Joilson de Oliveira Martins.

O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença metabólica crônica ocasionada por uma resposta autoimune. Sabe-se que o quadro de hiperglicemia crônico, presente nesses pacientes leva a um comprometimento da resposta imunológica, tornando-os mais susceptíveis às doenças secundárias, tais como a esporotricose, micose subcutânea, de notificação compulsória no Brasil, com altas taxas de incidência no Rio de Janeiro e região leste de São Paulo, causada pelo fungo Sporothrix brasiliensis. A autofagia vem sendo estudada como um componente crucial na defesa inata contra uma vasta gama de agentes infecciosos, possuindo um papel central no controle de diversos aspectos da imunidade em organismos multicelulares. Assim, neste estudo estamos investigando o papel da autofagia, através da indução por Rapamicina, no controle da infecção por S. brasiliensis em camundongos C57BL/6J controles e diabéticos. Para isso iremos avaliar a concentrações de citocinas (IL-17A, IL-6, IL-1, IFN- e TNF-), dosagem de proteínas (Beclin1, LC3B e P62), UFC, histopatológicos, ensaio de fagocitose e avaliação do perfil celular pela técnica de citometria de fluxo. Analisando os dados obtidos até o momento, o tratamento com doses intermitentes de Rapamicina sugeriu prolongar a vida dos camundongos infectados com diabetes, em comparação com seus respectivos controles, através da análise de curva de sobrevida, além disso, analisando os dados hematológicos, estes sugerem que os camundongos infectados apresentam maior número de granulócitos e monócitos, comparados aos camundongos controle.

O envelhecimento é um processo natural e multifatorial caracterizado pela perda gradual da integridade fisiológica, prejudicando funções normais e essenciais à sobrevivência do corpo, e levando ao desenvolvimento de doenças relacionadas à idade. Nesse contexto, a autofagia, um processo de degradação de conteúdo intracelular, regulado naturalmente pelo receptor sensor de nutrientes mammalian target of rapamycin (mTOR) ou quimicamente pelo fármaco rapamicina (RAPA) e cloroquina (CQ), possui uma relação direta com a homeostasia celular e manutenção do fenótipo senescente. A fim de entender melhor como alterações no metabolismo da glicose causadas por mecanismos autofágicos, potencializados por RAPA ou reduzidos por CQ, regulam o fenótipo senescente de linfócitos e impactam em tecidos e órgãos metabolicamente ativos, este projeto busca investigar a relação entre o metabolismo da glicose e a autofagia na regulação do fenótipo senescente de linfócitos em camundongos Senescence-Accelerated Mouse Prone 8 (SAM-P8) e Senescence-Accelerated Mouse Resistant 1 (SAM-R1). Para tanto, serão avaliados: (1) os mecanismos moleculares e celulares associados à senescência, como: alterações no perfil hematimétrico e metabólico do sangue, bem como alteração em marcadores genéticos, no perfil de citocinas, presença de apoptose na estrutura histológica, em amostras da medula óssea, baço, timo, músculo, pâncreas e fígado e alterações na população de linfócitos (sangue, baço e timo) e neutrófilos (sangue); (2) a relação entre a modulação da autofagia e o fenótipo senescência, pela avaliação da sinalização de proteínas envolvidas na ativação da autofagia; (3) alterações na sensibilidade e metabolismo da glicose, como: alterações na metabolização da glicose in vivo e in vitro, na capacidade respiratória, no número de mitocôndrias, no potencial de membrana e na produção de ROS em linfócitos e hepatócitos cultivados in vitro

