Thiago Olitta Basso.

Geraniol é um monoterpeno usado como fragrância em diversos produtos como cremes e produtos de limpeza e que apresenta potencial como fármaco antimicrobiano e antitumoral, por exemplo. Apesar de seu mercado crescente, sua obtenção se restringe à extração de óleos essenciais por destilação fracionada ou à síntese química, processos pouco eficientes e caros. Nesse contexto, a aplicação da engenharia metabólica para a produção desse composto por microrganismos é uma alternativa promissora. Atualmente, a expressão heteróloga da enzima geraniol sintase é testada principalmente nos microrganismos Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, em que a baixa disponibilidade do precursor acetil-CoA e a toxicidade do geraniol são os principais obstáculos para sua produção. Yarrowia lipolytica, uma levedura oleaginosa não-convencional, apresenta atributos que podem ser explorados para a produção de geraniol, possivelmente tornando-a uma hospedeira mais adequada para a sua produção heteróloga. Essas características incluem tolerância a compostos orgânicos e altos níveis de acetil-CoA citosólico, devido ao seu intenso fluxo de carbono para o metabolismo de lipídeos. Ainda, essa levedura apresenta capacidade de uso de diversas fontes de carbono, incluindo óleos e acetato, o que é notável pelo ponto de vista de estabelecimento de bioprocessos. Por essas e outras características, naturalmente esta é uma levedura que foi usada em diversos trabalhos para produção de diferentes terpenos. Ademais, um grupo de pesquisa parceiro da Dinamarca, que pode ser dito como um dos líderes na pesquisa de Y. lipolytica, desenvolveu linhagem já disponível para uso no projeto, com sete modificações genéticas visando a engenharia metabólica para a produção de monoterpenos. Assim, a presente Proposta de Projeto Inicial tem como objetivo usar essa linhagem pré-modificada para obter cepas de Y. lipolytica produtoras de geraniol e testá-las em cultivos de batelada alimentada e quimiostato. Inicialmente, será realizado experimento para evolução em frascos para obter linhagem de Y. lipolytica mais resistente a geraniol no meio. Será, então, aplicada a tecnologia de CRISPR-Cas9 para a expressão da enzima geraniol sintase (GES) sob controle de promotor semi-constitutivo hp4d, que só é ativado a partir da fase estacionária de crescimento microbiano. Dessa forma, é esperado que o efeito da toxicidade do geraniol durante o crescimento celular seja evitado, mesmo que parcialmente. Nessa etapa, serão testadas geraniol sintases originárias de três plantas distintas, a fim de se avaliar qual tem melhor produção na levedura oleaginosa. Após disso, será avaliada a expressão da enzima GES fusionada a pirofosfato de geranila (GPP) sintase, que sintetiza o precursor GPP, sob um promotor semi-consitituvo hp4d e um constitutivo TEFin. Como observado em S. cerevisiae, é esperado que a expressão das enzimas fusionadas aumente a produção de geraniol por canalizar o substrato GPP e por adicionar mais uma cópia de GES. Por fim, as linhagens evoluídas e engenheiradas serão analisadas quanto à capacidade de produção de geraniol em biorreatores. Para tal, a produção em sistema de batelada alimentada será avaliada e as condições de aeração, fontes de carbono, pH e regimes de alimentação serão otimizadas. Por fim, experimentos de evolução em laboratório serão realizados por meio de cultivos contínuos de longa duração em reatores de bancada (quimiostatos), no intuito de selecionar variantes da levedura engenheirada mais tolerantes ao geraniol. Portanto, o projeto logrará processo completo, desde construção de linhagens até otimização de cultivo e caracterização de fisiologia, integrando capacitação de alunos e técnicas atualmente relevantes nas áreas de engenharia metabólica e de bioprocessos em um tema de importância científica e socioeconômica.

