Sandra Helena Poliselli Farsky.

Nosso grupo de pesquisa tem mostrado o papel de neutrófilos e da proteína Anexina A1 (AnxA1) em diferentes processos de agressão ao organismo. Neste contexto mostramos que neutrófilos e a AnxA1 são fundamentais para a implantação do blastocisto e para tolerância materna na gestação; que a AnxA1 secretada por neutrófilos pode estar envolvida na metástase pulmonar do melanoma; e que a AnxA1 é fundamental para a ação de fármacos empregados para o tratamento da colite experimental. Para dar continuidade a estas pesquisas, este projeto tem por objetivos aprofundar os mecanismos de ação do neutrófilo e da AnxA1 quanto: 1) a implantação do blastocisto e formação da placenta, bem como na evolução da gestação a termo e no desenvolvimento do feto empregando animais tratados farmacologicamente para depleção de neutrófilos no momento da implantação do blastocisto (dia 1-3 da gestação); 2) a metástase do melanoma em animais depletados para neutrófilos, bem como correlacionar com o perfil de neutrófilos e de AnxA1 no sangue e amostras obtidos de pacientes em diferentes estágios do melanoma; 3) a composição da microbiota intestinal na ausência e presença de colite experimental em animais deficientes de AnxA1 ou selvagens. Serão empregados ensaios de citometria de fluxo, histológicos, imunofluorescência quantificações de expressões gênicas e proteicas, dosagens de mediadores químicos por ELISA e sequenciamento gênico. O projeto conta com a colaboração de pesquisadores nacionais e internacionais e com estudantes de pós-graduação. Os resultados obtidos contribuirão para o entendimento do sistema imune inato em pontos chaves do organismo frente a agressões de diferentes naturezas, contribuindo, assim, para diversas frentes do conhecimento. Vale ressaltar que tivemos grande avanços nos estudos sobre a AnxA1, os quais permitem a concepção deste projeto, em um projeto temático financiado pela FAPESP em 2014 (2014/07328-4).

O projeto foi realizado durante o estágio concedido no Edital CAPES -Print 41/2017- Programa de Professor Visitante no Sênior. Processo: 88887 71 6166/2022-00. O projeto foi realizado no Albert Einstein College of Medicine- Nova Iorque, Estados Unidos, coordenado pelo Prof. Michael Aschner. A bolsa foi solicitada pelo Programa de Pós-Graduação em Farmácia - Fisiopatologia e Toxicologia (PPGFT) Nota 7 CAPES da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. O projeto foi realizado entre março a setembro de 2023. O objetivo do projeto foi a introdução a modelos alternativos para estudos toxicológicos, entre os quais o Caenorhabditis elegans que tem sido empregado com sucesso em diferentes estudos científicos.