A obesidade é uma doença metabólica crônica que pode estar associada a vários distúrbios fisiológicos, como diabetes mellitus (DM) e hipertensão (HTN). Alguns estudos mostraram vias comuns interligando obesidade e diabetes à resistência à insulina e ao sistema renina-angiotensina (SRA), um dos principais reguladores da pressão arterial. O angiotensinogênio (Agt) é o principal precursor do SRA. A ativação do Agt no tecido adiposo exerce efeitos pró-inflamatórios, frequentemente ligados a disfunções nos processos celulares, como a autofagia. Na obesidade, o perfil pró-inflamatório no tecido adiposo leva à produção de adipocinas e citocinas que promovem intolerância à glicose e a resistência à insulina. O mesmo acontece no diabetes. Diversos trabalhos mostraram que o mediador lipídico leucotrieno (LT) B4 possui um papel central no estabelecimento da resistência à insulina e no desenvolvimento do DM em modelos animais. Em macrófagos, a ativação do receptor do LTB4, potencializa o fenótipo pró-inflamatório. No tecido adiposo de camundongos com DM2 induzida por dieta hiperlipídica, foi mostrado que o recrutamento de monócitos, a polarização de macrófagos para o perfil M1, a produção de citocinas pró-inflamatórias e a resistência à insulina são dependentes da produção de LTB4. No fígado e no músculo o LTB4 promove inflamação e resistência à insulina. Acredita-se que a autofagia desregulada esteja ligada com a diabetogênese através do desenvolvimento de inflamação e resistência insulínica. Por conseguinte, hipotetizamos que os LT estejam envolvidos com o SRA contribuindo para a inflamação associada a doenças metabólicas através da desregulação da autofagia. Portanto pretendemos investigar o envolvimento dos LT no SRA em camundongos com DT1 ou obesidade, com ênfase específica no papel da inflamação (sistêmica e local), autofagia e sinalização do receptor de insulina em órgãos metabolicamente ativos. Iremos induzir a DT1 quimicamente com streptozotocina e para inibir o SRA iremos tratar os camundongos diabéticos com captopril. Após os tratamentos, fígado, tecido adiposo e músculo serão retirados para as análises. Iremos avaliar a (1) expressão de marcadores gênicos do SRA, autofagia, inflamação, perfil de macrófagos e receptor de insulina através de PCR em tempo real, a (2) expressão proteica de componentes do SRA, autofagia e receptor de insulina via Western blotting, a (3) produção de citocinas pró e anti-inflamatórias nestes tecidos pelo método de ELISA, para responder nossa hipótese. Entender os mecanismos moleculares envolvidos nestas doenças pode trazer um benefício direto ao paciente, melhorando sua qualidade de vida, bem como diminuir os gastos públicos decorrentes das complicações dessas síndromes metabólicas

SPRINT ? São Paulo Researchers in International Collaboration

Asma é uma doença complexa que envolve, simultaneamente, inúmeras células, citocinas e mediadores inflamatórios onde a fase inicial é completamente diferente da fase tardia. Em estudo recente observamos, utilizando modelo experimental desenvolvido em camundongos pré- imunizados com ovalbumina (OVA), que a insulina interfere na produção/liberação de citocinas, migração celular, deposição de colágeno e secreção de muco envolvidos na remodelação pulmonar. O modelo de asma proposto neste projeto utiliza uma dose reforço do antígeno doze dias após a primeira imunização e submete os animais a sete desafios antigênicos subsequentes com OVA. Este modelo, caracteriza-se por um padrão específico de inflamação na mucosa das vias aéreas, envolvendo eosinófilos e linfócitos com predomínio da sub-população T helper (Th)2. Além disso, são observadas mudanças estruturais nas vias aéreas (remodelamento), tais como aumento da deposição de colágeno ao redor dos brônquios, fibrose sub-epitelial, hipertrofia e hiperplasia do músculo liso das vias aéreas, angiogênese e aumento de secreção de muco. Com este auxílio pretende-se complementar este estudo, avaliando o papel modulatório da insulina sobre a inflamação alérgica pulmonar tardia. Para tanto, o estudo realizado em camundongos sadios, será reproduzido em camundongos tornados diabéticos. Serão avaliados: a) glicemia (monitor de glicose), b) responsividade das vias aéreas antes e após prova de broncoprovocação por metilcolina (buxco), bem como prova de função pulmonar in vivo (flexiVent) c) estudo das células presentes no lavado broncoalveolar (LBA), e análise das subpopulações celulares por citometria de fluxo em amostras da medula óssea, pulmão, timo e baço; d) determinação dos níveis séricos de: insulina, corticosterona e imunoglobulinas (IgE, IgG1 e IgG2a) por ELISA; e) níveis de concentração de citocinas (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TNF-± e IFN-³ ) em amostras de sobrenadante do LBA por ELISA; f) expressão das moléculas envolvidas na sinalização celular (p38 MAPK, colágeno I, Smad 2, e Smad 3) em pulmão e em medula óssea, pela técnica de Western blot; g) alterações de expressão do RNA mensageiro nas vias de sinalização intracelular durante o curso da inflamação pulmonar de origem alérgica pela técnica de RT-PCR.

