José Ribamar dos Santos Ferreira Júnior.

Mucopolissacaridoses (MPSs) são uma subclasse de doenças lisossomais causadas pordeficiência em enzimas que catabolizam glicosaminoglicanos; carboidratos cujo acúmulo noslisossomos causa alterações esqueléticas, cardiopulmonares, auditivas e neurocognitivas. AMPS de tratamento mais difícil é a que envolve comprometimento cognitivo grave, asíndrome de Sanfilippo, ou MPS tipo III. Nesta doença ocorre acúmulo de heparan-sulfatonos lisossomos, organelas importantes para o desenvolvimento e homeostase dos neurônios.No presente projeto, propõe-se estudar mutações que afetam a função da alfa-Nacetilglicosaminidase (NAGLU, MPS IIIB), a qual contribui com cerca de 30 dos casos deSíndrome de Sanfilippo. Pretende-se construir o primeiro modelo experimental para estudaresta doença na levedura Saccharomyces cerevisiae, a fim de realizar estudos funcionais daproteína NAGLU e suas variantes, que apresentam problemas de enovelamento. Para sedeterminar a localização celular de NAGLU, esta proteína será fusionada à cauda fluorescentevermelha mScarletI; a atividade enzimática será medida diretamente no extrato de celular, emensaio na presença do substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-N-acetil-alfa-glicosaminídeo; aestabilidade protéica, mensurada por interrupção da tradução com cicloheximida e rastreio daproteína com Western blot. O fator de transcrição Hsf1p de S. cerevisiae ativa a expressão devárias proteínas envolvidas em reenovelamento proteico. Será estudado se há um nível deexpressão de Hsf1p capaz de resolver o problema do enovelamento dos mutantes de NAGLU.Se bem-sucedida, esta prova de conceito indicará que a modulação da expressão da proteínaHSF1 humana poderá tornar-se um tratamento potencial da síndrome de Sanfilippo.

Apoptose é um processo ativo de morte celular altamente organizado que auxilia a organogênese e a remodelação tecidual, durante o desenvolvimento embrionário. No sistema imune, a apoptose participa da seleção negativa de células da linhagem linfoide, e elimina células neoplásicas e infectadas por vírus, após ação de linfócitos T citotóxicos e células natural killer. Alterações nos mecanismos indutores ou inibidores da apoptose são causas de doenças que levam à neurodegeneração, autoimunidade e ao câncer. Em mamíferos, HSP27 é uma chaperona molecular envolvida na remodelação de agregados proteicos e no aumento da sobrevivência celular. Sua função citoprotetora está relacionada com a supressão das vias da apoptose por interação com proteínas pró-apoptóticas como Bax, Bak e tBid, além de fatores apoptogênicos como o citocromo c e com as caspases iniciadoras. Em algumas neoplasias, HSP27 torna-se superexpressa e inibe a apoptose de células tumorais, favorecendo a oncogênese e a resistência ao tratamento quimioterápico. O objetivo deste projeto é construir um sistema em Saccharomyces cerevisiae que reproduz a supressão da morte celular programada mediada pela proteína HSP27 humana. Será utilizado peróxido de hidrogênio ou ácido acético para induzir a morte celular programada, quando serão medidas, ao longo do tempo, a viabilidade celular, liberação de citocromo c, exposição de fosfatidilserina na face exoplasmica da membrana citoplasmática, a atividade da metacaspase Yca1p e verificado se HSP27 suprime o fenótipo de morte por expressão de fatores pró-apoptóticos. O sistema será validado por rastreamento de biblioteca de produtos naturais isolados, que potencialmente atuariam contra neoplasias.