A	incidência de	artrite	reumatoide (AR)		é	crescente	no	mundo,	o	que	leva	a	preocupações	de	saúde	 pública,	 já que	 a	 doença	 causa	 morbidade	 crônica,	 não	 há	 tratamentos	 totalmente	eficazes,	e	os	existentes,	como	os	fármacos	biológicos,	são	de	alto	custo.	A	gênese	da	AR	tem	base	genética	e	ambiental,	sendo	que	neste	último	contexto,	a	exposição	ao	tabaco	se	destaca.Pelo	 fato	 do	 reconhecido	 malefício	 da	 exposição	 ao	 tabaco	 à	 saúde	 humana,	 algumas	
estratégias	têm	sido	desenvolvidas	em	escala	industrial	para	diminuir	a	exposição	aos	inúmeros	compostos	tóxicos	da	combustão	do	tabaco.	Dentre	os	produtos	desenvolvidos	está	o	IQOS	 (I	
quit	 ordinary	 smoking),	 desenvolvido	 pela	 empresa	 Philip	Morris	 International?, baseado	 na	tecnologia	 heat-not-burn, que	 leva	 o	 aquecimento	 do	 tabaco	 contendo	 nicotina, reduzindo	marcantemente a	liberação	dos	produtos	da	combustão.	No	presente	projeto	visamos	avaliar	os	efeitos do	IQOS na	AR	e	os	mecanismos	da	toxicidade	responsáveis	pelos efeitos	observados.	Para	tanto,	a	AR	será	induzida	em	camundongos	machos	da	linhagem	DBA1/J, pela	injeção	na	base	 da	 cauda de colágeno de	 galinha,	 e	 os	 animais	 serão	 expostos	 nos	 últimos	 7	 dias	 da	evolução	da doença	ao	vapor	aquecido	do	tabaco	(iQOS),	ao	cigarro	convencional	e ao	ar	fresco	
em	câmaras	de exposição	isoladas,	simultaneamente.	Os	animais	expostos	ao	cigarro	e	ao	IQOS	receberão	 a	 mesma	 concentração	 de	 nicotina.	 Ao	 fim	 	 dos	 experimentos	 (35	 dias	 após	 a	indução	 da	 AR),	 os	 animais	serão	 analisados	 quanto	 aos	 parâmetros	 clínicos	 da	 doença	 e	 as	seguintes	amostras	biológicas	serão	coletadas:	1)	sangue	para	o	leucograma	total	e	diferencial	
e	 para	 quantificação	 de	 nicotina,	 cotinina	 e	 carboxihemoglobina;	 2)	 líquido	 e	 membrana	sinovial	para	estudos	histológicos,	bioquímicos	e	de	biologia	molecular	para	a	caracterização	da		inflamação;	3)	amostras	de linfonodo	e	baço	para	caracterização	dos	subtipos	de	leucócitos;	4)	amostras	 de pulmão e	 fígado	 para	 quantificação	 de	 proteínas	 envolvidas	 na	 AR.	 Ademais,	
linfócitos	 primários	 coletados	 do	 baço	 dos	animais	ou	 cultura	de	 sinoviócitos	humanos	serão	expostos	 in	 vitro ao	 IQOS,	 cigarro	 ou ar fresco em	 câmaras de	 exposição	 celular.	 Serão	investigados os	efeitos	das	exposições	 sobre	a	proliferação	e	polarização	de	linfócitos	Th17 e	
Treg,	visto	que	o	balanço	destes	é	um	mecanismo	descrito	para	a	gênese	da	AR	na	exposição	ao	cigarro;	 em	 sinoviócitos	 expostos	 serão	 avaliados	 parâmetros	 inflamatórios e	 de	 estresse	oxidativo.	Vale	 ressaltar	 o	ineditismo	 do	 projeto,	em	especial	 no	Brasil,	e	que	 os sistemas de	exposição	in	vivo e		in	vitro empregados são únicos no	Brasil	e	montados pelo	nosso	grupo	de	
pesquisa	 com	 todos	 os	 controles	 exigidos	 internacionalmente	 para	 as	 exposições.	 Assim,	 os	resultados	obtidos	serão	fundamentais para	o	esclarecimento	do	potencial do	vapor	de	tabacoaquecido	na	redução	de	risco	à exposição	ao	tabaco.

A	incidência de	artrite	reumatoide (AR)		é	crescente	no	mundo,	o	que	leva	a	preocupações	de	saúde	 pública,	 já que	 a	 doença	 causa	 morbidade	 crônica,	 não	 há	 tratamentos	 totalmente	eficazes,	e	os	existentes,	como	os	fármacos	biológicos,	são	de	alto	custo.	A	gênese	da	AR	tem	 base	genética	e	ambiental,	sendo	que	neste	último	contexto,	a	exposição	ao	tabaco	se	destaca.
Pelo	 fato	 do	 reconhecido	 malefício	 da	 exposição	 ao	 tabaco	 à	 saúde	 humana,	 algumas	estratégias	têm	sido	desenvolvidas	em	escala	industrial	para	diminuir	a	exposição	aos	inúmeros	compostos	tóxicos	da	combustão	do	tabaco.	Dentre	os	produtos	desenvolvidos	está	o	IQOS	 (I	quit	 ordinary	 smoking),	 desenvolvido	 pela	 empresa	 Philip	Morris	 International,, baseado	 na	tecnologia	 heat-not-burn, que	 leva	 o	 aquecimento	 do	 tabaco	 contendo	 nicotina, reduzindo	 a	liberação	dos	produtos	da	combustão.	No	presente	projeto	visamos	avaliar	os	efeitos do	IQOS na	AR	e	os	mecanismos	da	toxicidade	responsáveis	pelos efeitos	observados.	
Para	tanto,	a	AR	será	induzida	em	camundongos	machos	da	linhagem	DBA1/J, pela	injeção	na	base	 da	 cauda de colágeno de	 galinha,	 e	 os	 animais	 serão	 expostos	 nos	 últimos	 7	 dias	 da	evolução	da doença	ao	vapor	aquecido	do	tabaco	(iQOS),	ao	cigarro	convencional	e	ao	ar	fresco	
em	câmaras	de exposição	isoladas,	simultaneamente.	Os	animais	expostos	ao	cigarro	e	ao	IQOS	receberão	 a	 mesma	 concentração	 de	 nicotina.	 Ao	 fim	 	 dos	 experimentos	 (35	 dias	 após	 a	indução	 da	 AR),	 os	 animais	serão	 analisados	 quanto	 aos	 parâmetros	 clínicos	 da	 doença	 e	 as	seguintes	amostras	biológicas	serão	coletadas:	1)	sangue	para	o	leucograma	total	e	diferencial	e	 para	 quantificação	 de	 nicotina,	 cotinina	 e	 carboxihemoglobina;	 2)	 líquido	 e	 membrana	
sinovial	para	estudos	histológicos,	bioquímicos	e	de	biologia	molecular	para	a	caracterização	da		inflamação;	3)	amostras	de linfonodo	e	baço	para	caracterização	dos	subtipos	de	leucócitos;	4)	amostras	 de pulmão e	 fígado	 para	 quantificação	 de	 proteínas	 envolvidas	 na	 AR.	 Ademais,	linfócitos	 primários	 coletados	 do	 baço	 dos	animais	ou	 cultura	de	 sinoviócitos	humanos	serão	
expostos	 in	 vitro ao	 IQOS,	 cigarro	 ou ar fresco em	 câmaras de	 exposição	 celular.	 Serão	
investigados os	efeitos	das	exposições	 sobre	a	proliferação	e	polarização	de	linfócitos	Th17 e	Treg,	visto	que	o	balanço	destes	é	um	mecanismo	descrito	para	a	gênese	da	AR	na	exposição	ao	cigarro;	 em	 sinoviócitos	 expostos	 serão	 avaliados	 parâmetros	 inflamatórios e	 de	 estresse	oxidativo.	 Vale	 ressaltar	 o	ineditismo	 do	 projeto,	em	especial	 no	Brasil,	e	que	 os sistemas de	exposição	in	vivo e		in	vitro empregados são únicos no	Brasil	e	montados pelo	nosso	grupo	de	
pesquisa	 com	 todos	 os	 controles	 exigidos	 internacionalmente	 para	 as	 exposições.	 Assim,	 os	resultados	obtidos	serão	fundamentais para	o	esclarecimento	do	potencial do	vapor	de	tabaco aquecido	na	redução	de	risco	à exposição	ao	tabaco.