SPRINT ? São Paulo Researchers in International Collaboration

Sabe-se que o paciente diabético tipo I tem maior predisposição a infecções secundárias. Estudos prévios do nosso grupo observaram que parte desta predisposição é decorrente da carência relativa de insulina. A nefropatia diabética é uma das principais complicações do diabetes mellitus e pode evoluir para uma doença crônica renal caracterizada por falência renal. Por este motivo, a diálise tem sido cada vez mais utilizada. A diálise peritoneal (DP) é a alternativa para substituição da hemodiálise, porém apesar das inovações tecnológicas, a peritonite ainda representa um dos principais motivos de hospitalização e de abandono da DP. Os principais causadores deste tipo de peritonite são bactérias Gram-positivas, sendo o Staphylococcus aureus associado a manifestações mais graves, ou seja, necessidade maior de manuseio do cateter, com alto risco de hospitalização e morte. Assim, a primeira parte deste projeto tem por objetivo estudar o papel da insulina na modulação da peritonite causada por S. aureus (anexo I). A segunda parte deste projeto tem por objetivo estudar o efeito da insulina em um modelo de micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis (anexo II). A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma enfermidade sistêmica, causada pelo P. brasiliensis, fungo que exibe dimorfismo térmico. O P. brasiliensis interage com células apresentadoras de antígenos (APC), alterando suas principais funções biológicas. Entre as APC, os macrófagos são células que desempenham um papel importante na indução e regulação da resposta imune. Recentemente observou-se que a capacidade fagocítica destas células em animais diabéticos para alvos opsonizados por IgG está diminuída em comparação aos animais sadios.Em conjunto, analisaremos nestes projetos os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas), intracelulares (vias de sinalização), a expressão dos receptores TLR envolvidos e a atividade fagocítica e microbicida dos macrófagos

Nós estabelecemos que a atividade catalítica de inositol hexaquisfosfato quinase, IP6K1, promove a secreção de insulina, aumentando a capacidade exocitótica das células beta pancreáticas. Isto leva a um aumento da primeira fase da secreção de insulina conhecido por ser comprometida em diabetes tipo 2 (DM2). IP6K1 também associa com GRAB (fator de troca GTPase para Rab3A) e por esta associação remove a capacidade de Rab3A para atuar como uma pausa na exocitose em neurônios. Nossos dados preliminares sugerem que GRAB é expresso em níveis comparáveis em células beta do pâncreas. Ele também indica que GRAB poderia ser elevado nas ilhotas de animais diabéticos. Nossa hipótese é que o GRAB é um importante novo alvo no tratamento de diabetes tipo 2. Vamos testar a hipótese com os seguintes objetivos: 1) O GRAB regular negativamente exocitose em células beta; 2) Há evidências a partir de modelos diabéticos que GRAB está diretamente envolvido na doença; 3) O GRAB é importante em outros aspectos da diabetes, por exemplo, de infiltração de macrófagos de ilhotas. Isto será abordado utilizando técnicas estabelecidas, e modelos animais de diabetes DM2 e abre a possibilidade de novas áreas de intervenção terapêutica em uma doença que atinge proporções epidêmicas em todo o mundo