Esta proposta visa conhecer, preservar e utilizar de forma sustentável as leveduras da biodiversidade brasileira. Estes microrganismos são os mais utilizados pelo homem em biotecnologia, com receitas de trilhões de doláres anuais. A fermentação de açúcares a etanol e outros produtos do metabolismo faz das leveduras verdadeiras biofábricas para gerar bioinovação. Amazônia, Cerrado e Mata Atlântica são hotspots de biodiversidade, mas sofrem intensa ação antrópica ameaçando o conhecimento e conservação destes biomas. A Caatinga, as Florestas de Araucária e os campos têm a diversidade microbiana pouco explorada. Pretende-se realizar o maior inventário de leveduras nestes biomas, com foco na descrição de novas espécies, a preservação ex-situ, o conhecimento do perfil metabólico e genético destes microrganismos, e a utilização dos mesmos para gerar bioinovação. Pretende-se acrescentar cerca de 10 de novas espécies ao número conhecido mundialmente. As espécies novas terão os genomas sequenciados e depositados em bancos de dados públicos. Os isolados de leveduras terão o perfil metabólico determinado, focando em características metabólicas de interesse, por meio de testes automatizados feitos em larga escala (high-throughput screening). Os isolados serão testados principalmente quanto à produção de enzimas, biosurfactantes, xilitol, bioetanol, produção de aromas, biopigmentos, óleos microbianos e fonte de ração animal. Isolados selecionados serão modificados geneticamente. e testados em biorreatores visando aplicação em biorrefinarias. Linhagens produtoras de aromas únicos serão testadas na produção de cervejas e kombucha, bebidas cujo número de produtores tem aumentado de maneira exponencial. Pretende-se assim, a obtenção de produtos e processos que serão disponibilizados para o setor produtivo. Os inventários de biodiversidade, com mapas de distribuição das espécies nos biomas, poderão auxiliar nas políticas para a preservação da biodiversidade microbiana brasileira.

A produção de biocombustíveis a partir de resíduos lignocelulósicos (LC) poderá abastecer a matriz energética num futuro próximo. Leveduras irão desempenhar um papel importante como plataformas microbianas para os processos de conversão de açúcares em etanol combustível, bem como em outras moléculas de interesse industrial. A fermentação de hidrolisados LC englobam muitos desafios científicos e tecnológicos. Os processos de pré-tratamento geram uma variedade de moléculas (derivados furânicos, compostos fenólicos e ácidos orgânicos) que atuam como inibidores do metabolismo microbiano, e assim, reduzem sobremaneira a eficiência da fermentação. Neste contexto, a presente proposta de pesquisa tem como objetivo investigar o efeito de inibidores lignocelulósicos em leveduras industriais da produção de etanol, bem como em bactérias láticas contaminantes, normalmente presentes em processos fermentativos industriais. Para tanto, uma caracterização fisiológica quantitativa e bem definida, na presença de inibidores lignocelulósicos, será realizada. Como complementação a esse objetivo principal, buscaremos obter linhagens de levedura mais tolerantes aos inibidores por meio de estratégias de engenharia evolutiva (EE). As estratégias de EE serão buscadas por bateladas sequenciais e em cultivos prolongados em regime contínuo. Em última análise, pretendemos compreender como as diferentes linhagens de levedura e de bactérias contaminantes respondem aos inibidores lignocelulósicos e, se possível, obter linhagens mais tolerantes aos mesmos através do emprego de engenharia evolutiva.

O presente projeto busca linhagens de Saccharomyces cerevisiae com tolerância suficiente para fermentar um substrato lignocelulósico, formulado com hidrolisado de bagaço e melaço de cana, empregando-se o processo de fermentação batelada-alimentada com reciclo de células. Tal processo é o mais difundido na produção do etanol 1G no Brasil, utilizando alta densidade de células no reator, o que resulta em fermentações rápidas (6 a 8 horas) com elevado rendimento em etanol (90-92%) devido à baixa taxa de propagação da levedura. A alternativa de se utilizar esta mesma configuração para o etanol 2G é bastante atraente do ponto de vista econômico, pois utiliza os mesmos equipamentos (dornas, centrifugas, unidade de destilação, etc.) e pessoal treinado neste processo, além de que o bagaço e o melaço de cana já estão alocados. No entanto esta modalidade de fermentação ainda não foi implantada, devido a um grande desafio que é a disponibilidade de linhagens de Saccharomyces com um perfil de tolerância múltipla aos vários fatores estressantes dessa fermentação, com inibidores oriundos das duas fontes de açúcar (hidrolisado e melaço), agravado ainda pela condição de reciclagem da biomassa, impondo à mesma célula fermentações sequenciais. Estudos prévios em nosso laboratório demonstraram que as linhagens industriais disponíveis e mais robustas, nomeadamente CAT-1, PE-2 e SA-1, não suportam fermentações do substrato acima mencionado em condições de reciclo de células. Para se atingir o objetivo proposto, pretende-se inicialmente selecionar indivíduos com a tolerância desejada a partir de uma coleção com cerca de 500 linhagens indígenas já resgatadas de destilarias brasileiras. As linhagens mais tolerantes serão submetidas à esporulação e cruzamentos (massal e direcionados), buscando-se por linhagens híbridas ainda mais tolerantes que as parentais. Após seleção, estas linhagens serão geneticamente manipuladas utilizando o sistema CRISPR/Cas9, no intuito de torná-las capazes de converter adequadamente a xilose em etanol. Além da habilidade de fermentar a xilose, entende-se que tais cepas poderão também ser utilizadas como plataformas para o desenvolvimento de linhagens aplicadas à produção de outros produtos de maior valor agregado

