estas respondem por grande parte das perdas inerentes ao processo produtivo. O mosaico amarelo, causado por Zucchini yellow mosaic virus, destaca-se como uma das viroses mais importantes da cultura e seu controle, bem como o das demais doenças, se baseia principalmente no uso de variedades resistentes. O acesso PI414723 é resistente ao vírus, mas a herança genética desta característica é complexa, o que dificulta a fixação do caráter em linhagens melhoradas. Embora o volume de publicações sobre o assunto seja muito escasso dada a importância da doença, evidências apontam para a existência de três genes, denominados de Zym-1, 2 e 3. A localização genética do primeiro já foi feita por meio de marcadores moleculares, mas a dos outros dois permanece desconhecida. Em grande parte, isto se deve ao fato da ausência de um estudo que avalie a resistência ao Zymv como uma característica quantitativa. Desta forma, o presente projeto avaliará a resistência de uma população F2 oriunda do cruzamento PI414723 x Védrantais através da quantificação do título viral, por meio de teste sorológico, de aproximadamente 150 plantas inoculadas artificialmente como um isolado do patótipo 0 e mantidas em casa-de-vegetação. Estes mesmos indivíduos serão genotipados com marcadores moleculares do tipo SSR, AFLP e TRAP com a finalidade de construir um mapa genético. Por fim, locos de resistência quantitativa (QTL) serão identificados no mapa genético através da análise conjunta de valores fenotípicos de cada planta e de seus genótipos nos vários locos marcadores por meio da técn

O meloeiro é uma cultura de grande importância econômica para o comércio de exportação brasileiro, principalmente no que se refere à produção da região Nordeste do Brasil. A produção da cultura pode ser limitada por uma doença denominada oídio, sendo no Brasil causada pelo fungo Podosphaera xanthii. Este patógeno apresenta diversas raças, caracterizadas com base na reação de cultivares diferenciadoras de meloeiro. Os genótipos usados na diferenciação das raças também podem ser empregados como doadores de alelos de resistência a P. xanthii, visto que o controle da doença, em geral, é obtido com o uso de linhagens resistentes. Desta forma, estudos sobre a herança da resistência às várias raças de P. xanthii são determinantes para a obtenção de variedades resistentes. Dentre estes genótipos, pode-se citar PI 414723, que é resistente a maior parte das raças de P. xanthii descritas atualmente. Além de resistente, esta linhagem apresenta pontos amarelados, que posteriormente necrosam mesmo na ausência de patógenos, sendo esta característica denominada necrose autogênica. Até o momento não há trabalhos precisos sobre o modo de herança desta característica. Sendo assim, o presente trabalho objetiva: (i) avaliar a segregação da resistência às raças 1, 2-francesa e 5 de P. xanthii em indivíduos da geração F2 do cruzamento PI 414723 x Védrantais; (ii) mapear os gene (s) de resistência às raças 1, 2-francesa e 5 de P. xanthii com base em marcadores AFLP, SSR e RGA em indivíduos da geração F2 do cruzamento PI 414723 X Védrantais; (iii) determinar condições experimentais que induzam à necrose autogênica na introdução PI 414723, PMR 45, PMR 5 e PMR 6 e (iv) avaliar a herança da característica necrose autogênica em indivíduos da geração F2 do cruzamento PI 414723 x Védrantais.

The main objectives are to establish a time course of colonization of sugarcane by Lxx and to use this information to monitor gene and protein expression of a resistant and a susceptible sugarcane variety based on global gene expression profiles and 2-D LC-MS/MS protein analysis and sequencing. In addition, we propose to characterize the biological effects of a putative toxin-like compound secreted by Lxx on sugarcane plantlets and to clone and express the genes supposedly involved in its production in E. coli. 
The proposal explores available genomic data both on the host and on the pathogen and will lead to the identification of sugarcane defense genes involved in the reaction to Lxx. This set of genes comprises a valuable source of candidate resistance genes so that the effects of these genes on resistance can be further assessed by the scientific community either by a transgenic approach or by the candidate marker mapping approach. Regarding the latter approach it should be emphasized that this project is connected with a linkage mapping proposal submitted to the BIOEN so that our results will be of use in the near future.

