Fernando Eduardo Padovan Neto.

A farmacoterapia da doença de Parkinson (DP) é baseada principalmente no precursor da dopamina L-DOPA. No entanto, o tratamento a longo prazo com a L-DOPA está associado a efeitos colaterais indesejados denominados discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs). Recentemente, compostos que interferem com a disponibilidade de nucleotídeos cíclicos (cAMP/cGMP), como os inibidores da fosfodiesterase 10A (PDE10A), estão emergindo como uma co-terapia antidiscinética promissora. O principal objetivo deste projeto é estudar parâmetros neurofisiológicos associados com as LIDs e verificar como essas alterações são moduladas por inibidores da PDE10A em um modelo pré-clínico da DP. Com base nos resultados anteriores de nossos grupos de pesquisa (Suécia e Brasil), testaremos a hipótese central de que a manipulação da disponibilidade central de nucleotídeos cíclicos pode modular oscilações de redes neurais que estão ligadas a estados cerebrais patológicos, como é o caso das LIDs. Com base em nossos interesses mútuos de pesquisa, implementaremos essa colaboração de pesquisa conduzindo experimentos com base em nossos projetos em andamento. O grupo brasileiro possui experiência em modelos animais de doenças neurodegenerativas, neurofarmacologia e métodos neuroquímicos. Por outro lado, a equipe sueca desenvolveu uma abordagem neurofisiológica altamente promissora para o desenvolvimento de novas terapias antidiscinéticas. Juntos, os dois grupos se unirão para consolidar uma nova abordagem para estudar DP e as LIDs. Espera-se que esse estudo contribua com o desenvolvimento de novas opções de tratamento para pacientes com DP.

Uma caminhada aleatória (CA) é um processo estocástico formado pela sucessão de passos aleatórios, que pode ser utilizada para representar alguns dos processos micro ou macroscópicos. As CA vem sendo aplicadas em diversas áreas da ciência, como a física, computação, biologia, economia, dentre outras. Um problema importante nas CA surge, quando é introduzido ao processo correlação induzida por memória (processo estocástico não-Markoviano). Schütz e Trimper introduziram um modelo microscópico que leva a uma equação de Fokker-Planck, no limite assintótico (grandes escalas de tempo e espaço), denominado Caminhada Aleatória do Elefante (ou em inglês, Elephant Random Walk ? ERW) [Phys. Rev. E 70, 045101(R) (2004)]. No modelo do Elefante, o caminhante é capaz de recordar qualquer evento passado da sua trajetória, e usá-lo para decidir a direção do próximo passo no tempo atual t, em outras palavras, o caminhante apresenta uma memória perfeita (ilimitada). As características importantes desse modelo são apresentar difusão anômala e possuir uma solução exata. Outro tipo de modelo pertencente à esse grupo de modelos não-Markovianos, foi introduzido por Cressoni et al [PRL 98, 070603 (2007)], denominado modelo de Caminhada Aleatória com Alzheimer (em inglês, Alzheimer Random Walk ? ARW). Neste modelo, o caminhante é capaz de relembrar apenas uma fração inicial de toda a história de sua trajetória, ou seja, a sua memória recente é perdida. Este modelo também apresenta difusão anômala, mas com características adicionais: grandes e pequenas oscilações log-periódicas. A grande surpresa que ocorreu com este modelo foram a obtenção de um diagrama de fase completo obtido com os parâmetros do modelo, a simplicidade da solução e o surgimento de oscilações log-periódicas. Tais oscilações vem sendo observadas antes de eventos catastróficos, em diversos fenômenos reais como rupturas, terremotos e quebra da bolsa de valores, por exemplo, de modo que o seu surgimento indica futura ocorrência de catástrofe (no caso do modelo, incapacidade de acessar a memória recente). Inspirado por este modelo, observamos que o mesmo apresenta características semelhantes as observadas em doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, por exemplo, onde o indivíduo perde a capacidade de reter novas informações (memória recente) e passa a relembrar eventos mais antigos (memória antiga). Com o objetivo de associar modelos de caminhadas aleatórias não-Markovianas com a doença de Huntington, desenvolvemos um método para prever a evolução de séries temporais, mapeado-as em modelos de CA não-Markovianas, obtendo os melhores parâmetros deste modelo que que se ajustam à série temporal em análise. Com isso, por meio de testes psicológicos para a avaliação da memória, que retornem como resposta uma variável dicotômica (verdadeiro ou falso, por exemplo), séries temporais podem ser construídas e analisadas, a fim de, ao mapeá-las num modelo de CA não-Markoviana, obter os parâmetros do modelo e caracterizar grupos em análise, para uma possível aplicação no diagnóstico clínico.

