Marcos Tulio de Oliveira.

Embora a oxidase alternativa mitocondrial (AOX) seja naturalmente ausente em vertebrados e insetos, tem sido demonstrado que sua expressão xenotópica em drosófilas e camundongos combate disfunções mitocondriais e relacionadas, com potencial para seu uso como enzima terapêutica humana no futuro. AOX é uma enzima da membrana interna mitocondrial que pode contornar os complexos III e IV da cadeia respiratória, fornecendo um caminho adicional para a redução de oxigênio e a reoxidação da coenzima Q e permitindo a continuação do fluxo metabólico em situações em que o sistema de transferência de elétrons esteja comprometido. Desde o início do projeto Jovem Pesquisador da FAPESP em 2014, meu novo laboratório na UNESP Jaboticabal tem estudado como a expressão de AOX influencia o desenvolvimento de Drosophila melanogaster e observado uma aceleração do metabolismo larval e acúmulo de biomassa de uma forma hormótica: a expressão em baixo nível estimula o crescimento tecidual, enquanto altos níveis o inibem e causam letalidade sob limitação nutricional. Como as mitocôndrias durante o crescimento tecidual integram o catabolismo de alimentos com a síntese de novas macromoléculas, levantamos a hipótese de que AOX força a transferência de elétrons através da cadeia respiratória, criando um equilíbrio fino entre um fluxo metabólico aumentado e um desacoplamento mitocondrial em excesso. Propomos, assim, testar tal hipótese em diversos modelos animais de crescimento tecidual e acúmulo de biomassa, incluindo a larva de drosófila em desenvolvimento, células cancerosas humanas em cultura e tumores de insetos, utilizando uma combinação de análises ômicas tecido-específicas e análises da função mitocondrial e formação de supercomplexos. O objetivo principal é demonstrar o potencial da AOX controlar a proliferação tecidual, estabelecendo a larva de drosófila como modelo para a compreensão do metabolismo do câncer.

O desacoplamento mitocondrial é um dos principais mecanismos celulares de produção de calor corpóreo, no qual a energia química usada para produção de ATP na cadeira respiratória (CR) é dissipada na forma de calor. Em plantas como a flor-de-lótus, a geração de calor nos órgãos florais é realizada pela presença na CR da oxidase alternativa (AOX), que contorna os complexos III e IV, sem bombear prótons para o espaço intermembranas, reduzindo assim o potencial eletroquímico usado para sintetizar ATP. Em animais, tal mecanismo ainda não foi descrito, provavelmente pelo fato dos grupos mais bem estudados, vertebrados e insetos, terem perdido independentemente o gene que codifica AOX ao longo da evolução. Interessantemente, quando AOX foi expressa transgenicamente em Drosophila melanogaster, camundongo e células humanas em cultura, a enzima mostrou-se funcional e proporcionou a estes modelos experimentais uma melhoria nas condições associadas a disfunções mitocondriais, mas suas possíveis consequências termogênicas ainda não foram analisadas. Este projeto visa investigar os efeitos fisiológicos e metabólicos da expressão de AOX em D. melanogaster, testando a hipótese de que a presença desta enzima aumenta a temperatura corpórea destes insetos. Linhagens expressando AOX em diferentes níveis serão submetidas a diferentes temperaturas, incluindo condições severas de estresse térmico, para analisar os efeitos fenotípicos, moleculares e bioquímicos desta enzima durante o desenvolvimento e na fase adulta dessas moscas. A combinação de análises de termografia de infravermelho, de expressão de genes de estresse térmico e do consumo de oxigênio mitocondrial irá certamente contribuir para o entendimento da biologia da AOX e de seu potencial termogênico em animais.