A inflamação é uma resposta primordial, complexa e altamente conservada na escala evolutiva do sistema imune inato a uma lesão física, a exposição a xenobióticos e a infecções, com o intuito de promover a homeostasia. Ainda, a inflamação é fundamental para algumas condições especiais do organismo, como para o sucesso da gestação, e na obesidade. O objetivo final da inflamação não é somente exterminar os agentes lesivos do microambiente acometido, mas, quando necessário, estimular o processo de cicatrização. Em casos de ineficácia ou exacerbação destes fenômenos, as lesões teciduais e as infecções podem não ser efetivamente controladas, com consequente prejuízos ao tecido afetado e riscos para o organismo, e, assim, falhas no controle do processo inflamatório estão envolvidas na gênese de uma diversidade de doenças. 
Apesar da inflamação ser um processo altamente estudado, os mecanismos de indução e resolução do processo precisam ser melhor elucidados, em especial para identificar alvos para a terapêutica. 
Nós e outros pesquisadores, entre os quais os nossos colaboradores Dr. Egle Solito e Dr. Mauro Perretti - do William Harvey Research Institute, School Medical and Dentistry, Queen Mary University of London (WHRI-SMD-QMUL, UK), temos mostrado a relevância da Anexina A1 (ANXA1), uma proteína secretada pela ação dos glicocorticóides endógenos, em diferentes sistemas biológicos, o que tem fornecido evidências sólidas para propor as vias de ativação da ANXA1 como alvos importantes para terapêutica anti-inflamatória. 
Nosso laboratório ainda tem investigado as ações moduladoras de outros compostos endógenos, como o receptores ativados por proliferador de peroxissomo (PPAR) e do receptor periférico para benzodiazepínicos, conhecido como TSPO ? translocator protein. Ativação destes receptores modula funções de neutrófilos e, intrigantemente as expressões ou ações de ambos parecem ser controlados pelos glicocorticoides endógenos e pela ANXA1. 
Com base nos resultados preliminares do nosso grupo, este projeto temático tem por objetivo:
1) Investigar os mecanismos moleculares de ação da ANXA1 no controle das ações de neutrófilos, macrófagos e células da glia, focando no controle da granulopoese, e a conexão com os receptores TSPO e PPAR na inflamação periférica e do sistema nervoso central; 
2) Investigar o mecanismo molecular das ações da ANXA1 no controle da inflamação durante o processo reprodutivo;
3) Investigar o papel do TSPO no controle da proliferação e diferenciação em adipócitos, responsáveis por regular a fisiologia do peso corporal. 
Em conjunto, os objetivos do presente projeto contribuirão para a identificação de novos alvos terapêuticos, e novas moléculas para a inovação do tratamento da inflamação, bem como para novas formulações farmacêuticas. Para tanto, esta solicitação está sendo realizada em um projeto temático, visto que é amplo, requer expertises diversas e participação de um grupo multidisciplinar, com colaborações com grupos de excelência nacionais e internacionais, para atingir os seus resultados e, essencialmente, o seu sucesso. 
Este projeto será sediado no Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP (FCF-USP). A proposta de pesquisa e ensino do Departamento compreende o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na gênese de diferentes doenças de origem inflamatórias/infecciosas, hematológicas e neoplásicas, no sentido de fornecer bases para desenvolvimento de estratégias diagnósticas e terapêuticas. Esta é a temática do programa de pós-graduação do departamento ? Farmácia - modalidade análises clínicas ? avaliado como nota 7 pela CAPES na área da Farmácia. Desta forma, este projeto se insere dentro das metas do Departamento no ensino e na pesquisa.