A doença de Parkinson (DP) é caracterizada pela morte gradual de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos da substância negra compacta (SNc). O tratamento sintomático da DP visa aumentar a disponibilidade de dopamina no estriado através do precursor de dopamina L-DOPA. Entretanto, após o período de 5-10 anos de tratamento com a L-DOPA, cerca de 75-80% dos pacientes parkinsonianos desenvolvem complicações motoras que incluem movimentos involuntários anormais denominados discinesias induzidas pela L-DOPA (LIDs). O estriado é a principal estrutura dos núcleos da base envolvida com o surgimento das LIDs e recebe terminações glutamatérgicas e dopaminérgicas provenientes do córtex e da SNc, respectivamente. Os neurônios espinhosos médios (MSNs) estriatais são divididos de acordo com seus alvos de projeção e formam as vias direta e indireta. Em condições fisiológicas normais, os MSNs da via direta (dMSNs) são responsáveis por facilitar a resposta motora apropriada mediante integração de estímulos glutamatérgicos e dopaminérgicos. Os MSNs da via indireta (iMSNs) desempenham função oposta e estão envolvidos na inibição de programas motores não apropriados. É sugerido que a administração crônica de L-DOPA aumenta excessivamente a atividade dos dMSNs e diminui de maneira anormal a atividade dos iMSNs. Dessa maneira, o desequilíbrio entre a atividade dos neurônios de projeção do estriado seria responsável por causar as LIDs. Entretanto, não existem evidências eletrofisiológicas que corroborem esse modelo. A proposta desse projeto é avançar o conhecimento da neurofisiologia dos dMSNs e iMSNs para então poder compreender o mecanismo de ação de fármacos com potencial terapêutico para o tratamento das LIDs. Especificamente, os inibidores das enzimas óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e fosfodiesterase 10A (PDE10A) são terapias promissoras para as LIDs por sua capacidade de modular as vias de sinalização envolvidas na elaboração da resposta dos MSNs ao córtex motor. A hipótese central desse projeto é que as LIDs ocorrem como consequência do aumento da atividade facilitatória dos dMSNs e redução da atividade inibitória dos iMSNs. Acreditamos que a inibição da enzima nNOS produz atividade antidiscinética por diminuir a atividade exagerada dos dMSNs, enquanto que a atividade antidiscinética obtida com o bloqueio da enzima PDE10A diminui as LIDs por aumentar a atividade dos iMSNs. De maneira geral, acreditamos que a eficácia desses compostos esteja relacionada com o reestabelecimento do equilíbrio da atividade das via de projeção do estriado. Iremos utilizar o modelo pré-clínico da DP induzido pela microinjeção de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no feixe prosencefálico medial de ratos. Utilizaremos testes de comportamento para avaliar a atividade motora dos animais em resposta ao tratamento com a L-DOPA (monoterapia e combinada com os inibidores da nNOS e PDE10A). Realizaremos registros eletrofisiológicos in vivo (animais anestesiados) para avaliar a atividade espontânea dos MSNs e estudar o impacto da estimulação do córtex motor na probabilidade de disparo dos MSNs. O fenótipo dos MSNs registrados será caracterizado utilizando-se técnicas eletrofisiológicas e imunocitoquímicas. Os achados desse estudo irão avançar a compreensão da neurofisiologia estriatal e também auxiliarão na busca de novos alvos terapêuticos para o tratamento das LIDs. Esperamos que os resultados também forneçam alternativas farmacológicas para o tratamento de pacientes parkinsonianos discinéticos.

To determine whether chronic co-administration of novel sGC stimulators with L-DOPA is an effective approach for reversing both akinesia and dyskinesia and associated pathophysiology observed in an animal model of PD.

The goal of this proposal is to identify new strategies, which can offer more effective treatments for motor and non-motor symptoms of Parkinson?s disease (PD) by targeting non-dopaminergic signaling pathways.

At least seven families of cAMP/cGMP metabolizing phosphodiesterases (PDE) are expressed in the striatum. PDE10A exhibits the highest expression levels of any PDE, which is located to striatal medium spiny neurons (MSNs). Increasing striatal cyclic nucleotides via the administration of PDE inhibitors has emerged as a new pharmacological approach to counteract L-DOPA-induced dyskinesia (LID) which develops in Parkinson?s disease (PD) following chronic drug therapy. We will determine the contribution of D1 and D2-receptor expressing MSNs for the antidyskinetic effects of the PDE10A inhibitor TP-10 in the 6-OHDA lesioned rat model of PD. Since cyclic nucleotide production occurs downstream of dopaminergic receptor stimulation, our second goal is to determine the effects of the PDE10A inhibitor TP-10/L-DOPA treatment together with a cocktail combination of either D1 or D2 antagonists (SCH-23390 or eticlopride, respectively) on LID. The clinical implications of this discovery are expected to advance the treatment options for patients with PD.