Mitocôndrias desempenham papeis fundamentais tanto no metabolismo energético quanto em sinalização em células eucarióticas. Essas organelas são responsáveis pela produção de ATP, e desempenham funções centrais na sinalização redox, homeostase de cálcio e sinalização apoptótica. Um aspecto particular da biologia mitocondrial é que essas organelas contêm um genoma próprio, independente do genoma nuclear. Em humanos, o genoma mitocondrial (mtDNA) contem 16.569 pares de bases e codifica 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs. A estabilidade do mtDNA é essencial para a integridade funcional da organela e da célula, e mutações nesse genoma estão associadas com várias doenças. No entanto, o genoma mitocondrial está exposto a vários agentes genotóxicos, incluindo espécies reativas de oxigênio geradas normalmente como subprodutos do transporte de elétrons durante a fosforilação oxidativa. De fato, o mtDNA acumula lesões de DNA em níveis maiores do que o genoma nuclear. Desta forma, o entendimento dos mecanismos envolvidos na manutenção da estabilidade genética e funcional do mtDNA é fundamental para a melhor compreensão de processos fisiológicos e/ou patológicos. Esse projeto é subdivido em 5 subprojetos que abordam desde aspectos moleculares dos mecanismos de manutenção da integridade do mtDNA até a relevância funcional desses em patologias humanas. Esses são: 1) estudo dos mecanismos moleculares de reparo de DNA em mitocôndrias de mamíferos; 2) estudo do papel de proteínas de replicação na estabilidade do mtDNA; 3) estudo do papel de Rad51 mitocondrial na linhagem germinativa feminina e na fertilidade; 4) estudo da heterogeneidade do mtDNA em carcinoma renal; e 5) investigação de defeitos na manutenção do mtDNA em pacientes com intolerância ao exercício. Os resultados obtidos aqui devem avançar significativamente o entendimento molecular dos mecanismos de manutenção da estabilidade genômica em mitocôndrias, bem como da participação de alterações nessas vias em processos patológicos, e assim podem contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas ou preventivas.

Enzimas alternativas da cadeia respiratória compõem vias bioquímicas adicionais ao processo de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS), no qual o consumo de oxigênio é desacoplado da produção de ATP. A expressão de oxidases alternativas e NADH desidrogenases alternativas provenientes de espécies de tunicados e fungos na mosca Drosophila melanogaster, em camundongo e em células humanas em cultura tem mostrado ser eficaz no combate aos efeitos deletérios causados por deficiências na OXPHOS, tais como a elevada produção de espécies reativas de oxigênio. Os benefícios observados estão em paradoxo com o fato dos genes que codificam tais enzimas alternativas terem sido eliminados do genoma de vertebrados e artrópodes independentemente durante a evolução destes grupos. Este projeto visa investigar as funções fisiológicas de uma das enzimas alternativas de Ciona intestinalis (Tunicata: Ascidiacea), a oxidase alternativa (AOX), quando expressa em drosófilas trangênicas. Estas moscas serão submetidas a condições de estresse térmico e dietético para avaliação do metabolismo mitocondrial e a condições de estresse físico para avaliação da performance aeróbica. Serão usadas técnicas avançadas de biologia molecular (que incluem RNA-Seq e espectrometria de massa de alta resolução) para o estudo do transcriptoma celular e do proteoma mitocondrial, fornecendo dados sobre as alterações causadas pela AOX e avanços na compreensão da fisiologia e da evolução das vias alternativas mitocondriais no reino animal.