Sabe-se que o paciente diabético tipo I tem maior predisposição a infecções secundárias. Estudos prévios do nosso grupo observaram que parte desta predisposição é função da carência relativa de insulina. Para melhor compreender a fisiopatologia do diabetes, faz-se necessário estudo em modelos animais. Assim, em trabalho anterior observamos que alterações inflamatórias no pulmão, tais como, infiltrado celular, produção de citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-10) e moléculas de adesão encontravam-se reduzidas em ratos diabéticos (aloxana, 42 mg/kg, i.v.) instilados com lipopolissacarídeo (LPS), quando comparado com animais não diabéticos sob o mesmo estímulo. O tratamento dos animais com dose única de insulina corrigiu tais alterações. No entanto, a diabetes é uma doença complexa que envolve, simultaneamente, a participação de várias células, citocinas e mediadores inflamatórios. Novos estudos têm sugerido que um processo celular essencial, a autofagia, está alterado em células β das ilhotas pancreáticas, promovendo sua degeneração. Sabe-se pouco das alterações de processos autofágicos em macrófagos e se a alteração das atividades fagocitárias deve-se ao comprometimento desse processo fisiológico. O modelo de diabetes proposto neste projeto visa estudar o processo autofágico (induzido rapamicina) em macrófagos alveolares (MA) bem como em seus precursores e na organização do tecido linfoide secundário. Assim, neste novo projeto pretende-se avaliar a influência da insulina na autofagia em ratos diabéticos e sadios.

Na sepse por CLP, o LPS das bactérias Gram-negativas, contribui de forma importante para SARA, por ativação dos TLRs. O pulmão é um dos órgãos afetados na sepse e os MAs podem contribuir para SARA decorrente da sepse, liberando uma segunda onda de mediadores inflamatórios amplificando esta resposta. Nós encontramos recentemente que o LPS estimula em MAs de rato as vias de sinalização intracelular, induz a expressão de enzimas e que o pré-tratamento dos MAs com insulina inibiu todos estes efeitos do LPS. Resultados recentes em nosso laboratório mostram que a capacidade fagocítica de MAs de ratos diabéticos para alvos opsonizados por IgG está diminuída em comparação com MAs de animais sadios. Portanto, nossa hipótese de trabalho é a que insulina possa modular a inflamação e a imunidade inata no pulmão durante a sepse. Será utilizado um modelo de carência relativa de insulina. Assim, na primeira parte deste projeto pretendemos estudar a intervenção da insulina na inflamação pulmonar decorrente da sepse, analisando os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas, expressão de moléculas de adesão e vias de sinalização envolvidas. Animais não-diabéticos com sepse grave receberão dose única (a ser definida) de insulina NPH, por via subcutânea, 8 horas antes do experimento ou diariamente durante 10 dias. Os níveis glicêmicos serão determinados antes e 8 horas após do tratamento com insulina. Em paralelo, será estudado o papel da insulina na imunidade inata no pulmão analisando a atividade fagocítica e microbicida dos MAs.

A sepse é acompanhada de síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) e constitui causa freqüente de morte nas unidades de terapia intensiva. O desfecho clínico de cada paciente dependerá da eficácia do sistema imunológico, que está comprometido em indivíduos diabéticos. Na sepse por bactérias Gram-negativas, o LPS contribui de forma importante para SIRS por ativação dos receptores Toll-like. O pulmão é um dos órgãos afetados na sepse e existe a hipótese dos macrófagos alveolares (MAs) contribuírem para SIRS decorrente da sepse, liberando uma segunda onda de mediadores inflamatórios amplificando esta resposta. Nós encontramos recentemente que o LPS adicionado a MAs de rato in vitro estimula várias vias de sinalização intracelular (MAPK, PI3K e NF-κB) e induz a expressão de iNOS e COX-2 e que o pré-tratamento dos MAs com insulina inibiu todos estes efeitos do LPS. Sendo assim, seria esperado que a insulina afetasse a evolução da SIRS decorrente de sepse por inibir os mediadores liberados pelo pulmão. O objetivo da primeira parte do projeto é comparar a evolução da sepse em animais diabéticos e não diabéticos e o efeito da insulina em doses insuficientes para normalizar a glicemia na sobrevida e em parâmetros hemodinâmicos (gasometria arterial, sódio, potássio, lactato e hematócrito). Na segunda parte do projeto nos propomos a estudar a inflamação pulmonar decorrente da sepse comparando animais diabéticos e não diabéticos. Para isto serão determinados os níveis de citocinas (IL1, TNF, IL-6, MIF-1, IFN, IL-4, IL-10, IL-12 e CINC-1) no pulmão, a expressão de moléculas de adesão (E-selectina, P-selectina e ICAM-1) no endotélio vascular e as vias de sinalização (MAPK, PI3K e NF-kB) acionadas no pulmão na vigência da sepse.