A Diabetes (DM) é uma doença que acomete atualmente 285 milhões de pessoas em todo o mundo. Em 2030, estima-se que 428 milhões de pessoas apresentem esta doença (IDF, 2010). Uma vez que a literatura relata uma possível associação entre a DM e a exposição aos poluentes orgânicos persistentes (POPs), como as bifenilas policloradas (PCBs), o presente projeto visa investigar se a exposição ao PCB n°126 (3,3',4,4',5-Pentaclorobifenil) desencadeia alterações endógenas envolvidas na gênese da diabetes do tipo II. Para tanto, ratos Wistar machos serão expostos por instilação ao PCB126 nas concentrações de 1 ou 10 ppb (1 ou 10 µg/L). Animais expostos ao veículo serão utilizados como controle. 24 horas após a última exposição, os animais serão sacrificados para coleta do sangue circulante e pâncreas. Em amostras de sangue, serão avaliados: o número de células circulantes; a expressão de moléculas de adesão em leucócitos circulantes, por citometria de fluxo; os níveis plasmáticos de moléculas de adesão circulantes de atividade endotelial e a concentração de citocinas próinflamatórias, como IL-1alfa, TNF-alfa e IL-6 por kits de ELISA e o NO, por Reação de Griess; o perfil bioquímico e lipídico, a concentração de insulina e glicose basal e o teste de tolerância à glicose intravenoso. Em amostras de tecido pancreático, serão avaliados: a pureza e a viabilidade morfológica das ilhotas pancreáticas; a atividade da mieloperoxidase; a estereologia do pâncreas; a proteômica para o perfil de proteínas inflamatórias; a expressão dos receptores AhR e PPARs por western blot, e por microscopia intravital será analisada a interação leucócito-endotélio no pâncreas. Os dados obtidos poderão contribuir para a elucidação dos efeitos causados pela exposição aos PCBs, possivelmente sobre alterações observadas durante o desenvolvimento da diabetes do tipo II.

A nanotecnologia tem atraído interesse em diferentes áreas, entre as quais a farmacêutica. Dentre os diversos produtos nanotecnológicos disponíveis, os sistemas nanoparticulados ganham destaque por proporcionar vetorização de forma sustentada e por atuar como carreadores de fármacos, aumentando a eficácia terapêutica. Estas características são fundamentais para o tratamento de inúmeras doenças, entre as quais as neoplasias. Apesar das inúmeras vantagens dos nanofármacos antineoplásicos, os parâmetros farmacológicos e toxicológicos desta estratégia terapêutica precisam ser melhor entendidos. Neste contexto, o presente estudo visa avaliar a atividade anti-carcinogênica e os possíveis efeitos tóxicos de nanocápsulas de eugenol e da solução de eugenol. Para tanto, os ensaios in vivo serão realizados em camundongos machos C57BL6 que receberão, por via endovenosa ou intraperitoneal, nanocápsulas de eugenol marcadas ou não com fluoróforo (Rodamina B) ou a solução de eugenol. Após as administrações serão avaliados, por ensaios de microscopia intravital, a distribuição das nanocápsulas na microcirculação da massa tumoral de melanoma (B16F10) no tecido subcutâneo dorsal e no tecido hepático, a interação leucócito-endotélio, a formação de trombos e de áreas hemorrágicas na área que circunda o tumor e em vasos da microcirculação hepática, a eficácia terapêutica pela mensuração da cinética de formação da massa tumoral no tecido subcutâneo dorsal e a morfologia do fígado a da região tumoral no dorso de camundongos por coloração com hematoxilina e eosina. Adicionalmente, linhagens celulares Sk-Mel-28 e HUVEC, de melanoma e endotélio humano, respectivamente, serão tratadas in vitro com as preparações farmacêuticas para avaliar a viabilidade, a proliferação e o ciclo celular, além da fragmentação do DNA por ensaios de citometria de fluxo, a aderência celular por espectrofotometria e a migração celular em Matrigel por microscopia óptica. A realização desses ensaios poderá determinar um conjunto de estratégias in vitro e in vivo para avaliação da atividade terapêutica e tóxica de nanocápsulas voltadas à vetorização de fármacos anti-neoplásicos, além de contribuir para os conhecimentos de possíveis ações tóxicas do eugenol na rede microcirculatória. Adicionalmente, a realização deste projeto favorecerá o estabelecimento de protocolos de estudos em microscopia intravital para o estudo em nanotecnologia, ainda inéditos no Brasil, além de reforçar a colaboração com os grupos das Dras Silvia Gutérres e Adriana Polhmann da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, especialistas na produção de nancompostos para aplicação farmacêutica.