Devido à importância econômica do eucalipto para o mundo e, principalmente, para o país, vários estudos vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de incrementar sua produção. O melhoramento genético destaca-se como a área mais promissora para atingir estes objetivos. A busca por genótipos resistentes à ferrugem, principal doença do eucalipto, tem sido, junto com alta produtividade e boa qualidade da madeira, uma dos principais objetivos dos programas de melhoramento de muitas empresas nacionais. Para facilitar a identificação de genótipos resistentes e reduzir os custos operacionais envolvidos em sua avaliação, a utilização de marcadores moleculares desponta como uma alternativa rápida e eficiente na seleção destes genótipos, a chamada seleção assistida por marcadores. Este projeto visa identificar marcadores moleculares ligados a genes de resistência à ferrugem do eucalipto com base na análise de indivíduos F1 oriundos de um cruzamento entre dois clones híbridos interespecíficos E. urophylla x E. grandis contrastantes para resistência ao fungo. Aproximadamente 4.000 indivíduos serão avaliados para resistência a ferrugem sob condições epidêmicas naturais em quatro locais com histórico de ocorrência severa da doença. A metodologia de análise de agrupamentos segregantes (bulked segregant analysis) será utilizada em conjunto com marcadores do tipo AFLP, microssatélites e análogos de genes de resistência (AGR) para identificar marcadores que estejam ligados a genes de resistência a este patógeno.

Em Fitopatologia, o termo ?grãos ardidos? se refere a grãos infectados por fungos. Entre estes, o de maior relevância é Fusarium verticillioides, uma vez que, além de causar podridões de espigas, também produz toxinas denominadas fumonisinas, que estão associadas a enfermidades em animais, incluindo humanos. Embora o conhecimento destas toxinas e de seus efeitos não seja recente, a preocupação de sua ocorrência em rações animais apenas agora toma efeito na forma de ações institucionais. Na União Européia, por exemplo, o controle de níveis de fumonisinas terá início em outubro de 2007, através do estabelecimento de níveis máximos toleráveis em diversos tipos de derivados de milho. No Brasil, ainda não há limites estabelecidos por lei, mas os órgãos governamentais se movimentam neste sentido através de normativas para padronização e classificação de grãos de milho e também de métodos de análises de fumonisinas.
A literatura nacional indica a ocorrência de fumonisinas em uma ampla gama de produtos alimentícios e também destaca F. verticillioides como o organismo toxigênico mais freqüente em grãos ardidos. No entanto, estes trabalhos não distinguem isolados potencialmente toxigênicos de não-toxigênicos, razão pela qual a incidência do primeiro tipo em nosso país permanece desconhecida. Além disto, embora existam relevantes levantamentos relativos a micoflora em grãos ardidos no país, estes não permitem estabelecer correlações entre possíveis variações na composição desta e variáveis geográficas, principalmente altitude e latitude, sazonais, relativas às duas estações de cultivo de milho, e genéticas, relativas ao hospedeiro. O presente projeto é o primeiro a ser desenvolvido no Laboratório de Genética Molecular na área de podridões de espiga e micotoxinas. Com ele, objetiva-se realizar um levantamento sistemático da micoflora associada a grãos ardidos de híbridos comerciais de milho com ênfase em Fusarium verticillioides e avaliar mecanismos de resistência de genótipos

A análise da seqüência do recém-publicado genoma de Lxx possibilitou a formulação de interessantes hipóteses sobre sua biologia, três das quais são temas deste projeto. De um lado, o projeto aborda a questão do hábito fastidioso de crescimento in vitro do organismo. A hipótese é que Lxx apresenta requerimentos nutricionais complexos devido a um conjunto de três fatores: a) não funcionalidade de genes (pseudogenes) de vias metabólicas importantes (como a de síntese de cisteína e metionina), b) ausência de importantes vias metabólicas (como as que levam à síntese de vitamina B12, biotina e tiamina) e c) inadequação do meio de cultivo comumente usado para Lxx no que tange as habilidades de utilização de fontes da carbono - Lxx apresenta transportadores de manose e frutose, por exemplo, que não fazem parte do meio de cultivo. Estas informações serão utilizadas com o intuito de formular meios de cultura mais adequados ao crescimento da bactéria. O estudo da fisiologia do crescimento de Lxx é de suma importância para o entendimento dos mecanismos de utilização de fontes de carbono e síntese ou obtenção de amino ácidos essenciais e vitaminas, mecanismos estes que, em última análise, são reflexos de sua adaptação ao habitat em que vive na planta, o xilema.
Uma segunda linha de pesquisa se dedicará a desenvolver estudos funcionais do gene Lxx22810, homólogo ao gene albF da também patógena de cana Xanthomonas albilineans, que codifica uma bomba de efluxo de toxina. Este será expresso em E. coli para avaliar a funcionalidade das respectivas proteínas no que toca resistência à toxina albicidina. Construções apropriadas serão criadas para que a proteína seja direcionada à membrana. A expressão será monitorada através da fusão do gene com o gene repórter GFP. Havendo funcionalidade neste nível, o passo seguinte contemplará a expressão destes genes em cana-de-açúcar, com o intuito de avaliar a resistência de plantas transgênicas à toxina produzida por X. albilineans. Em suma, o