O envelhecimento populacional está em constante crescimento, sendo acompanhado por uma maior incidência de doenças crônicas e neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson e Huntington. Sabe-se que parte destas doenças são causadas pelo acúmulo de proteínas mal-enoveladas, e estudos têm apontado que os componentes do sistema ubiquitina-proteassomo são um potencial alvo terapêutico para doenças relacionadas ao processo senil do envelhecimento. A superexpressão da chaperona Hsp27 é capaz de aumentar a atividade catalítica do proteassomo e a degradação de proteínas ubiquitinadas. Em vista disso, o presente projeto visa analisar o efeito da superexpressão de Hsp27 humana, sob o controle de onze promotores mutantes TEF, na longevidade de S. cerevisiae. Os ensaios que serão realizados envolvem a determinação da longevidade cronológica e replicativa, ensaio de termotolerância, resistência ao estresse oxidativo e determinação da atividade do proteassomo. O conhecimento de como Hsp27 atua no proteassomo de modo a controlar a longevidade é essencial para o futuro desenvolvimento de terapias que poderiam controlar a expressão gênica da proteína e modular os fenótipos observados na senescência em humanos.

Células da levedura Saccharomyces cerevisiae adaptam-se ao estado fisiológico de suas mitocôndrias, ativando a transcrição de genes nucleares, uma comunicação interorganelas conhecida como sinalização retrógrada. Essa sinalização é controlada pelo complexo de fatores de transcrição Rtg1p-Rtg3p. Alta atividade mitocondrial mantém essas proteínas sequetradas no citoplasma, enquanto que, em células com disfunção nas mitocôndrias, o complexo migra para o núcleo, onde ativa a transcrição de genes envolvidos na produção de a-cetoglutarato, o precursor de glutamato. A proteína Rtg2p é um modulador positivo deste sistema que, ao se ligar ao fator negativo Mks1p, permite que o complexo Rtg1/3p desloque-se para o núcleo. Embora tenha homologia com exopolifosfatases, possua domínio N-terminal importante para sua função e participe dos mecanismos de envelhecimento em levedura, nenhum mapeamento estrutural detalhado foi realizado em Rtg2p. O objetivo deste trabalho é identificar os determinantes estruturais de Rtg2p, envolvidos na sinalização retrógrada e no envelhecimento de S. cerevisiae. Serão realizados seccionamentos na proteína e produzidos mutantes pontuais através de desenho racional por análise de comunidades de aminoácidos correlacionados. A função dessas proteínas mutantes será analisada tanto para a sinalização retrógrada quanto para o envelhecimento replicativo. Os resultados deste trabalho poderão ter implicações com funções mitocondriais envolvidas nos processos de envelhecimento, morte celular programada e com doenças neurodegenerativas causadas por deficiência mitocondrial

Células da levedura Saccharomyces cerevisiae adaptam-se ao estado fisiológico de suas mitocôndrias, ativando a transcrição de genes nucleares, uma comunicação interorganelas conhecida como regulação retrógrada. Existem dois tipos de regulação retrógrada: RTG-dependente e RTG-independente. Na primeira, essa sinalização é controlada pelo complexo de fatores de transcrição Rtg1p-Rtg3p. Alta atividade mitocondrial mantém essas proteínas sequestradas no citoplasma, enquanto que, em células com disfunção nas mitocôndrias, o complexo Rtg1p-Rtg3p migra para o núcleo, onde ativa a transcrição de seus genes-alvo. No segundo tipo de regulação retrógrada ocorre independência dos fatores Rtg1p e Rtg3p (RTG-independente). Esse tipo de sinalização possui apenas um gene bem caracterizado, ATO3, que codifica um provável transportador de amônio. O objetivo deste projeto é a caracterização de três ORFs, YJL037W, YIL057C e YJL213W, que possuem resposta retrógrada RTG-independente. Para cada ORF será realizado o mapeamento do promotor, a fim de identificar o fator de transcrição majoritário, envolvido na regulação retrógrada; ensaios de varreduras fenotípicas, localização celular e identificação de genes letais sintéticos, que permitirão inferir a função das prováveis proteínas codificadas. Os resultados deste trabalho poderão ter implicações com funções mitocondriais envolvidas nos processos de envelhecimento, morte celular programada e com doenças neurodegenerativas causadas por deficiência mitocondrial.