A úlcera gástrica e causada por desequilíbrio entre os fatores protetores e agressores, sendo caracterizada pela formação de lesões e necrose do tecido gástrico. O processo é marcado por intensa migração de neutrófilos, que no primeiro momento, atuam como mecanismo de defesa. No entanto, a atividade secretora dos neutrófilos contribui para o processo lesivo. Os tratamentos farmacológicos atuais são efetivos, porém, causam efeitos adversos, o que leva a busca por novos agentes terapêuticos. Neste contexto, a literatura recente tem proposto que os agonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPARs), bem como os compostos naturais, como o ácido clorogênico (ACG), possam ser empregados como agentes antiúlcera. Desta forma, este projeto tem o objetivo de investigar a ação da molécula indol-tiazolidínica agonista parcial de PPAR-g (Lyso-07) e do ACG, um composto polifenólico isolado de Lychnophora salicifoli, sobre a instalação e cicatrização da úlcera gástrica experimental em camundongos provocada por agentes exógenos distintos e investigar os possíveis mecanismos de ação envolvidos. Camundongos Swiss, machos serão tratados com Lyso-07 (5, 25 e 50 mg/kg) ou ACG (5, 25 e 50 mg/kg), 1 hora antes dos tratamentos químicos (etanol 60% + HCl 0,03M ou indometacina, 100mg/kg; gavagem) para indução da úlcera. Para avaliar o efeito da Lyso-07 ou o ACG sobre a cicatrização do processo, lesão ulcerativa crônica será induzida por ácido acético (20 mL, solução 20%, na camada sub-serosa estomacal) e o Lyso-07 ou ACG serão administrados 1 vez ao dia, durante 7 dias por gavagem. Serão coletados sangue circulante e tecido estomacal para avaliar a área da lesão, as atividades das enzimas oxidativas (ensaios bioquímicos), a produção de óxido nítrico (reação de Greiss), as secreções de citocinas pró ou antiinflamatórias (interleucinas 1², 6, 4, 10 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-±; Elisa); de prostaglandina E2 (PGE2; Elisa) e de prostaciclina (PGI2; Elisa); parâme

Nos últimos anos, a nanotecnologia tem se destacado como uma ferramenta importante para o desenvolvimento de novos produtos nas mais variadas áreas da academia e do setor privado, incluindo as de atuação farmacêutica. Dentre os produtos nanotecnológicos disponíveis na área farmacêutica, os sistemas nanoparticulados ganham destaque por proporcionar vetorização de forma sustentada e atuar como carreadores de fármacos, aumentando a eficácia terapêutica. Estas características são fundamentais para o tratamento de inúmeras doenças, dentre as quais, as neoplasias. Apesar das inúmeras vantagens dos nanofármacos anti-neoplásicos, os parâmetros farmacológicos e toxicológicos desta estratégia terapêutica precisam ser melhor compreendidos. Assim, o presente estudo visa implementar a metodologia de microscopia intravital para estudos nanotoxicológicos, ainda não abordados no Brasil, pelo estudo da atividade anti-carcinogênica e os efeitos tóxicos na microcirculação provocados pelas nanocápsulas de indometacina e de éster etílico de indometacina e de suas formulações usuais. Para tanto, ensaios serão realizados em camundongos fêmeas C57BL6, adultas, empregando nanocápsulas marcadas com fluoróforos. A distribuição das nanacápsulas e seus efeitos serão mensurados no tecido cerebral na vigência de formação de tumor cerebral induzido pela inoculação intracraniana de células da linhagem de glioma maligno GL261. Além da distribuição das nanocápsulas na microcirculação do tecido cerebral, serão analisados a interação leucócito-endotélio, leucócito-plaqueta e plaqueta-endotélio, formação de trombos e de áreas hemorrágicas em vasos da microcirculação cerebral. Complementando os ensaios de microscopia intravital, o efeito das nanocápsulas sobre a integridade da barreira hemato-encefálica será determinado em ensaio ex vivo (solução de Evans "blue") e a eficácia terapêutica dos compostos será avaliada pela mensuração da cinética de formação da massa tumoral no cérebro por meio de ensaios hi