Animal mitochondrial DNA (mtDNA) encodes only 13 proteins, all of which are subunits of four of the five complexes of the mitochondrial respiratory chain. The proteins involved in mtDNA replication are encoded by nuclear genes, and earlier studies have shown that alterations in the replication machinery that result from misexpression of or mutations within its component proteins, can alter greatly the composition and/ or the organization of the mitochondrial genome by creating nucleotide substitutions or deletions. Although both the mitochondrial genomes and their corresponding replication proteins are fairly well conserved among the metazoans, they also contain interesting variations: for example, the functional human DNA polymerase gamma (pol γ) holoenzyme consists of a catalytic subunit and a dimeric accessory subunit, whereas the Drosophila enzyme comprises a catalytic subunit and a single accessory subunit. The aim of this work is to elucidate differences in mtDNA replication proteins among animal species, inferring their molecular evolutionary history and how they might have shaped the evolution of the mtDNA itself. Using bioinformatics tools, we retrieved representative sequences of five mtDNA replisome genes from major animal taxa: the pol γ catalytic (pol γ-α) and accessory (pol γ-β) subunits, the mtDNA helicase, the mitochondrial single-stranded DNA-binding protein (mtSSB) and the mitochondrial transcription factor A (TFAM). Analyses of protein sequence alignments and maximum likelihood position-by-position evolutionary rates indicated that the mtDNA replication proteins of deuterostomes (Chordata + Hemichordata + Echinodermata) have acquired specific features: 1) loop23 of mtSSB has an extension of 7-8 amino acid residues that has been implicated in functional interactions with pol γ; 2) the N-terminal primase-like domain of the mtDNA helicase has lost most cysteine residues important for primase activity; and 3) the exonuclease domain of pol γ-α has an extension of approximately 20 amino acid residues that are disordered in the crystal structure. Interestingly, the dimeric state of pol γ-β appears to have evolved exclusively in Vertebrata, resembling the ancestral bacterial aminoacyl tRNA synthase that gave origin to this protein. In contrast, we found that pol γ-β in all invertebrates, including non-vertebrate chordates, clearly encodes a monomeric protein, and that its entire sequence has evolved at a much faster rate. The fact that the vertebrate pol γ holoenzyme contains a dimeric accessory subunit has been invoked to explain the biochemical differences observed between the Drosophila and human mtDNA replisomes in vitro. Using the available crystal structures of the human proteins, we will model the Drosophila pol γ holoenzyme and mtSSB to evaluate the structural, biochemical and evolutionary differences mentioned above. Our preliminary results indicate that the functioning of the mtDNA replisome, and therefore the mechanisms of mtDNA replication, are distinct between vertebrates and invertebrates, which could explain partially the structural differences observed among mitochondrial genomes in the animal kingdom.

The respiratory chain alternative enzymes constitute additional pathways to the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, in which oxygen consumption is uncoupled from ATP production. In contrast to the majority of eukaryotic organisms, including other invertebrate animals, vertebrates and arthropods lack any such alternative pathway. However, the expression of alternative oxidases and NADH dehydrogenases from urochordates and fungi in mammalian cultured cells and in the fruitfly Drosophila melanogaster has proven to be benign and to counteract deleterious effects of defective OXPHOS systems, inspiring therapeutic possibilities for mitochondrial and related diseases. The observed benefits are in paradox with the fact that genes for alternative enzymes were lost independently, early in the evolution of both Vertebrata and Arthropoda. We thus propose to investigate the functions of an animal alternative enzyme, the alternative oxidase (AOX), in two research fronts: 1) in studies with Ciona intestinalis (Tunicata: Ascidiacea), that will aim at understanding the biology of this enzyme in its natural ?host?; and 2) in studies with transgenic fruitflies expressing the C. intestinalis AOX, which will focus on the possible negative effects caused by this enzyme on the metabolism and fitness of D. melanogaster. We will use a systems biology approach that combines a variety of molecular biology techniques to study general and mitochondrial metabolism under different stress conditions, and assays to test aerobic performance and measure the organism?s fitness, ultimately providing insights into the physiology and the evolution of the alternative pathways in animals.

The project will analyse how the genes carried in mitochondrial DNA affect the disease-like characteristics of fruit fly mutants that are so-called models for human mitochondrial diseases. Such diseases include diverse and relatively rare neurological syndromes but also many cases of common conditions such as diabetes, Parkinson?s disease, deafness and epilepsy. The project works to identify new genetic determinants and drug targets for understanding and treating mitochondrial diseases in humans.