Os desafios socioeconômicos e ambientais associados com o uso de combustíveis fósseis, com o aumento na demanda energética global e com os elevados níveis de poluentes do ar e da água, podem ser enfrentados através do desenvolvimento da produção sustentável de energia limpa e químicos. A integração da biorremediação e produção de biomassa renovável baseado no uso de microalgas aparece como um caminho sustentável promissor para a produção de bioenergia e químicos. Mesmo com os avanços no cultivo de microalgas, a geração de biomassa para produção massiva de combustíveis e químicos é ainda limitante. Portanto, uma melhor compreensão é necessária sobre como as mudanças nos fatores ambientais, tais como fonte de carbono, nutrientes e luz afetam a composição e acumulação de biomassa microalgal. Estímulos externos abióticos (ex. temperatura, luminosidade, CO2) podem induzir alterações fenotípicas que são controladas por mudanças nas redes de regulação gênica (ex., ajustes nos perfis transcricionais, reajuste de redes). A identificação decomponente das redes de regulação gênica (GRNs), incluindo elementos regulatórios cis e trans, e a concomitante quantificação de transcritos gênicos, proteínas e metabólitos com resolução temporal é de crucial importância para compreendermos as reais estruturas das redes regulatórias e seu comportamento dinâmico. Portanto, na presente proposta, objetivamos gerar e integrar dados multiômicos em uma abordagem com resolução temporal de biologia de sistemas para elucidar, em microalgas Chlamydomonas reinhardtii, GRNsenvolvidas no controle de respostas celulares a privação de nitrogênio e estresse salino sob condições de fotoautotrofia e mixotrofia. Tal abordagem nos permitirá desvendar as subredes biológicas e regulatórias responsáveis pelo controle da produção de biomassa e pelo acúmulo de químicos de interesse biotecnológico. Os dados gerados serão úteis para o modelamento teórico e simulações e servirão como uma base para o desenvolvimento de aplicações de engenharia metabólica e biologia sintética em microalgas, com possibilidades futuras de extensão a linhagens de plantas terrestres e leveduras.