Nosso grupo de pesquisa tem investigado os mecanismos de ação dos glicocorticóides endógenos (GCe) sobre a mobilização neutrofílica em condições fisiológicas e de inflamação induzida por diferentes estímulos. Neste contexto, temos mostrado que os GCe controlam as interações dos neutrófilos circulantes com o endotélio microvascular e que as ações moleculares dos GCe sobre as funções adesivas destas células são distintas. Mais recentemente, mostramos que os GCe modulam a mobilização dos neutrófilos da medula óssea para o sangue periférico em condições fisiológicas e que a anexina A1 (ANXA1), uma proteína secretada por diferentes tipos celulares pela ação dos glicocorticóides, está envolvida neste processo, modulando a atividade fagocítica de macrófagos medulares e o eixo SDF-1a/CXCR-4. O presente estudo visa dar continuidade às investigações sobre o papel dos GCe e da ANXA-1 sobre o tráfego de neutrófilos entre a medula óssea e o sangue. Assim, propomos estudar o tráfego de neutrófilos sob diferentes concentrações de GCe (tratamentos farmacológicos com RU 38486 ou ACTH) ou na vigência de resposta inflamatória (LPS, i.p.), focando os eixos SDF-1alfa/CXCR-4, IL-17/IL-23/G-CSF e as expressões de moléculas de adesão em neutrófilos CD49d, CD18 e CD62L. Serão empregados camundongos Balb/c tratados com RU 38486 (antagonista de receptor de glicocorticóides) ou com veículo e animais nocautes para ANXA1 (ANXA1-/-) e respectivos selvagens. Adicionalmente, estes animais serão tratados com ACTH (250µg/kg; i.p.) ou com LPS (50 µg/kg; i.p.) para induzir a secreção de GCe. Os granulócitos da medula óssea e os neutrófilos circulantes serão quantificados por microscopia óptica e as análises morfológicas serão complementadas por ensaios de citometria de fluxo pela marcação de Ly6G. As expressões das moléculas de adesão CD49d, CD62L e CD18 e do receptor de SDF-1 ±, o CXCR-4, em granulócitos da medula e em neutrófilos circulantes serão quantificadas por citometria de fluxo; as concentraçõ

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico obtido a partir da metabolização endógena do benzeno, além de ser componente importante do cigarro, medicamentos, meio ambiente e estar presente em alguns alimentos. A literatura é vasta quanto aos efeitos deletérios da HQ, especialmente quando esta é decorrente da exposição ao benzeno e à fumaça do cigarro. Nosso grupo vem demonstrando que a intoxicação experimental de ratos à HQ, via intraperitoneal, compromete a migração de leucócitos para o pulmão na vigência de resposta inflamatória inata ou adquirida. 
	No presente projeto visamos investigar a reação inflamatória em camundongos expostos às doses de HQ similares às permitidas pelas agências regulamentadoras de exposição, por via inalatória, uma vez que esta é a principal via de exposição ambiental e ocupacional. Camundongos Swiss, machos, com peso entre 20-25g, serão expostos a 0,75 mg/60 mL/1 hora (12,5 ppm), 1,5mg/60mL/1 hora (25 ppm) ou 3mg/60mL/1 hora de HQ por 1 hora, 1 vez ao dia durante 5 dias. Animais controles serão expostos ao veículo pela mesma via. Após 1 hora da última exposição, inflamação pulmonar será induzida pela inalação do lipopolissacarídeo de E.coli (LPS; 100 μg/mL, 10 minutos). Três horas mais tarde, os animais serão anestesiados e o sangue circulante, o lavado broncolaveolar e o tecido pulmonar serão coletados para as seguintes quantificações: 1) o número total e diferencial de leucócitos circulantes e no lavado broncoalveolar utilizando câmara de Neubauer e esfregaços corados com solução de May-Grünwald e Giemsa; 2) o número de leucócitos no tecido pulmonar pela determinação da atividade da enzima mieloperoxidase; 3) moléculas de adesão envolvidas na interação leucócito-endotélio e na transmigração celular expressas em leucócitos circulantes (L-selectina, 2 integrina, PECAM-1, 1 integrina, 7 integrina) por ensaio de citometria de fluxo e no endotélio microvascular pulmonar (E-selectina, P-selectina, ICAM-1, VCAM-1,