These studies will investigate neuronal changes in the basal ganglia associated induced a mice model of HD. We will also assess the utility of novel drugs called phosphodiesterase (PDE) inhibitors that attenuate cyclic nucleotide metabolism for reversing pathological changes induced in tgHD mice.

PNPD (Pós-Doutorado) A L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), precursor da dopamina, é o tratamento sintomático mais efetivo da doença de Parkinson. Entretanto, sua administração prolongada provoca complicações motoras debilitantes como as discinesias induzidas pela L-DOPA. Recentemente demonstramos que inibidores de enzimas de síntese de óxido nítrico (NOS) e da guanilato ciclase solúvel (sGC) atenuam essas discinesias sem comprometer os efeitos motores benéficos do tratamento. O objetivo geral desse projeto é ampliar este estudo analisando compostos com potencial terapêutico para as discinesias induzidas pela L-DOPA em animais com Parkinson experimental induzido pela neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Os objetivos específicos estão divididos em duas partes: Parte 1: (i) determinar a atividade da via nitrérgica (óxido nítrico, NO) no estriado dorsal de animais discinéticos avaliando a concentração dos metabólitos nitrito e nitrato por meio da reação de Griess e (ii) investigar se o bloqueio das discinesias induzidas pela L-DOPA mediante administração do inibidor da NOS neuronal (nNOS), o 7-NI, interfere com a concentração dos metabólitos do NO no estriado dorsal. (iii) Avaliar por meio de análise de comportamento (atribuição de escores para os movimentos involuntários anormais de característica discinética) se a aplicação intra-estriatal de RNA de interferência (RNAi) para silenciar a proteína nNOS apresenta efeito anti-discinético. Parte 2: (iv) por meio de análise de comportamento, determinar uma curva dose resposta para os efeitos da administração crônica (via sistêmica) do inibidor da NOS/sGC, o azul de metileno, juntamente com a L-DOPA para impedir/reduzir a manifestação dos movimentos involuntários anormais e, por meio da análise celular, estudar a expressão do fator de transcrição e marcador molecular das discinesias induzidas pela L-DOPA, o Fos-B/ΔFos-B, no estriado dorsal (principal estrutura de processamento de informação motora dos núcleos da base). (v) Por meio de análise de comportamento, avaliar os efeitos da administração de doses agudas via intra-cerebral (estriado dorsal) do azul de metileno e do inibidor específico da sGC, o 1H-[1;2;4]oxadiazolo[4;3-a]quinoxalin-1-one (ODQ), nas discinesias pré-estabelecidas pela administração crônica de L-DOPA para animais parkinsonianos.

Doutorado Sanduíche (FAPESP 2009/08181-9). The role of nitrergic and dopaminergic pathway has been addressed in several studies. The interaction between nitric oxide and dopamine undergoes plasticity following dopaminergic depletion such as occurs in Parkinson?s disease and also during dopaminergic replacement subsequent to L-DOPA-therapy. The interactions between nitric oxide and dopamine during the early and late phases of L-DOPA-induced dyskinesias are poorly understood. The aim of the present study is to investigate the participation of nitric oxide in L-DOPA-induced dyskinesias in a rodent model of Parkinson?s disease. Striatal nitric oxide efflux will be measured in freely moving animals with a microsensor and contrasted with levels of dyskinetic-like behaviors.

Projeto FAPESP n 2009/08181-9. A L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), precursor da dopamina, é o tratamento sintomático mais efetivo da doença de Parkinson. Entretanto, sua administração prolongada provoca complicações motoras debilitantes como as discinesias. Recentemente demonstramos que inibidores de enzimas de síntese de óxido nítrico (NOS) atenuam as discinesias induzidas por L-DOPA sem comprometer os efeitos motores benéficos. O objetivo geral desse projeto é ampliar este estudo analisando os mecanismos celulares e moleculares que sublinham a ação do óxido nítrico (NO) nos processos neuroprotetores/neuroplásticos nas discinesias induzidas pela administração de L-DOPA em animais com Parkinsonismo induzido pela neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Os objetivos específicos são (i) por meio do estudo do comportamento, determinar o efeito do tratamento crônico com o inibidor preferencial da NOS neuronal nas discinesias induzidas pela L-DOPA; (ii) por meio da análise celular, estudar a mobilização de estruturas neurais que apresentam indução de marcador de atividade celular utilizando a expressão do gene Fos-B e da atividade NADPH-diaforase/NOS, analisando a co-marcação Fos-B e histoquímica para atividade NADPH-diaforase; (iii) analisar a expressão das isoformas da NOS (neuronal, endotelial e induzida), da guanilato ciclase solúvel, da guanosina monofosfato cíclico , da proteína quinase sensível ao GMPc e determinar o estado de fosforilação da proteína DARPP-32 (fosfoproteína-32 regulada por adenosina monofosfato cíclico e dopamina) por western blot no estriado, a principal estrutura de processamento de informações dos núcleos da base; (iv) avaliar regiões cerebrais, considerando-se inicialmente expressão da proteína Fos-B em conjunto com a atividade NADPH-diaforase, candidatas a receber microinjecões de inibidor da NOS neuronal para análise do efeito da inibição local da atividade nitrérgica sobre o controle das discinesias