A consciência das ameaças ambientais devido do aumento das demandas para a energia e da diminuição dos recursos energéticos obtidos de fontes fósseis tem levado à pesquisa de alternativas de energia, mais limpas e renováveis. A lignocelulose é um recurso renovável abundante e que pode ser um excelente substrato para a produção de alcoóis de segunda geração, tais como etanol, butanol. Além disso, esse material pode ser utilizado para a síntese de polímeros importantes em diversos segmentos industriais. A complexidade da lignocelulose é um grande desafio para a utilização dela na produção de alcoóis ou outro composto. A utilização da biomassa para a produção de biocombustíveis a partir de resíduos vegetais requer várias etapas o que aumenta os custos da produção. Uma das etapas mais caras é a hidrólise enzimática da lignocelulose para liberação de açúcares capazes de serem usados no processo fermentativo. A hidrólise desse substrato requer a ação conjunta de vários tipos de enzimas. As enzimas de conversão de biomassa trabalham em conjunto para se beneficiar de sinergismo entre suas especificidades (para diferentes componentes da lignocelulose) e da atenuação da sua inibição pelo diferentes produtos de degradação.Muitos organismos possuem enzimas que permitem a quebra da biomassa e utilização de seus açúcares. Muitas destas enzimas para agir são secretadas isoladamente ou formam complexos. Considerando os aspectos relacionados às dificuldades de degradação enzimática da lignocelulose iniciamos estudos utilizando consórcios bacterianos para a execução dessas atividades. Esses consórcios poderiam promover com maior eficiência a degradação da biomassa pela ação conjunta de diversos microrganismos, ou então fornecer informações e genes que poderiam ser utilizados para a síntese do conjunto de enzimas que atuam na quebra das moléculas de celulose, hemicelulose e na degradação da lignina.Assim, em um projeto anterior (Fapesp 2010/17520-9) foram isolados consórcios bacterianos com características importantes relacionadas a degradação de lignocelulose. Esses consórcios sobrevivem em meio de cultivo contendo como fonte de carbono apenas resíduo de lignocelulose (bagaço de cana de açúcar, palha de milho ou casca de amendoim). Além disso, os consórcios em meio com esses resíduos liberam glicose em concentrações de 50 a 200 µmol/mL.Estudos dos componentes dos consórcios mostraram que existe no sobrenadante dos meios de cultivo aproximadamente 50 organismos. Conhece-se pela literatura que a degradação de celulose pode ser feita mediante contato de enzimas na superfície celular com as fibras, portanto ensaios precisam ser realizados pesquisando-se quais organismos do consorcio possam estar aderidos a esse material atuando na liberação de açúcares da biomassa. Do mesmo modo que precisa se avaliar a interação entre os microrganismos totais do consorcio, qual a relação entre eles que está permitindo a sua sobrevivência apenas em meio com resíduo lignocelulósico e qual a possibilidade de se usar esse consorcio para facilitar a degradação e utilização da lignocelulose em processos biotecnológicos.Considerando as características dos consórcios bacterianos isolados e os resultados preliminares observados esse projeto pretende definir e explorar as interações bacterianas no consórcio degradador de lignocelulose, com o objetivo de se utilizar esses microrganismos nos processos de desconstrução do material lignocelulolítico, assim como seus isolados ou ainda enzimas/genes específicos encontrados. Tais abordagens são importantes decorrentes da necessidade de obtenção de produtos com menor preço e mais adequados à tecnologia de produção de etanol a partir da biomassa, bem como aumentar a eficiência do processo de desconstrução do material lignocelulolítico para sua utilização em outros processos biotecnológicos dentro do conceito atual de biorrefinarias.

"The Sustainable Gas Pathways for Brazil: from microcosm to macrocosm" project will develop a range of data sets that may be on interest to other researchers and organizations across a variety of disciplines. The principal investigators are committed to contributing towards an academic knowledge-sharing environment and will endeavour to produce transparent and academically rigorous datasets and project outputs. The datasets that will arise from this project form two main categories, as follows. At the microcosm level, laboratory experiments and desktop process modelling will produce techno-economic data (process dynamics of bioethanol production, biochemical performances of dry anaerobic digester using sugarcane wastes, economic and environmental Impacts of integrated sugarcane-ethanol-biogas production processes), whilst a number of semi-structured interviews will be carried out to elicit key socio-economic impact around biogas industry. At the macrocosm level, a broader picture of the energy system in Brazil is created, covering potential pathways of gas infrastructure, the electricity system, and the broader national energy system (energy demand projections for residential, commercial, industry and transport sector, Infrastructure development pathways to serve future energy demands; model predictions for electricity and gas characteristics inducing seasonal variations; land use, carbon sequestration, water quality and drinking water and ecological impacts of biogas production)