Amblyomin-X é uma proteína recombinante inibidora de serinoprotease, isolada da glândula salivar do carrapato Amblyomma cajannense. Esta toxina é capaz de inibir fator X ativado; induzir apoptose em diversas linhagens de melanomas humanos ou murinos; ativar macrófagos peritoneais, além de reduzir a formação de tumores in vivo. Este último efeito parece ser dependente, pelo menos em parte, da inibição da angiogênese. Com base nas informações acima, o presente projeto tem o objetivo de caracterizar os efeitos do amblyomin-X sobre a formação de novos vasos e sobre a função de macrófagos, com o intuito de esclarecer os mecanismos envolvidos no efeito antitumoral. 
Para caracterizar o efeito da toxina sobre a formação dos vasos in vivo, será empregado o modelo da câmara dorsal em Camundongos Swiss, machos, com peso entre 18-20 g e idade de 3 a 4 meses. Por meio de microscopia intravital, a rede microcirculatória no tecido subcutâneo dorsal será avaliada antes e após diferentes protocolos de tratamentos com a toxina em condições basais, na vigência da ação de fator de crescimento vascular ou durante o crescimento tumoral. As ações da toxina sobre apoptose/necrose, proliferação, migração e expressão de moléculas de adesão será avaliada em célula endotelial em cultura da linhagem tEnd (obtida de hemangioma de timo de camundongos e transformadas por polioma vírus) na vigência ou ausência de fator de crescimento vascular. A migração celular será acompanhada em microscópio óptico invertido; a proliferação celular, as expressões de moléculas de adesão α5β3, α5β1, PECAM-1, JAM-c, E-caderina, ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1 e E-selectina e apoptose/necrose serão quantificadas por citometria de fluxo. 
Com o objetivo de elucidar os efeitos da toxina sobre macrófagos, monócitos serão obtidos de sangue circulante humano e cultivados para polarização em macrófagos M1, M2 ou tumoral. Em seguida, estas células serão incubadas com amblyomin-X e sua função fagocítica, micr

O papel pró ou antiinflamatório do óxido nítrico (NO) parece estar relacionado à concentração e a fonte do mediador nos diferentes tecidos estudados. Temos mostrado que a inibição não específica, parcial e por tempo prolongado da síntese de NO in vivo (L-NAME, 20 mg/kg, via oral, 14 dias) inibe o aumento de permeabilidade vascular e a migração de neutrófilos para o foco de lesão. A investigação dos mecanismos envolvidos mostrou, até o momento, que este tratamento reduz as interações dos leucócitos circulantes ao endotélio vascular, decorrentes, pelo menos em parte, da inibição da expressão de L-selectina em leucócitos e de PECAM-1 no endotélio. 
	Neste projeto propomos avaliar o efeito do tratamento com L-NAME sobre a capacidade de secreção de citocinas e eicosanóides com papel pró ou antiinflamatório, sobre a produção de NO e sobre a expressão das óxido nítrico sintases (NOS). Para tanto, ratos Wistar, machos, adultos serão tratados por 14 dias, via oral, com L-NAME ou com D-NAME. Os animais serão empregados como doadores de leucócitos circulantes, macrófagos peritoneais (migrados pela ação de tioglicolato) ou de músculo cremaster para obtenção de célula endotelial. Os ensaios serão delineados para:
1)	Mensurar a secreção de citocinas após estimulação in vitro com LPS ou LTB4. As concentrações de TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 ou IL-10 nos sobrenadantes das suspensões de leucócitos e da cultura de endotélio serão quantificadas por ELISA utilizando kits comerciais;
2)	Quantificar a produção de PGE2 e LTB4 após a estimulação in vitro com LPS. As dosagens serão realizadas nos sobrenadantes das suspensões de leucócitos e da cultura de endotélio, por ELISA, utilizando kits comerciais; 
3)	Avaliar a produção de NO nos sobrenadantes citados acima pela determinação da concentração de NO2-/NO3-;
4)	Determinar a expressão protéica e do RNA mensageiro de iNOS, eNOS e nNOS por "immunoblotting" e RT-PCR, respectivamente, em leucócitos e na célula endotelial.
Os re

O óxido nítrico (NO) vem adquirindo importância como uma substância liberada nos fenômenos inflamatórios, quer seja por sua ação direta sobre células e vasos, quer seja por sua interação com espécies ativas de oxigênio gerando radicais mais lesivos. No entanto, seu papel anti ou pro-inflamatório ainda é controverso. Inibidores de óxido nítrico sintases (NOS) têm sido largamente utilizados em estudos da influência do NO nos processos inflamatórios. 
O envenenamento por serpentes Bothrops jararaca (Bj), o mais comum no Brasil, é caracterizado por reação local grave, manifestada por hemorragia, necrose, dor e resposta inflamatória. Diferentemente da ação sobre o efeito sistêmico (alteração da coagulação sangüínea), a soroterapia, tratamento de escolha nos acidentes, não reverte eficazmente as reações locais, fato que representa, ainda, um problema sério de saúde pública. A ausência de terapias complementares reflete conhecimentos incompletos sobre os mecanismos de ação das diferentes toxinas do veneno e sobre a complexa mediação endógena dos efeitos. Desta forma, estudos experimentais têm sido realizados para elucidar os mecanismos envolvidos com as reações locais, na tentativa de contribuir para implantação de abordagens terapêuticas mais eficazes.
Recentemente demonstramos a participação do NO no processo local como um mediador pró-inflamatório na artrite induzida pelo veneno de Bj em coelhos. Animais pré-tratados crônica e sistemicamente com inibidor das NOS (L-NAME) apresentaram redução tanto no extravasamento protéico e como no acúmulo de leucócitos no local da lesão. Dados adicionais mostraram a inter-relação entre NO, bradicinina e derivados do ácido araquidônico nos efeitos observados e sugerem que o NO possa ser um mediador inicial do processo. 
Dando continuidade as investigações, o objetivo do presente projeto é avaliar o papel do NO no recrutamento leucocitário provocado pelo veneno de serpentes Bj em outro animal de experimentação e investigar os mecani