The mitochondrion is one of the most important and versatile eukaryotic organelles, responsible for the bulk of energy production in the cell, and involved in apoptosis, signaling, cellular differentiation, and control of cell cycle and cell growth. It possesses its own genome, the mitochondrial DNA (mtDNA), which encodes polypeptides that are essential subunits of the complexes that form the energy-producing respiratory chain. mtDNA replication is thus an important process that maintains proper mitochondrial function, accomplished by the coordinated action of three main protein components that work directly at the mtDNA replication fork: DNA polymerase γ (pol γ), which catalyzes DNA synthesis per se; mtDNA helicase (also known as Twinkle), which unwinds double-stranded DNA to provide a single-stranded DNA (ssDNA) substrate for pol γ; and mitochondrial single-stranded DNA-binding protein (mtSSB), which binds ssDNA to protect it against damage and to coordinate the functions of pol γ and mtDNA helicase. The general aim of my thesis work was to examine the roles of mtSSB at the mtDNA replication fork by investigating the biochemical and physiological performance of a group of mtSSB variants bearing alanine substitutions or deletions of amino acid residues conserved across animal species. We purified 9 recombinant human mtSSB (HsmtSSB) proteins, which maintained their homotetrameric state and bound ssDNA with only slightly different affinities. However, they exhibited very distinct capacities to stimulate the DNA polymerase activity of human pol γ (Hspol γ) and the DNA unwinding activity of human mtDNA helicase (HsmtDNA helicase) in vitro. Whereas the variants HsmtSSBΔN (Δ1-9), ΔC (Δ126-132) and ΔNΔC (Δ1-9, Δ126-132) stimulated Hspol γ ~2-fold higher than HsmtSSBwt (wild type), the variants HsmtSSBloop23 (Δ51-59), α1 (Y83A/Q84A) and loop45-1 (Y100A/G101A/E102A) exhibited an ~40% reduction as compared to HsmtSSBwt. We developed a molecular model of mtSSB-pol γ interaction that explains these and other biochemical data published previously, and that suggests how a group of Hspol γ mutations associated with various human diseases may disturb such interactions. Interestingly, the variants HsmtSSBloop12 (E33A/G34A/K35A) and loop45-2 (K106A/N107A/N108A), which did not exhibit altered capacity to stimulate Hspol γ, were indeed defective in stimulating HsmtDNA helicase, presumably by failing to interact with its C-terminal tail. We also evaluated mtSSB in Drosophila S2 cells by knocking down the endogenous protein (DmmtSSB) and expressing variants of DmmtSSB equivalent to those of HsmtSSB. Endogenous DmmtSSB knockdown and overexpression of DmmtSSB variants caused reduction of mtDNA copy number under conditions of mitochondrial homeostasis, and impeded mtDNA repletion during recovery from treatment with ethidium bromide, when mtDNA replication is stimulated in vivo. Preliminary analysis of mtDNA replication intermediates from cells overexpressing DmmtSSB variants indicated that the defects in mtDNA replication are associated with the binding sites of the transcription termination factor DmTTF. Our findings suggest that mtSSB uses a repertoire of structural elements to interact functionally with pol γ and mtDNA helicase, to guarantee proper mtDNA replication in animal cells. Understanding the mechanisms of mtDNA replication via further biochemical, physiological and structural studies will provide valuable insights into the processes in which the mitochondrion is the key regulator in eukaryotic cells.