Biofuels are considered an alternative for fossil fuels, and ethanol is the most important commodity from this industry. Brazil is the second largest world ethanol producer, with an annual production of ca. 30 billion litres in 2015. The Brazilian ethanol production process is based on the use of readily fermentable sugars from sugarcane plants, by selected industrial Saccharomyces cerevisiae strains, and is considered a hallmark for industrial biotechnology. Conducted under non-aseptic conditions, contaminations are commonplace in such processes. These microorganisms enter the process mainly via the non-sterile broth and remain throughout the entire crop season (ca. 300 days), due to the utilized cell recycling process. Most common contaminants are bacteria (both Gram + and -) and yeasts, being lactic acid bacteria (LAB) the most prominent and troublesome ones. These contaminants, most often, have a negative impact in the process performance by competing for the carbon source. Mills respond to this problem with chronical treatments (e.g. biomass wash with sulfuric acid) and acute treatments (e.g. antibiotics, chlorine dioxide, etc.), but it is not rare to observe the emergence of contamination outbreaks. Part of this inefficiency comes from the limited knowledge on the microbial communities of industrial fermenters in particular with regards to population dynamics. In this project we shall study the Brazilian sugar cane ethanol fermentation microbiome and investigate the community dynamics and its underlying microbial interactions. The main objectives of this projects are linking microbiome perturbations to plant process performance and identifying the most detrimental contaminant species for the process, supporting the development of novel microbial control strategies.

Neste projeto de pesquisa as leveduras serão modificadas para adquirir capacidade de converter diretamente açúcares oligoméricos em bioprodutos. Uma outra classe de organismos, Geobacillus extensivamente estudada pelo grupo da Universidade de Bath, possui habilidade de transportar e utilizar estes açúcares oligoméricos. Assim, neste projeto de pesquisa iremos utilizar uma cepa de Geobacillus para comparar o desempenho com as leveduras recombinantes, otimizadas para a mesma função. Três matérias-primas (MP) lignocelulósicas diferentes, todas com potencial para serem usadas na obtenção de biocombustíveis e de produtos químicos: sustentáveis serão estudadas: a palha de cana (geralmente deixada no campo após a colheita), o Miscanthus - cultivado no Reino Unido para co-incineração e geração de energia e os resíduos de florestas de eucaliptos, muito abundantes no Brasil. O uso das 3 MP lignocelulósicas representa uma nova e original oportunidade para se avaliar os mesmos. Parte da equipe dos dois países deverá trabalhar no desenvolvimento de métodos para converter as matérias primas em oligossacarídeos para utilização pelas novas cepas desenhadas de leveduras. Pré-tratamento menos drásticos, seletivos e específicos bem como o uso de enzimas escolhidas para a geração dos oligossacarídeos serão desenvolvidos no grupo de trabalho 1. Outro grupo de trabalho irá se concentrar na produção das enzimas necessárias para a geração dos oligossacarídeos derivados das MPs. Um terceiro grupo irá projetar as cepas de leveduras para utilizarem os oligossacarídeos derivado da lignocelulose. Visando aumentar ainda mais a eficiência energética das MPs nas novas usinas de conversão de lignocelulose, pretende se obter ainda novos produtos químicos e biogás a partir dos efluentes, de vinhaça e da hemicelulose hidrolisados. Assim, será desenvolvido a integração da digestão anaeróbica (AD) para o processo integrado de Biorrefinaria de LC. AD e fermentação com culturas mistas podem melhorar a relação energética do bioprocesso com a produção de biogás e fertilizantes como produtos secundários. Além disso, serão necessários estudos de sustentabilidade e analises técnico econômicas para garantir que os resultados deste trabalho alcancem relevante impacto para os setores industriais aonde as MP se originam. Assim, o quarto grupo de trabalho, especializado nestes dois amplos temas de pesquisa e em LCA deverá garantir a escolha das matérias-primas, as quantidades a serem coletadas, a localização das coletas bem como as rotas industriais de obtenção dos produtos. Otimização das rotas de obtenção propostas pelo projeto deverá refletir positivamente no projeto bem como identificar os pontos para serem alterados/modificados.

The global aim of this project is to improve yeast for its use in biorefineries. First-generation bioethanol production in Brazil, in which sucrose from sugar-cane is converted into ethanol by Saccharomyces cerevisiae with high yields, was chosen as a first case-study. In a collaboration with Prof. Boris Stambuk (Federal University of Santa Catarina, Brazil), we first applied a metabolic engineering strategy that switched the mode of sucrose utilization by S. cerevisiae. A strain was constructed by eliminating the extracellular hydrolysis of sucrose, forcing the cells to transport this sugar actively into the cells via symport, causing extra ATP expenditure to extrude protons from the cells back to the culture medium, in order to avoid acidification of the citoplasm. This energy drain forces the cells to produce more ATP, which, under anaerobiosis, is coupled to ethanol formation. This strategy alone led to a small improvement in the ethanol yield on sucrose. By subsequently applying an evolutionary engineering strategy to this strain, we managed to increase the ethanol yield on sucrose by 10 %, when compared to the parental strain, which is a dramatic improvement, considering that ethanol production currently occurs at the tens of billions of liters per year scale