O benzeno é um solvente orgânico amplamente utilizado em diferentes ramificações industriais. Seu potencial tóxico tem sido amplamente demonstrado em humanos e em animais de laboratório. Desta forma, a utilização do benzeno vem sendo monitorada para que trabalhadores tenham contato reduzido com o solvente. No entanto, toxicidade, principalmente ao sistema imune, ainda tem sido descrita e neste caso, a gênese dos processos ainda não está totalmente esclarecida.
Desta forma, o presente projeto tem o objetivo estudar a resposta imune de ratos expostos a baixas doses dos produtos de biotransformação do benzeno, reconhecidamente responsáveis pela imunotoxicidade, e determinar indicadores biológicos adequados para este tipo de exposição. 
Para tanto, ratos Wistar, machos serão tratados cronicamente (50 mg/kg; i.p.; 1 uma vez ao dia, 13 doses consecutivas com intervalos de 2 dias a cada 5 doses) com hidroquinona, p-benzoquinona ou fenol e as respostas imunes serão induzidas 24 horas após a última dose dos tratamentos. Serão avaliados a capacidade de resposta dos animais à antígenos específicos (resposta inflamatória pulmonar em animais previamente sensibilizados a ovalbumina) e não específicos (injeção de glicogênio de ostra na bolsa de ar).
A quantificação das respostas in vivo e os possíveis mecanismos envolvidos serão avaliados através da determinação dos seguintes parâmetros:
1)	mobilização periférica de leucócitos, através da determinação do número de leucócitos circulantes antes do ínicio dos tratamentos químicos, antes e 6 horas após os estímulos inflamatórios;
2)	mobilização local de leucócitos (bolsa de ar e no lavado brono-alveolar), pela contagem de células no exsudato da bolsa de ar e no lavado bronco-alveolar;
3)	fenômenos de interação leucócito-endotélio in vivo ? através da determinação do número de leucócitos em comportamento ?rolling? e aderidos à parede de vênulas pós-capilares em ensaios de microscopia intravital;
4)	expressão de moléculas de ad

Os acidentes por animais peçonhentos constituem um grave problema de saúde pública no Brasil, tendo em vista o número de indivíduos acometidos anualmente e a gravidade dos acidentes. Em certos casos a terapia empregada não é eficaz, principalmente no que se refere aos efeitos locais, uma vez que a utilização dos soros específicos não neutraliza totalmente essas ações. A deficiência de uma terapia adequada e complementar à soroterapia é decorrente, pelo menos em parte, da ausência de conhecimentos mais amplos sobre os mecanismos envolvidos na ação das peçonhas. 
	No local da lesão, a peçonha de serpente Bothrops jararaca provoca grave reação local caracterizada, entre outros efeitos, pelo desenvolvimento de resposta inflamatória aguda e hemorragia. Diferentemente, a da serpente Crotalus durissus terrificus não acarreta reação local e parece exercer efeito antiinflamatório. No envenenamento pelo escorpião Tityus serrulatus observa-se alterações graves no sistema cardio-respiratório, que refletem os mais sérios sintomas do acidente. A peçonha das aranhas do gênero Loxosceles causa reações locais graves, com desenvolvimento de reação inflamatória e manifestações hemorrágicas, levando a um intenso comprometimento tecidual. Nos acidentes com lagartas de lepidópteros do gênero Lonomia, observa-se dor com ou sem formação de eritema e/ou edema além de alterações na coagulação sanguínea, que se manifestam por incoagulabilidade e lesões hemorrágicas.
	Desta forma, o objetivo do presente trabalho é investigar os efeitos das peçonhas e/ou suas toxinas isoladas ou frações específicas sobre eventos vasculares e celulares da microcirculação, responsáveis pelo desenvolvimento da resposta inflamatória e distúrbios hemostáticos.
	Para tanto, será utilizado um circuito fechado de televisão e/ou computador acoplado a microscópio óptico para o estudo da microcirculação in situ de animais anestesiados. Os protocolos experimentais a serem realizados visam investigar as ações diretas da