Processo FAPESP 2006/58932-2. O tratamento sintomático da doença de Parkinson com a L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) é geralmente acompanhado de complicações motoras, sendo as mais comuns as discinesias. Ratos com lesões dos neurônios dopaminérgicos induzido pela neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) exibem movimentos involuntários anormais semelhantes às discinesias quando tratados cronicamente com a L-DOPA. Apesar dos mecanismos que induzem as discinesias não estarem completamente esclarecidos, pode haver participação do sistema do óxido nítrico (NO). Nesse trabalho utilizamos o modelo de Parkinson experimental em ratos induzido pela microinjeção unilateral de 6-OHDA no feixe prosencefálico medial para estudar as relações do sistema do NO com as complicações motoras induzidas pela L-DOPA. Na primeira parte do estudo avaliamos os efeitos da aplicação aguda e crônica de L-DOPA (100 mg/kg; gavagem) e avaliamos os efeitos do inibidor das isoformas neuronal e endotelial das sintases de NO (NOS), o L-NOARG (50 mg/kg; i.p.) nas discinesias induzidas pela L-DOPA e no teste de teste da caminhada. Mostramos que a administração de uma dose aguda de L-DOPA restaura a acinesia induzida pela microinjeção de 6-OHDA mas produz movimentos discinéticos. O pré-tratamento com o L-NOARG apresentou efeito antidiscinético causando, no entanto, prejuízos motores no teste de caminhada. A aplicação crônica de L-DOPA aumentou rapidamente a intensidade das discinesias ao longo do tempo. A administração do L-NOARG após o tratamento crônico com L-DOPA apresentou efeito antidiscinético sem causar prejuízos motores. Em um segundo experimento, utilizamos doses mais baixas e escalonadas de L-DOPA (10?30 mg/kg; gavagem) para induzir as discinesias e avaliamos os efeitos antidiscinéticos e motores (teste do rotarod) do inibidor preferencial da nNOS, o 7-nitroindazol (1?30 mg/kg; i.p.). Mostramos que os movimentos discinéticos aumentam gradativamente ao longo do tempo de tratamento e que o 7-NI apresenta efeito antidiscinético de maneira dose-dependente sem causar prejuízos motores. Os resultados mostram que inibidores das sintases do óxido nítrico atenuam as discinesias induzidas pelo tratamento crônico com a L-DOPA no modelo de Parkinson experimental em ratos induzido pela 6-OHDA.

Trabalho de Conclusão de Curso (PIBIC/USP/CNPq). A doença de Parkinson é uma patologia neurodegenerativa e os pacientes acometidos apresentam tremores, rigidez, bradicinesia corporal e instabilidade postural. Esses sintomas provocam dificuldades motoras progressivas. Foi a primeira doença neurológica em que se definiu que a depleção de um neurotransmissor específico, a dopamina, era responsável pela maioria dos sintomas motores observados nos pacientes. Também foi a primeira doença em que se tentou, com sucesso, repor a falta do neurotransmissor por meio da administração de um precursor, a levodopa (L-DOPA). Adicionalmente, a doença serviu como um ponto de partida para o conhecimento da fisiologia dos gânglios da base desde que restam questões fundamentais a serem respondidas sobre a doença. Não se conhece a fisiopatologia e a etiologia da doença de Parkinson. Fator importante é que o tratamento clínico com a levodopa produz resultados inicialmente extraordinários, mas que se diluem com o aparecimento de inúmeras complicações. Assim, torna-se essencial desenvolver e utilizar modelos experimentais viáveis para a abordagem experimental desse problema. O tratamento crônico com levodopa em ratos com lesão no feixe prosencefálico medial causada pela toxina 6-OHDA produz mudanças significativas nas respostas comportamentais dos animais. Essas mudanças estão certamente ligadas a modificações desenvolvidas durante o período de tratamento. O Óxido Nítrico (NO) pode ser uma das substâncias capazes de participar da modulação dessas mudanças. Assim, os objetivos deste estudo são avaliar a influência da inibição do sistema do NO nos efeitos comportamentais observados após tratamento crônico com levodopa em um modelo experimental de estudo do sistema dopaminérgico.