O DNA mitocondrial (DNAmt) dos metazoários possui uma série de características, tais como organização circular, simples e compacta, conteúdo gênico conservado, herança predominantemente materna e ausência ou baixa taxa de eventos de recombinação, que fazem com que este genoma seja amplamente usado em diversos estudos evolutivos. Geralmente, o DNAmt animal possui 37 genes (13 codificadores de proteínas, 22 para RNAt e 2 para RNAr) e uma principal região não-codificadora, a região-controle. O objetivo do projeto foi o seqüenciamento e a caracterização estrutural e evolutiva de regiões gênicas e do genoma mitocondrial de espécies da família Muscidae (Diptera: Calyptratae), incluindo a mosca-dos-chifres, Haematobia irritans, a mosca doméstica, Musca domestica, a mosca menor das frutas, Atherigona orientalis, ?the black dump fly?, Ophyra aenescens, e a mosca-dos-estábulos, Stomoxys calcitrans. A estrutura da tese foi dividida em quatro capítulos. No primeiro capítulo, a seqüência completa do gene da subunidade I da citocromo oxidase c (COI) foi caracterizada. COI é o gene mais seqüenciado entre os insetos e tem sido usado em diversos estudos evolutivos e taxonômicos. Este gene mostrou-se estruturalmente semelhante aos demais dípteros, incluindo o uso de um códon de iniciação não usual, TCG (serina). O segundo capítulo descreve um novo conjunto de oligonucleotídeos iniciadores que ajudou a amplificar e seqüenciar regiões do DNAmt de vários dípteros onde há alta chance de ocorrer rearranjos e/ou duplicações (regiões de ?hot spots? ou ?instabilidade estrutural? no DNAmt de artrópodes, que incluem a região-controle e agrupamentos de RNAt). O terceiro capítulo descreve a seqüência completa da região-controle de H. irritans, M. domestica e A. orientalis, define padrões evolutivo-estruturais para moscas da subordem Brachycera e sugere a atuação de elementos cis-regulatórios no controle da replicação e transcrição do DNAmt de insetos. Ao tentar acessar a região-controle de O. aenescens e S. calcitrans, foi evidenciado um possível evento de rearranjo e/ou duplicação no genoma mitocondrial destas espécies envolvendo os genes que flanqueiam a região-controle. O quarto capítulo descreve uma análise comparativa entre os genomas mitocondriais de H. irritans (16078bp) e S. calcitrans (~18Kb). Um conjunto de estratégias, incluindo amplificação via Long-PCR, construção de bibliotecas de ?shotgun?, montagem, anotação e análises estruturais utilizando recursos de bioinformática, foi otimizada durante este trabalho. Os genomas mitocondriais de H. irritans e S. calcitrans possuem conteúdo e organização gênicos conservados, considerando-se o modelo ancestral proposto para artrópodes, exceto pela região-controle de S. calcitrans (~2,5Kb), que teve 60% de sua seqüência caracterizada, suficientes para indicar a ocorrência de duplicação gênica envolvendo elementos internos da região-controle e o gene de RNAt para isoleucina (I). A duplicação de I no DNAmt de S. calcitrans é muito semelhante a que ocorre no DNAmt de espécies de Chrysomya (Diptera: Calliphoridae), reforçando que esta região é um ?hot spot? de duplicação no genoma mitocondrial de dípteros. Uma árvore filogenética usando os genes codificadores de proteínas foi inferida para a ordem Diptera e o resultado difere da filogenia tradicional proposta para o grupo.

A região controle de replicação do DNA mitocondrial é uma região pouco conhecida em artrópodos devido à dificuldade de acesso técnico e metodológico a sua sequência. A caracterização da sequência nucleotídica desta região pode ajudar na compreensão da evolução da molécula de DNA mitocondrial em estrutura e função. Além dos aspectos de evolução molecular, a caracterização desta região pode fornecer uma avaliação de sua utilidade como marcador molecular em análises intra e interespecíficas. No caso da espécie Haematobia irritans irritans (Diptera: Muscidae), a mosca-dos-chifres, existem poucos estudos sobre marcadores moleculares e nenhum registro no banco de dados com relação a caracterização de sequências de DNA mitocondrial. Esta espécie tem sido considerada uma das principais pragas relacionadas à pecuária em toda a América, devido ao seu hábito hematófago que causa irritação no gado (resultando em perda de peso e menor produção de leite) e, principalmente, ao desenvolvimento de resistência aos inseticidas utilizados para o controle. O sequenciamento e a caracterização da região controle de replicação do DNA mitocondrial de Haematobia irritans é uma contribuição importante no contexto do sequenciamento completo do genoma mitocondrial. Além disso, a distribuição de elementos conservados e domínios variáveis ao longo da sequência da região controle obedece a padrões específicos de organização estrutural associados à evolução da origem de replicação e transcrição do genoma mitocondrial. A identificação e caracterização destes elementos estruturais pode contribuir na compreensão deste processo.