Luiz Ricardo Orsini Tosi.

Nosso laboratório vem contribuindo para o entendimento das vias de sinalização de danos no DNA no protozoário parasita Leishmania. O estudo dos eventos de detecção e sinalização de danos no DNA de um organismo que muito cedo divergiu na linhagem eucariótica pode ajudar da compreensão de como as Resposta a Danos no DNA (DDR) se estabeleceu nos eucariotos. A partir da identificação e caracterização das proteínas de checkpoint Rad9 e Hus1, que já reportamos, pretendemos investigar o envolvimento destas proteínas em aspectos mais específicos da biologia peculiar destes organismos. Assim, o objetivo geral desta proposta é (i) utilizar linhagens deficientes ou nulas para Rad9 ou Hus1 para caracterizar o papel destas proteínas no controle do número de cópias no genoma de L. major; (ii) utilizar ChIP e ChIP-seq para investigar os complexos que contêm Hus1 ou Rad9 e os loci aos quais Hus1 se associa em L. major em resposta ao estresse replicativo; e (iii) utilizar versões truncadas de Rad9 de L. major para caracterizar o papel de seu domínio C-terminal.

Recent work in Leishmania examined a key player in the damage sensing, cell cycle progression and DNA repair processes in these organisms. This factor, termed the Rad9-Rad1-Hus1 (9-1-1) complex is a ring-shaped heterotrimeric complex, structurally related to the PCNA clamp and is conserved amongst eukaryotes. Accumulating evidence indicates Leishmania 9-1-1 is central to genome maintenance and has evolved by a distinct route: devolution of both Rad9 and Hus1 activities. Gene knockout attempts have suggested that Rad9 and Hus1 are essential and cells deficient for either Rad9 or Hus1 display contrasting phenotypes when exposed to a range of genotoxic damage. In this project we wish to further study 9-1-1 functions by comparing Leishmania and T. brucei. It will be informative to ask if the devolved functions of Rad9 and Hus 1, as well as the core genome maintenance functions of 9-1-1, act to cope with the unusual biology of the Leishmania genome, or if they are seen also in T. brucei, which is (in some regards) more conventionally like other eukaryotes. We will use established biochemical approaches to ask if the devolved interactions of Rad9 and Hus1 seen in Leishmania are also found in T. brucei. We will apply genome-wide next generation sequencing strategies, in both parasites, to evaluate the impact of loss of the factors on genome replication and stability, and we will adapt the established iPOND strategy for use in the parasites allowing us to more clearly define all factors acting at replication forks. (AU)

Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania spp. (tritryps) present different in their life cycles as well as in their strategy for vertebrate infection. These differences in core biology are influenced by the ability of the parasites to maintain and alter their genome, leading to adaptive changes in gene expression. Gene expression is organized almost exclusively as polycistronic transcription, where every gene is expressed from one of a small number of a multigene units meaning that RNA Polymerase needs to traverse unusually long distances. The nature of transcription in each genome must predispose the parasites to pronounced replication stress due to collision between the replication and transcription machineries, leading to DNA replication fork stalling. In such stress conditions, the halted DNA fork is recognized by kinases ATM and ATR, which initiate a signaling cascade that mediates the appropriate response to the blockade. The nature of the replication stress signaling or the mechanisms of response are not the same in the tritryps and differences in genome architecture in the tritryps may be related to differing strategies used to resolve replication stress due to clashes with transcription. Specifically, it might be predicted that T. brucei activates dormant origins in conditions of stress, whereas T. cruzi and Leishmania resolve the stalled forks using recombination/amplification. We aim to determine if replication-transcription clashes are the main cause of the different genome architectures, and to reveal and compare the strategies used to resolve a stalled DNA replication forks in the parasites. (AU)

Nosso laboratório estuda a existência e a função do complexo proteico 9-1-1 (Rad9-Rad1-Hus1) nos mecanismos de resposta a danos no DNA (DDR) do protozoário parasito Leishmania. Em outros eucariotos, este complexo atua na detecção de danos ao DNA e na sinalização de parada no ciclo celular para o reparo adequado da molécula de DNA. Demonstramos que a proteína homóloga de Hus1 no parasito participa na DDR e interage in vivo com LmRad9. As duas proteínas LmHus1 e LmRad9 ainda participam na manutenção de telômeros. Verificamos que a deficiência de LmHus1 prejudica a ativação do checkpoint em resposta ao estresse replicativo. Demonstramos também que LmHus1 é conservada na linhagem eucariótica, enquanto que LmRad9 apresenta uma baixa conservação. Além disso, o genoma do parasito parece não codificar um gene homólogo a Rad1. Estes dados sugerem um mecanismo peculiar de detecção e sinalização de danos no DNA. O estudo deste complexo em Leishmania deverá contribuir não apenas para o entendimento da homeostase genômica do parasito, mas também da evolução da DDR em eucariotos. Desta forma, o objetivo geral desta proposta é (i) identificar o possível gene homólogo de Rad1 em L. major; (ii) estudar a expressão e função de seu produto; (iii) investigar a arquitetura do possível complexo 9-1-1 do parasito; e (iv) ampliar a caracterização funcional das proteínas LmHus1 e LmRad9.