Nesta linha de pesquisa, iniciada em 2007 e coordenada pelo Prof. Dr. Andreas Karoly Gombert, vários aspectos da levedura Saccharomyces cerevisiae estão sendo estudados. O foco principal é estudar as linhagens da produção de bioetanol, procurando caracterizar sua fisiologia sob diferentes condições e os aspectos moleculares envolvidos na alta tolerância que estas linhagens apresentam, quando expostas a diferentes situações de estresse. Finalmente, estudos de engenharia evolutiva e de engenharia metabólica também são realizados, com o objetivo de obter linhagens com melhor desempenho fermentativo, visando tanto a produção de bioetanol de primeira geração (a partir de sacarose), como a de segunda geração (a partir de lignocelulósicos). Atualmente, o Prof. Andreas coordena um projeto de pesquisa financiado pela FAPESP neste tema, dentro do programa BIOEN. Colabora com pesquisadores de outras universidades, que também coordenam projetos com financiamento nesta linha

During brewing fermentation yeasts produce a variety of flavour-active compounds, including esters, higher alcohols and diketones. Production of these compounds is largely affected by key process variables commonly used to increase fermentation productivity, such as wort original gravity (OG), temperature and yeast pitching rate. The aim of the present study was to investigate how some major process variables affect flavour-active compounds formation during brewing yeast fermentation. Therefore, using response surface methodology, statistically designed fermentation trials were performed and the formation of major flavour-active compounds was fitted in linear or quadratic response surface models.

O ecossistema marinho vem se destacando como uma fonte promissora de produtos naturais com potencial terapêutico. Vários aspectos contribuem para o crescente interesse na área, principalmente sua grande biodiversidade. No que diz respeito às propriedades terapêuticas dos produtos naturais de origem marinha, a citotoxicidade parece ser a atividade mais comum dos compostos isolados. Dentre as inúmeras fontes pesquisadas, enquadram-se as ascídias, invertebrados marinhos dos quais muitas substâncias com comprovada atividade citotóxica já foram isoladas, sendo que algumas já alcançaram os testes clínicos como possíveis agentes anti-tumorais. O presente projeto teve como objetivo o fracionamento biomonitorado e o isolamento dos constituintes majoritários do extrato metanólico da ascídia Eudistoma vannamei (Polycitoridae), o qual já havia demonstrado elevada atividade citotóxica em linhagens de células tumorais humanas. Exemplares da ascídia E. vannamei foram coletados no litoral do estado do Ceará. O extrato hidroalcoólico foi fracionado por diferentes técnicas cromatográficas. As 20 frações, obtidas da fase diclorometânica, foram avaliadas quanto ao seu potencial citotóxico, pelo método colorimétrico do MTT. As frações ativas tiveram seus constituintes químicos analisados por métodos cromatográficos e espectroscópicos

No referido projeto buscou-se aumentar o teor de proteína em Saccharomyces cerevisiae mediante um procedimento para promover a metabolização anaeróbica dos carboidratos de reserva, glicogênio e trealose.Tais reservas representam até 30% da biomassa seca da levedura e a sua remoção, mediante processo fermentativo, não somente levaria a um aumento relativo no teor protéico, favorecendo a comercialização da levedura seca, como também propiciaria uma formação adicional de etanol. Para tal a linhagem PE-2 de Saccharomyces cerevisiae foi submetida a um estresse térmico (40°C) na presença e ausência de sulfito (4mM), sendo monitorados diversos parâmetros (formações de etanol e biomassa, viabilidade celular e teores celulares de trealose, glicogênio e proteína). Verificou-se que o sulfito exerceu um efeito estressante adicional durante o tratamento térmico, promovendo uma degradação mais rápida e mais completa dos carboidratos de reserva, especialmente trealose, concomitantemente com elevações nos teores de etanol no meio e proteína na levedura