O reconhecimento dos microorganismos pelos fagócitos envolve complexos de receptores (PRRs) que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), receptores para opsoninas (Fc gama e C3b), receptores do tipo toll, além de receptores para mediadores inflamatórios. Existem evidências de interações entre os receptores da imunidade inata, receptores Fc gama e receptores para eicosanóides, e que estas interações influenciam as funções efetoras dos macrófagos, tais como fagocitose e atividade microbicida. Estas interações podem ocorrer entre os receptores presentes em rafts lipídicos e/ou proteínas G envolvidas que levam a indução de diferentes vias de transdução de sinal elicitadas pela ativação destes receptores. Recentemente, demonstramos que o leucotrieno B4 aumenta a atividade microbicida de macrófagos alveolares infectados com Klebsiella pneumoniae (opsonizada com anticorpos) e que este aumento é dependente da ativação de PKC - delta e subseqüente ativação da NADPH oxidase. Não se sabe, entretanto se os leucotrienos interferem com a formação do fagolisossomo, um passo fundamental no controle de infecção por macrófagos. Assim, a primeira parte deste projeto tem por objetivo caracterizar as vias de sinalização acionadas em macrófagos alveolares pela ativação dos receptores Fc gama, receptores tipo toll e receptores para leucotrienos, individualmente ou em associação, e as conseqüências na fagocitose, formação do fagossomo e atividade microbicida. Na inflamação pulmonar os leucócitos que migram para o pulmão são fundamentais na indução e resolução do processo inflamatório mas podem também ser importantes efetores de lesão tecidual.

A insulina regula o metabolismo celular modulando a atividade de proteínas envolvidas na sinalização intracelular. Entretanto, pouco se conhece sobre quais cascatas de sinalização a insulina age. Neste projeto pretende-se avaliar o papel da insulina nas vias de sinalização celular acionadas na vigência da inflamação pulmonar induzida por LPS e na inflamação alérgica pulmonar em ratos, enfocando as vias da MAPK, ERK e NF-kB. Para tanto será feita uma análise comparativa destas vias em homogenatos de pulmões ou em macrófagos isolados do BAL de ratos normais e diabéticos submetidos à inflamação por LPS ou alérgica e o efeito da reposição de insulina. Inicialmente será feita a extração diferencial de proteínas citoplasmáticas e nucleares no pulmão, utilizando o reagente NE-PER® (Pierce tecnology); seguida da determinação na fração de proteínas citoplasmáticas, das proteínas p38 (43 kDa), pERK1/2 (44/42 kDa) e plKB (41 kDa), e na fração de proteínas nucleares, das proteínas Phosp-p65-NF-kB (65 kDa) e total-p65-NF-kB (65 kDa) por Western Blot. A via do NF-kB está relacionada com a expressão das enzimas COX2 e iNOS responsáveis pela produção de moléculas inflamatórias e reguladores celulares importantes, como PGs e oxido nítrico. Assim, será avaliada também a expressão destas enzimas em macrófagos alveolares de ratos nas condições acima.

Dados recentes, obtidos no laboratório, sugerem que a redução do infiltrado celular inflamatório em animais, tornados diabéticos pela injeção de aloxana, decorra de alterações na produção/liberação de citocinas. Verificou-se redução da concentração de TNF no sobrenadante do lavado broncoalveolar de ratos diabéticos, em modelo de inflamação pulmonar aguda induzida por LPS. Situação análoga foi observada ao se proceder à detecção imunocitoquímica de TNF em células mononucleares, em modelo de inflamação alérgica pulmonar. Neste projeto pretende-se verificar a intervenção da insulina sobre a produção/liberação de citocinas, com atividade pró-inflamatória e anti-inflamatória, utilizando-se modelo de inflamação pulmonar aguda, induzida por LPS, e modelo de inflamação alérgica pulmonar. A metodologia se baseia na: a) dosagem de citocinas (TNF alpha, IL-1 beta, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13 e IFN gama, no lavado broncoalveolar dos animais por técnica de ELISA; b) extração, quantificação e eletroforese do RNA total de linfócitos (linfonodo mesentérico) e neutrófilos do sangue dos animais; c) determinação do conteúdo de RNA para as citocinas, por técnica de RT-PCR.